Dissertação Vanessa Miranda.pdf

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS
FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS

VANESSA MIRANDA PEREIRA FAUSTO

Biomarcadores metabolômicos associados ao risco cardiovascular aumentado em
pacientes com Lúpus Eritematoso Sistêmico

Maceió
2023

VANESSA MIRANDA PEREIRA FAUSTO

Biomarcadores metabolômicos associados ao risco cardiovascular aumentado em
pacientes com Lúpus Eritematoso Sistêmico
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação
em Ciências Médicas da Universidade Federal de
Alagoas, como parte das exigências para a obtenção do
título de Mestre em Ciências Médicas.
Área de Concentração: Doenças autoimunes
Orientador: Prof. Dr. Thiago Sotero Fragoso

Maceió
2023

FOLHA DE APROVAÇÃO

VANESSA MIRANDA PEREIRA FAUSTO

Biomarcadores metabolômicos associados ao risco cardiovascular aumentado em
pacientes com Lúpus Eritematoso Sistêmico

Dissertação submetida ao corpo docente do
Programa de Pós-graduação em Ciências
Médicas da Universidade Federal de Alagoas e
aprovada em (data).

_______________________________________
Prof. Dr. Thiago Sotero Fragoso
Programa de Pós-graduação em Ciências Médicas (Universidade Federal de Alagoas)
Orientador
Banca Examinadora:

_______________________________________
Prof. Dr. Rodrigo Peixoto Campos
Universidade Federal de Alagoas
Examinador interno

_______________________________________
Profa. Dra. Auxiliadora Daminanne Pereira Vieira da Costa e Silva
Universidade Federal de Alagoas
Examinadora interna

_________________________________________
Prof. Dr. Antônio Luíz Ribeiro Boechat
Universidade Federal do Amazonas
Examinador externo

AGRADECIMENTOS
A Deus, por ter me permitido saúde e determinação para este trabalho.
Ao meu esposo, Lucyano, por ser companheiro, me apoiar e estimular em minhas
decisões.
Aos meus filhos, Lavínia e Vitor, por serem a razão da minha vida e entenderem meus
momentos de ausência.
Aos meus pais, Osmar e Graça, que, mesmo distantes, se fazem presentes em todos os
momentos, pelos grandes ensinamentos e por serem a minha base.
Aos meus irmãos, Fernanda, Luísa e Tiago, que sempre acreditaram em mim.
Ao meu orientador, Dr. Thiago Fragoso, que sempre me incentivou a fazer o mestrado
e proporcionou essa oportunidade, acreditando no meu crescimento profissional.
A Jeferson, Ana Catarina, Thiago Aquino e Maiara, que fazem parte do Instituto de
Química da UFAL e proporcionaram a análise metabolômica de nossos pacientes.
A Jaciel Clementino e Jéssica Mecenas, que tanto me ajudaram nos agendamentos e
coletas dos pacientes, além de tornarem nossos dias de pesquisa mais leves.
A Larissa Pinto, pela sua disponibilidade em sempre esclarecer dúvidas sobre o projeto
e mestrado.
Ao Hospital Universitário Professor Alberto Antunes e à Universidade Federal de
Alagoas, pela oportunidade que tenho de trabalhar como reumatologista em um serviço de alta
complexidade do estado e fazer o mestrado nessas instituições.
Aos pacientes, que em seu momento de doença e maior fragilidade se prontificaram a
participar da pesquisa, espero fornecer o retorno que eles merecem e precisam.
À agora reumatologista Juliana Leal, residente durante um período do mestrado, e ao
residente Rafael Wanderley, que foram bastante compreensivos nas adaptações que precisei
fazer durante a realização deste projeto.
Enfim, muito grata a todos que, direta ou indiretamente, ajudaram na minha caminhada
em busca do título de mestre.

RESUMO
INTRODUÇÃO: Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) é uma doença inflamatória crônica,
imunomediada, em que a alteração da regulação imune e a presença de autoanticorpos resultam
em acometimento de múltiplos órgãos. Além disso, os pacientes com LES apresentam risco
cardiovascular (RCV) aumentado, e os métodos existentes de rastreio do RCV não são
suficientes. A metabolômica permite a detecção e a quantificação de moléculas de baixo peso
molecular que ocorrem nos sistemas biológicos, que podem se tornar biomarcadores de
doenças. OBJETIVOS: Avaliar o perfil metabolômico que pode estar associado ao RCV
aumentado nessa população. MÉTODOS: Estudo transversal em indivíduos com LES com
idade maior ou igual a 20 anos do serviço de Reumatologia do Hospital Universitário Professor
Alberto Antunes (Hupaa) – Universidade Federal de Alagoas (Ufal). Os controles foram
pareados por idade e não tinham doença autoimune. Foram avaliados os fatores de risco para
doença cardiovascular (DCV), como hipertensão arterial sistêmica (HAS), diabetes mellitus
(DM), tabagismo, dislipidemia e, juntamente com exames laboratoriais, foi calculado o RCV
pelo escore de Framingham modificado (x2). A análise metabolômica do plasma sanguíneo foi
realizada nos pacientes e controles. A discriminação de metabólitos entre os grupos foi feita
pelo OPLS-DA (gráfico de mínimos quadrados ortogonais), e várias permutações foram
definidas como 2000 para avaliar o modelo. Os metabólitos importantes foram selecionados
pelo limiar do VIP baseado no gráfico VIP (gráfico de importância variável) ≥ 1,5. Foram
aplicados o índice de atividade do Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index
(SLEDAI) e o índice de dano do Systemic Lupus International Collaborating Clinics (SLICC).
RESULTADOS: A amostra foi composta de 79 pacientes lúpicos e 45 controles, e 21 pacientes
com LES foram classificados como intermediário/alto RCV. O OPLS mostrou que o LES foi
discriminado dos controles, com Q 2 0.778, R2Y 0,901 e p < 0,05, porém o OPLS não
discriminou pacientes com LES e intermediário/alto RCV dos pacientes com baixo RCV, com
Q 2 - 0.00648 e p = 0,073, R2Y 0,266 e p = 0,055. A variável A VIP (variável de projeção
importante) encontrou os metabólitos glutationa, tirosina, fenilalanina, alanina, metil-histidina,
glutamina e histidina, diferentes entre os pacientes com LES e controles, que apresentaram o
VIP ≥ 1,5. CONCLUSÃO: Encontramos perfil metabolômico discriminante entre LES e
controle, porém não encontramos entre os pacientes com intermediário/alto RCV e baixo RCV,
provavelmente devido ao tamanho da amostra. Os metabólitos podem se tornar biomarcadores
no futuro, porém mais estudos são necessários para validar esses achados devido aos múltiplos
fatores que podem influenciar. Estudos prospectivos também seriam relevantes para analisar o
desfecho cardiovascular.
Palavras-chave: lúpus eritematoso sistêmico; metabolômica; risco cardiovascular.

ABSTRACT
INTRODUCTION: Systemic Lupus Erythematosus (SLE) is a chronic, immune-mediated
inflammatory disease in which altered immune regulation and the presence of autoantibodies
result in the involvement of multiple organs. Furthermore, patients with SLE are at increased
cardiovascular risk (CVR) and existing methods of screening for CVR are not sufficient.
Metabolomics allows the detection and quantification of low molecular weight manifestations
that occur in biological systems, which can become biomarkers of diseases. OBJECTIVES:
To assess the metabolic profile that may be associated with increased RCV in this population.
METHODS: Cross-sectional study of individuals with SLE aged 20 years or older at the
Rheumatology service of the Professor Alberto Antunes University Hospital (Hupaa) – Federal
University of Alagoas (Ufal). Controls were age-matched and had no autoimmune disease. the
RCV by the modified Framingham score (x2). Metabolomic analysis of blood plasma was
performed in patients and controls. The distinction of metabolites between groups was made by
OPLS-DA (orthogonal least squares plot), and various permutations were defined as 2000 to
evaluate the model. Important metabolites were selected by VIP threshold based on VIP plot
(Importance plot variable) ≥ 1.5. The Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index
(SLEDAI) and the Systemic Lupus International Collaboration Clinics (SLICC) damage index
were applied. RESULTS: The sample consisted of 79 SLE patients and 45 controls, where 21
SLE patients were classified as intermediate/high RCV. OPLS showed that SLE was
discriminated from controls, with Q 2 0.778, R2Y 0.901 and p < 0.05, however OPLS does not
discriminate patients with SLE and level/high CVR from patients with low CVR, with Q 2 0.00648 and p = 0.073, R2Y 0.266 and p = 0.055. Variable A VIP (important projection
variable) found the metabolites glutathione, tyrosine, phenylalanine, alanine, methylhistidine,
glutamine and histidine different between patients with SLE and controls, who demonstrated
VIP ≥ 1.5. CONCLUSION: We found a discriminating metabolomic profile between SLE and
control, however, we did not find it among patients with intermediate/high RCV and low RCV,
probably due to the sample size. Metabolites may become biomarkers in the future, but more
studies are needed to validate these findings due to multiple factors that may influence.
Prospective studies would also be relevant to analyze the cardiovascular outcome.
Keywords: systemic lupus erythematosus; metabolomics; cardiovascular risk.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ACR

American College of Rheumatology

Ala

Alanina

DCV

Doença cardiovascular

Diabetes Mellitus

FRS

Score de Framingham

Gln

Glutamina

GSH

Glutationa

HAS

Hipertensão Arterial Sistêmica

His

Histidina

Hupaa

Hospital Universitário Professor Alberto Antunes

IMC

Índice de Massa Corporal

LES

Lúpus Eritematoso Sistêmico

m-His

Metil-histidina

OPLS-DA

Gráfico de mínimos quadrados ortogonais

Phe

Fenilalanina

RCV

Risco cardiovascular

RNM

Ressonância Magnética Nuclear

SLEDAI

Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index

SLICC

Systemic Lupus International Collaborating Clinics

Ufal

Universidade Federal de Alagoas

TCLE

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

Tyr

Tirosina

VIP

Gráfico de importância variável

SUMÁRIO
1

INTRODUÇÃO

JUSTIFICATIVA

OBJETIVOS

3.1

Objetivo geral

3.2

Objetivos específicos

REVISÃO DE LITERATURA

4.1

Lúpus Eritematoso Sistêmico

4.2

Risco cardiovascular e Lúpus Eritematoso Sistêmico

4.3

Identificação de biomarcadores através da metabolômica

METODOLOGIA

5.1

Tipo de estudo e amostra

5.2

Aspectos éticos

5.3

Coleta de dados

5.3.1

Dados clínicos e sociodemográficos

5.3.2

Exames laboratoriais

5.3.3

Avaliação do risco cardiovascular

5.3.4

Análise metabolômica

5.3.5

Análise de dados

PRODUTO

CONCLUSÕES

LIMITAÇÕES

REFERÊNCIAS

APÊNDICE A – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E
ESCLARECIDO
APÊNDICE B – FORMULÁRIO PARA COLETA DE DADOS
CLÍNICOS E SOCIODEMOGRÁFICOS

APÊNDICE C – SLEDAI-2K MODIFICADO

APÊNDICE D – SLICC

ANEXO A – PARECER CONSUBSTANCIADO DO CEP

1 INTRODUÇÃO
O Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) é uma doença autoimune complexa,
caracterizada por alteração da regulação imune, inflamação crônica e acometimento de
múltiplos órgãos (ROBINSON et al., 2021). A produção e eliminação deficiente de anticorpos,
com deposição de imunocomplexos, complementos e ativação de citocinas contribuem para as
manifestações clínicas, que vão desde fadiga leve e dores articulares até acometimento grave e
em órgãos com ameaça à vida (KIRIAKIDOU et al., 2013). As manifestações clínicas mais
comuns são: artrite (64-91%), lesão cutânea (64-91%), envolvimento renal (28-73%),
fenômeno de Raynaud (24-61%), envolvimento do sistema nervoso central (11-49%) e serosite
(12-36%) (CERVERA et al., 1993). Acomete predominantemente mulheres (relação de
mulheres para homens de 9:1) (COELEWIJ et al., 2021).
O prognóstico de pacientes com LES tem melhorado nas últimas décadas,
principalmente durante os primeiros anos depois do diagnóstico. Entretanto, em longa
perspectiva, a mortalidade é aumentada se comparada à esperada (BJÖRNÅDAL et al., 2004).
Desde os anos 1970-1990, houve uma tendência de queda na mortalidade por LES; a sobrevida
em 5 anos dos pacientes com LES foi de 50%, na década de 1950, e de 96% na década de 2000,
e os avanços nos protocolos de tratamento têm proporcionado essa mudança. No entanto, dados
contemporâneos sugerem que a mortalidade por LES por todas as causas não melhorou nas
últimas duas décadas. Houve mudanças na mortalidade ao longo da doença, separando o LES
com doença precoce (<7 anos) do tardio (7-14 anos) (OCAMPO-PIRAQUIVE et al., 2018). É
sabido que as causas de morte na doença inicial são relacionadas ao envolvimento grave de
órgãos, como os rins, e a infecções decorrentes do tratamento com imunossupressão. Todavia,
as doenças cardiovasculares (angina, infarto agudo do miocárdio, doença arterial periférica,
acidente vascular cerebral e falência cardíaca) têm sido registradas como sendo a mais frequente
causa de morte no estágio final da doença (BJÖRNÅDAL et al., 2004).
O LES é associado com aterosclerose acelerada (MASSOM et al., 2019), e o paciente
lúpico tem 5 a 10 vezes mais risco de desenvolver doença cardiovascular se comparado a
pessoas saudáveis do mesmo sexo e idade (COELEWIJ et al., 2021).
A metabolômica é uma área emergente que utiliza técnicas de bioinformática e
analíticas avançadas e, através destas, mede produtos de expressão, denominados metabólitos
(BUJAK et al., 2015). O LES é reconhecido como um fator de risco independente para DCV,
e os scores de risco validados não contemplam a doença (SIVAKUMARAN et al., 2021). Dessa
maneira, a metabolômica poderia auxiliar nessa estratificação.

2 JUSTIFICATIVA

O LES está associado a uma maior mortalidade se comparado a outras causas para a
população do mesmo sexo e idade, e o avanço no tratamento tem prolongado a vida dos
pacientes e modificado a causa de óbito. Há uma distribuição bimodal da mortalidade da
doença: de forma prematura, por atividade da doença ou infecção, e tardia, por complicações
da DCV. A DCV é a principal etiologia de morte em pacientes com LES de longa duração, e
prevenível quando o tratamento é estabelecido em tempo hábil. Por essas razões, é necessária
uma metodologia de rastreamento do RCV nessa população específica. Atualmente, as medidas
de RCV são adaptadas para pacientes com LES e carecem de maior especificidade para doença.
A identificação de biomarcadores a partir da análise metabolômica poderia auxiliar no
desenvolvimento de novos scores de rastreamento, tendo sua aplicabilidade como preditores de
RCV em diferentes fases da doença. Dessa maneira, protocolos de intervenção mais precoces,
com o uso de tratamento preventivo, reduziriam o risco de óbito por doença cardiovascular,
aumentando a sobrevida de pacientes com LES.

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral
 Analisar o perfil de metabólitos do plasma de pacientes com LES e comparar aqueles
com alto/intermediário com os de baixo RCV.

3.2 Objetivos específicos


Analisar o perfil metabólico através da ressonância magnética nuclear de prótons nos
pacientes com LES e controles;



Estimar o RCV dos pacientes com LES e controles;



Verificar o perfil clínico, epidemiológico e prevalência das comorbidades
identificadas.

4 REVISÃO DE LITERATURA

4.1 Lúpus Eritematoso Sistêmico
O LES é uma doença autoimune sistêmica crônica com uma grande variedade de
manifestações clínicas e uma complexa patogênese (ZUCCHI et al., 2019). Há fatores
genéticos, ambientais, imunológicos, étnicos, hormonais e epigenéticos que interagem para a
manifestação da doença, e vários pontos-chave dessas conexões multifatoriais ainda não estão
claros (TSOKOS, 2011; ZUCCHI et al., 2022). É uma doença que afeta mais mulheres jovens
e populações não brancas (LISNEVSKAIA; MURPHY; ISENBERG, 2014; DURCAN et al.,
2019). A média de idade de diagnóstico para mulheres brancas é entre 37 e 50 anos; em homens
brancos, entre 50 e 59 anos; em mulheres negras, entre 15 e 44 anos; em homens negros, entre
45 e 64 anos (RUS; MAURY; HOCHBERG, 2002). É uma doença que pode afetar qualquer
órgão ou sistema e tem uma ampla variedade de manifestações, que vão desde uma doença leve
até uma doença com manifestações catastróficas e que ameaçam a vida (TSOKOS et al., 2016).
Globalmente, estima-se que a prevalência do LES em adultos varia de 30 a 150 por
100.000; a incidência varia de 2,2 a 23,1 por 100.000 (DURCAN; O’DWYER; PETRI, 2019).
Não há registros da prevalência de LES no Brasil. Devemos lembrar que se trata de um país de
tamanho continental, com variações geográficas que influenciam nas manifestações e também
nas notificações desses pacientes.
O LES tem sido reconhecido há muito tempo como tendo um importante componente
hereditário (KUO et al., 2015; ALARCÓN-SEGOVIA et al., 2005). Numerosos estudos de
associação de genoma têm identificado mais de 100 predisposições em loci gênicos como
polimorfismos. Os fatores genéticos que conferem maior risco são deficiências de C1q, C4A e
B, C2, a presença de um gene TREX1 e STING mutante e HLA-DRB1*0301 E HLADRB1*1501 (CROW et al., 2015; LO, 2016; AGGARWAL et al., 2010). No entanto, essa
informação genética é responsável por apenas 28% da suscetibilidade ao LES, sugerindo um
grande componente de influências ambientais, hormonais e epigenéticas, ou genes ainda não
descobertos. Novas evidências sugerem que a prevalência feminina no LES está,
provavelmente, relacionada a modificações epigeneticamente induzidas na expressão de genes
de imunidade ligados ao X, especialmente na autoimunidade impulsionada por células B
(ZUCCHI et al., 2022).
Os fatores hormonais também explicam a predominância feminina e a média de idade
de manifestação. A função imunorreguladora do estradiol, da testosterona, da progesterona, da
desidroepiandrosterona (DHEA) e dos hormônios hipofisários, incluindo a prolactina, tem

apoiado a hipótese de que eles modulam a incidência e a gravidade do LES (LI; MAY;
MCMURRAY, 2005). Pode estimular a via do IFN tipo 1, enquanto a progesterona pode inibila, sugerindo que um equilíbrio dos dois pode ser importante.
Um dos principais fatores ambientais envolvidos na doença são infecções virais, que
podem estimular células antígeno – específicas na rede imunológica. Além disso, infecções por
tripanossomíase, micobactérias ou vírus Epstein-Barr podem induzir anticorpos antiDNA ou
mesmo sintomas semelhantes ao lúpus (JOG; JAMES, 2021). Outro fator superimportante é a
luz ultravioleta, que pode estimular os queratinócitos a secretar mais citocinas, TNF alfa,
estimulando assim as células B a produzirem mais anticorpos. Essa autoimunidade ocorre de
forma sistêmica ao interferir no processamento de antígenos e na ativação de macrófagos de
todo organismo (CASCIOLA-ROSEN; ANHALT; ROSEN, 1994; YUNG et al., 1996).
O LES é caracterizado pela presença de autoanticorpos nucleares, com a formação e
deposição de imunocomplexos e inflamação de múltiplos órgãos (DURCAN; O’DWYER;
PETRI, 2019). A patogênese envolve uma desregulação e um desequilíbrio do sistema imune,
com aumento da produção de citocinas, anticorpos, imunocomplexos e redução dos
mecanismos de autotolerância e clareamento desse estado hiperimune (TSOKOS et al., 2016).
Há desregulação tanto da imunidade inata quanto da imunidade adaptativa (PAN et al., 2020).
Na imunidade inata, há a participação do interferon I (IFN I), receptores Toll like, em
especial 7 e 9, ativação de componentes do complemento. O INF I, que afeta vários
componentes do sistema imunológico, é uma das principais citocinas que contribuem para a
patogênese do LES. Os neutrófilos têm importante participação, com aumento de NETs
(armadilhas extracelulares de neutrófilos) que formam autoantígenos, incluindo cromatina,
DNA dupla hélice e proteínas granulares (GARCÍA-ROMO et al., 2011). Esses NETs não são
retirados e estimulam as células dendríticas a produzirem IFN I via TLR 9. No baço, os
neutrófilos podem induzir mudança de classe de IGG, mutação e ativação de linfócitos B. As
células dendríticas também fazem parte da imunidade inata, conectam os sistemas imune e
adaptativo e têm um espectro diversificado de respostas imunes por meio do processamento de
antígenos, apresentação, produção de citocinas e interações entre receptores coestimulatórios.
Elas são ativadas no LES via TLR 7 e TLR 9 e produzem IFN I e TNF α, que contribuem para
expressão da doença. Os macrófagos têm sua capacidade de remoção e limpeza reduzida no
LES, e a redução de complemento também reduz essa capacidade de depuração (TSOKOS,
2020).
Em relação à imunidade adaptativa, destaca-se a importante função das células B e T
autorreativas, com quebra dos mecanismos de tolerância (TSOKOS et al., 2016; PAN et al.,

2020). As células B têm a produção de anticorpos aumentada e são ativadas pelo Blys (fator de
ativação de células B) e pelas células T. Há um desequilíbrio na relação entre Th1/ Th2, mas a
tendência do desequilíbrio ainda é controversa (TSOKOS, 2020). As células B também ajudam
a perpetuar o processo produzindo citocinas como IL-6, TNF, IFN e IL-10 (PAN et al., 2020).
A nível celular, o LES apresenta disfunção mitocondrial, estresse oxidativo, produção
diminuída de ATP, aumento de intermediários de oxigênio (ROS), ativação de mTORC 1 e
aumento do fluxo de glicose. É importante ressaltar que o estresse oxidativo é um dos fatoreschave no desenvolvimento e progressão do LES, em que há desrregulação do sistema
imunológico e modificação de autoantígenos (BENGTSSON et al., 2016).
O LES é uma doença multifacetada, com várias manifestações sistêmicas e quadro
clínico variável ao longo do tempo. Pode ter manifestações cutâneas, articulares, pulmonares,
cardíacas, renais, neurológicas e hematológicas, bem como manifestações menos comuns,
como gastrointestinais, hepáticas e oculares (TANI et al., 2022).
A diversidade de manifestações da doença é um desafio para o clínico, e a
heterogeneidade da doença levou à criação de critérios para formalizar o diagnóstico de LES.
Foram estabelecidos 11 critérios pelo American College of Rheumatology (ACR), que foram
revisados em 1997, e o preenchimento de quatro deles seria suficiente para o diagnóstico
(HOCHBERG, 1997). Esses foram os critérios utilizados na nossa pesquisa.
Quadro 1 – Atualização de 1997 dos critérios revisados do American College of Rheumatology
de 1982 para a Classificação do Lúpus Eritematoso Sistêmico.
CRITÉRIO

DEFINIÇÃO

Eritema malar

Lesão eritematosa fixa em região malar, plana ou em relevo.

Erupção discoide

Lesão eritematosa, infiltrada, com escamas queratóticas
aderidas e tampões foliculares, que evolui com cicatriz atrófica
e discromia.

Fotossensibilidade

Exantema cutâneo como reação não usual à exposição à luz
solar, de acordo com a história do paciente ou observado pelo
médico.

Úlceras orais/nasais

Úlceras orais ou nasofaringes, usualmente indolores,
observadas pelo médico.

Artrite

Não erosiva envolvendo duas ou mais articulações periféricas,
caracterizadas por dor e edema ou derrame articular.

Serosite

Pleurite (caracterizada por história convincente de dor
pleurítica, atrito auscultado pelo médico ou evidência de
derrame pleural) ou pericardite (documentado por
eletrocardiograma, atrito ou evidência de derrame pericárdico).

Comprometimento renal

Proteinúria persistente (> 0,5 g/dia ou 3+) ou cilindrúria
anormal.

Alterações neurológicas

Convulsões (na ausência de outras causas)
Psicose (na ausência de outras causas)

Alterações hematológicas

Anemia hemolítica ou leucopenia (menor que 4.000/mm3 em
duas ou mais ocasiões) ou linfopenia (menor que 1.500/mm3
em duas ou mais ocasiões) ou plaquetopenia (menor que
100.000/mm3 na ausência de outra causa).

Alterações imunológicas

Anticorpo antiDNA nativo ou antiSm ou presença de anticorpo
antifosfolípide com base em: a) níveis anormais de IgG ou IgM
anticardiolipina; b) teste positivo para anticoagulante lúpico;
ou c) teste falso-positivo para sífilis, por, no mínimo, seis
meses.

Anticorpos antinucleares

Título anormal de anticorpo antinuclear por
imunofluorescência indireta ou método equivalente, em
qualquer época, e na ausência de drogas conhecidas por
estarem associadas à síndrome do lúpus induzido por drogas.
Fonte: Adaptado de Hochberg (1997).

Desde então, a compreensão da doença avançou. Foram descritas novas lesões cutâneas,
novas manifestações clínicas foram compreendidas e novos testes imunológicos entraram na
prática clínica. Em 2019, o EULAR/ACR estabeleceu novos critérios diagnósticos. Houve
algumas mudanças: o FAN é critério de entrada para diagnóstico; febre não explicada por outros
motivos e alopecia não cicatricial tornaram-se critérios; delirium, psicose e pericardite foram
redefinidos, e a biópsia renal com nefrite classe III ou IV passou a ter maior peso e, na presença
de FAN positivo, já é suficiente para classificar o paciente como LES. Além disso, o
antiβ2glicoproteína1 e a queda de complemento (C3 e C4) tornaram-se, também, critérios
imunológicos para diagnóstico. É importante ressaltar que os critérios devem ser utilizados para
facilitar, mas nunca devem excluir os pacientes que não atendem a eles e necessitam de terapias
urgentes e apropriadas. Os critérios são extremamente úteis para classificar os pacientes com
LES, principalmente no contexto de pesquisa (ARINGER et al., 2019).
O tratamento do LES deve ser individualizado e depende das manifestações clínicas, da
atividade e gravidade da doença, bem como da presença de comorbidades. Hidroxicloroquina
e imunossupressores, como glicocorticóides, azatioprina, metotrexato, inibidores da
calcineurina, micofenolato de mofetil e ciclosfofamida são os principais medicamentos
utilizados (FANOURIAKIS et al., 2021). Durante as últimas décadas, os estudos sobre a
fisiopatologia do LES estão evoluindo e elucidando ainda mais as vias envolvidas na doença, o
que tem levado à identificação de novas possibilidades terapêuticas e incentivado novos ensaios
clínicos (TSANG-A-SJOE; BULTINK, 2021). Dentre as novas ferramentas terapêuticas

destacam-se: o belimumabe, um anticorpo monoclonal contra Blys aprovado para tratamento
de LES; o anifrolumabe, anticorpo monoclonal contra INF já aprovado pelo US Food and Drug
Administration (FDA); e o rituximabe, que também é um anticorpo monoclonal que depleta
células B e tem mostrado, em estudos observacionais, benefício no tratamento de lúpus
refratário (RAMOS-CASALS et al., 2009). A combinação de terapia tem tornado os
tratamentos mais promissores e com bom perfil de segurança para o paciente lúpico (ZUCCHI
et al., 2022).
O LES é uma doença bastante heterogênea, e o diagnóstico é um desafio,
principalmente nos estágios iniciais. Os critérios diagnósticos e exames sorológicos disponíveis
propiciam a realização de mais diagnósticos (BERTSIAS et al., 2013). Além disso, o tratamento
também evoluiu, com novas drogas como biológicos e novos protocolos que estão sendo
utilizados (TSANG-A-SJOE; BULTINK, 2021). Como consequência, o prognóstico dos
pacientes com LES tem melhorado durante as últimas décadas, prolongando a expectativa de
vida dos mesmos, e a DCV tornou-se a principal causa de óbito pela doença (BJÖRNÅDAL et
al., 2004).

4.2 Risco cardiovascular e Lúpus Eritematoso Sistêmico
O LES é associado com aterosclerose acelerada (ANDRADES et al., 2017) e tem 5 a
10 vezes risco aumentado de DCV quando comparado com pessoas saudáveis da mesma idade
e sexo (MANZI et al., 1997). Mulheres com LES entre 35 e 44 anos têm 52 vezes mais chance
de infarto agudo do miocárdio do que aquelas sem LES da mesma faixa etária, de acordo com
o importante estudo Framingham Offspring (MANZI et al., 1997). Essa associação não é
explicada totalmente pelos fatores de risco tradicionais, como HAS, DM, obesidade e
dislipidemia (BRUCE, 2005), que são aumentados no LES (MEDEIROS et al., 2016). Fatores
adicionais, como autoanticorpos, inflamação sistêmica, lesão endotelial pela doença autoimune
e alteração da função renal ou doença renal em estágio final, têm sido sugeridos com função
importante na patogênese da aterosclerose prematura do LES (WESTERWEEL et al., 2007).
McMahon e colaboradores têm demonstrado a existência de uma subpopulação de HDL próinflamatório em pacientes com LES que promove a aterosclerose (MCMAHON et al., 2009).
Em um estudo do mesmo grupo, foi encontrado aumento de leptina em pacientes com LES na
placa da carótida. Foi observada, também, associação entre os níveis de leptina e os lipídios
inflamatórios HDL, Lp(a) e OxPL/apoB100, evidenciando um elo entre o sistema imune, o
metabolismo e a aterosclerose (MCMAHON et al., 2011).

Em 2002, foi evidenciado que pacientes com LES apresentam disfunção endotelial,
mesmo na ausência de fatores de risco tradicionais, e essa disfunção não apresentava associação
com tempo de doença, dose cumulativa de prednisona, uso de antimalárico, anticorpos
anticardiolipina, HAS, fenômeno de Raynaud, escore de atividade de doença ou presença de
vasculite (LIMA et al., 2002). Sella e colaboradores encontraram alterações em cintilografia
miocárdica em 28% de 82 pacientes entre 18 e 55 anos, com LES e que eram assintomáticos do
ponto de vista cardiovascular (SELLA et al., 2003).
Como exposto acima, todas as evidências demonstram a existência de aterosclerose
subclínica e alto RCV. Apesar disso, os tradicionais fatores de risco, como idade, HAS, DM e
tabagismo, que são monitorados nas ferramentas para cálculo de RCV, falham em predizer
eventos cardiovasculares no LES (ESDAILE et al., 2001). O LES é reconhecido como um fator
independente de risco para doença cardiovascular (ZELLER; APPENZELLER, 2008). Os
modelos tradicionais, como os escores de Framingham, Systematic Coronary Risk Evaluation
(SCORE) e o escore global de risco cardiovascular da Sociedade Americana de Cardiologia,
não contemplam as doenças reumáticas imunomediadas (SIVAKUMARAN et al., 2021). As
escalas de risco subestimam o RCV em pacientes com LES. Uma grande proporção de pacientes
com LES poderia ser reclassificada como alto risco usando fórmula que incorporasse LES como
parâmetro (BOULOS et al., 2017).
Em 2016, Urowitz e colaboradores demonstraram que o Framingham modificado, em
que cada item é multiplicado por 2, prediz mais acuradamente doença cardiovascular em
pacientes com LES (UROWITZ et al., 2016). Recentemente, o QRISK3 incorporou o LES no
seu modelo de risco. Ele examina os mesmos fatores do QRISK2 (com idade, sexo, etnia,
tabagismo, DM, história familiar de DCV, doença renal crônica, fibrilação atrial, tratamento
para HAS, artrite reumatoide, HDL, colesterol total, pressão sistólica sanguínea, peso e altura)
e acrescenta enxaqueca, LES, doença mental severa, uso de antipsicótico, uso de corticoide,
HIV/AIDS, diagnóstico e tratamento de disfunção erétil (HIPPISLEY-COX; COUPLAND;
BRINDLE, 2017). Apesar de o QRISK3 ser capaz de identificar mais pacientes com risco
elevado de doença cardiovascular em 10 anos, em comparação com os escores de Framingham,
SCORE e escore global de risco cardiovascular da Sociedade Americana de Cardiologia
(BATTISTA et al., 2020), ele não é validado no Brasil.
O ultrassom de carótidas pode ser realizado para estratificação e rastreamento de doença
aterosclerótica precoce em pacientes com risco intermediário, permitindo reclassificar esses
pacientes para alto RCV; entretanto, é examinador dependente (MASSOM et al., 2020).

A aterosclerose é uma doença inflamatória (ROSS, 1999) e é a causa subjacente mais
comum de doença cardíaca, doença arterial coronariana, doença arterial periférica e acidente
vascular cerebral (GALLINO et al., 2014). O conceito de que a aterosclerose é uma doença
inflamatória ganhou forte respaldo nos estudos da família da pentraxina de proteínas reagentes
de fase aguda clássicas, como a PCR. Essa pentraxina pode ser produzida e secretada pelas
células em resposta à IL-6. Níveis elevados de PCR foram reconhecidos com o fator de risco
independente que poderia predizer eventos cardiovasculares (TONG et al., 2007). A inflamação
é iniciada pelo acúmulo de LDL, que estimula a resposta autoimune. Há envolvimento do
sistema imune inato adaptativo. Como resultado de sinais coestimulatórios e citocinas
secretadas pela célula apresentadora de antígeno (APC), fatores de transcrição das células T
favorecem a diferenciação dos tipos de linfócitos Th. Quando a expressão de linfócitos Th1 é
aumentada, ela tem um efeito pró-aterogênico, com aumento de INFꙋ e TNF α. As células B
também são detectadas nas placas ateroscleróticas, porém em menor quantidade, evidenciando
a presença da imunidade humoral na aterosclerose (GISTERÅ; HANSSON, 2017; WOLF;
LEY, 2019).
Nos últimos anos, está havendo a redescoberta do metabolismo pelos imunologistas e o
surgimento de um novo campo, o imunometabolismo, que tem emergido como principal
mecanismo para regulação do sistema imune inato e adaptativo (O’NEILL; KISHTON;
RATHMELL, 2016; MAKOWSKI; CHAIB; RATHMELL, 2020). Está claro que o
metabolismo e o estado imunológico estão ligados de maneira intrínseca. Cada população de
células imunes tem um metabolismo e nutriente diferente utilizado. As citocinas e vias de
sinalização que guiam diferentes respostas imunes também promovem específicos programas
que suportam a bioenergética e a biossíntese. Múltiplos mecanismos de sinalização coordenamse após as células imunes serem estimuladas para mediar a reprogramação metabólica e as
diferenças específicas de cada tipo e subconjunto de células (MAKOWSKI; CHAIB;
RATHMELL, 2020).

4.3 Identificação de biomarcadores através da metabolômica
No contexto da imunidade, alterações específicas com vias metabólicas se ligam a
funções imunes efetoras, mais notadamente na produção de diferentes tipos de citocinas. Além
disso, o estresse oxidativo que ocorre no LES envolve várias vias importantes, com a liberação
de enzimas proteolíticas e intermediários reativos para o processo imunológico e inflamatório
(BENGTSSON et al., 2016). Existem seis principais vias metabólicas, que são: a glicolítica, o
ciclo de Krebs, a fosfato pentose, a oxidação de ácido graxo, a síntese de ácido graxo e a via de

aminoácidos. Cada uma dessas vias tem um propósito único na célula e é regulada por vias de
sinalização celular para ligar a atividade às suas necessidades celulares (O’NEILL; KISHTON;
RATHMELL, 2016).
A metabolômica inclui a detecção e a quantificação de moléculas de baixo peso
molecular (metabólitos), que avaliam perturbações do sistema biológico e podem ser usadas
como biomarcadores para detectar doenças. Em alguns casos, como alterações metabólitas
congênitas, pode ser possível identificar somente um metabólito, mas na maioria dos casos,
devido às múltiplas vias enzimáticas, será possível identificar grupos de metabólitos
(BENGTSSON et al., 2016).
Os metabólitos podem ser avaliados pela metabolômica através da espectrometria de
massa, que pode ser combinada com uma cromatografia preliminar, ou pela espectroscopia com
Ressonância Magnética Nuclear (RMN). Metabolômica de isótopos estáveis e outros ensaios
in vivo e em tecidos são, agora, cada vez mais acessíveis e permitem diretrizes inovadoras em
abordagens atuais para entender o imunometabolismo (MAKOWSKI; CHAIB; RATHMELL,
2020). O perfil metabolômico é uma ferramenta do sistema biológico que mede um grande
número de metabólitos com diferentes propriedades bioquímicas. A metaboloma difere do
genoma, do transcriptoma e do proteoma. A metaboloma é um status biológico: enquanto o
genoma define o que pode acontecer, a metaboloma define o que tem acontecido (KOH;
KOVALIK, 2021). Eles são influenciados pela exposição ambiental e pelo estado dinâmico da
doença (BARBA; ANDRÉS; GARCIA-DORADO, 2019).
As abordagens clínicas atuais são comumente baseadas em moléculas de biomarcadores
com uma concentração limite no sangue para o diagnóstico de certas patologias ou para
avaliação de risco. Entretanto, é importante reconhecer que existe um continuum no perfil
metabólito entre o estado saudável e os vários níveis de doença. Algumas alterações de
metabólitos podem ser identificadas antes de os sintomas clínicos aparecerem (BARBA;
ANDRÉS; GARCIA-DORADO, 2019). Essas alterações podem ajudar a identificar doenças
precocemente ou auxiliar na predição de scores de risco como RCV, principalmente quando o
risco é intermediário e há a dúvida em prosseguir a investigação com exames mais invasivos,
arriscados e caros.
Existem poucos estudos com metabolômica e risco cardiovascular em pacientes com
LES. Há um estudo, no Reino Unido, em que a metabolômica foi avaliada com uma plataforma
focando nas lipoproteínas e na sua associação com aterosclerose subclínica (COELEWIJ et al.,
2021). Em outro estudo, foram avaliados por metabolômica os metabólitos das homocisteínas
intra e extracelular, que foram associadas à lesão vascular (STOJAN et al., 2021). Foram

avaliações mais direcionadas e não amplas da metabolômica, focando em determinados
metabólitos, o que poderia ter prejudicado o encontro de outros metabólitos importantes.

5 METODOLOGIA

5.1 Tipo de estudo e amostra
Trata-se de um estudo observacional e transversal, em que a amostra foi selecionada por
conveniência, tendo sido incluídos os pacientes com diagnóstico de LES de acordo com os
critérios do Colégio Americano de Reumatologia (ACR 1997) (HOCHBERG, 1997), com idade
maior ou igual a 20 anos, acompanhados no Hupaa/Ufal, e que concordaram em participar do
estudo e assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE). Os controles foram
pareados por sexo e idade e foram constituídos por acompanhantes de pacientes do Hupaa e
funcionários do hospital. A coleta de dados ocorreu no período de maio de 2021 a outubro de
2022. Foram excluídos do estudo: gestantes; pacientes com evento cardiovascular prévio;
paciente com sobreposição com outra doença autoimune.

5.2 Aspectos éticos
Durante as consultas ambulatoriais, os pacientes e seus responsáveis eram convidados
a participar, sendo informados quanto aos objetivos e procedimentos da pesquisa, bem como
esclarecidos em suas dúvidas. Havendo aceitação, ocorria a leitura e a assinatura do TCLE
(apêndice A), estando a proposta de acordo com os princípios constantes na Declaração de
Helsinki (1964). Os pacientes eram conduzidos a uma sala para a entrevista.
O estudo aqui apresentado foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da
Universidade Federal de Alagoas (Ufal) sob o número do parecer 4.472.515 e Certificado de
Apresentação de Apreciação Ética 39956520.2.0000.5013 (anexo A).

5.3 Coleta de dados
5.3.1 Dados clínicos e sociodemográficos
Os indivíduos incluídos na pesquisa foram submetidos a uma entrevista estruturada,
complementada através de informações obtidas a partir do prontuário do paciente (apêndice B),
onde foram coletados dados sociodemográficos (nome, idade, sexo, escolaridade e procedência)
e clínicos (uso de medicamentos, atividade de doença, tempo de doença, dano orgânico
cumulativo, comorbidades). Foi também realizado o exame físico completo, com as medidas
da pressão arterial, altura, peso e IMC.
Para medir aspectos relacionados à atividade do LES, foi utilizado o escore SLEDAI2k modificado (apêndice C) sem critérios sorológicos (antiDNA e C4), cuja pontuação varia de
zero a 101. Esse instrumento abrange vinte e dois itens, sendo dezesseis itens sobre

manifestações clínicas e os demais sobre variáveis laboratoriais (URIBE et al., 2004). Para
avaliar atividade de doença, o SLEDAI foi considerado como uma variável dicotômica em que
se estabeleceu como doença ativa escores maiores ou iguais a 4 (TOUMA et al., 2011).
Para avaliar dano orgânico, foi utilizado o SLICC (apêndice D), que é a ferramenta
validada para avaliar dano permanente. O SLICC contém itens que representam, em um
paciente lúpico, danos irreversíveis e permanentes que ocorreram em consequência da doença
e/ou do seu tratamento (SUTTON; DAVIDSON; BRUCE, 2013). Ele foi utilizado, também,
como variável dicotômica, com ou sem dano orgânico, em que a presença de um dano orgânico
já era suficiente para tal definição.
Quanto à avaliação das comorbidades, o diagnóstico de hipertensão arterial sistêmica
foi feito de acordo com as diretrizes da Sociedade Brasileira de Cardiologia, e o indivíduo foi
considerado hipertenso quando tinha PA sistólica (PAS) maior ou igual a 140 mmHg e/ou PA
diastólica (PAD) maior ou igual a 90 mmHg, medida com a técnica correta, em pelo menos
duas ocasiões diferentes, na ausência de medicação anti-hipertensiva (BARROSO et al., 2021).
A doença DM foi diagnosticada de acordo as diretrizes da Sociedade Brasileira de Diabetes,
com a medida da glicemia plasmática de jejum maior ou igual a 126 em duas medidas (COBAS
et al., 2022).
O diagnóstico de obesidade foi procedido através do Índice de Massa Corporal (IMC),
calculado pela razão entre a massa corporal em quilogramas e a altura em metros ao quadrado,
e é um dos índices de peso relativo mais comumente utilizados em estudos. O paciente foi
classificado como obeso quando teve IMC maior ou igual 30 kg/m2 (FRANKENFIELD et al.,
2001).

5.3.2 Exames laboratoriais
Os indivíduos participantes do estudo foram orientados previamente a fazerem jejum de
12 horas e, no dia da coleta, encaminhados para o laboratório de análises clínicas do Hupaa,
onde eram coletados e analisados os exames bioquímicos (TGO, TGP, fosfatase alcalina, GGT,
colesterol total, HDL, LDL, glicemia jejum, ureia, creatinina), hemograma, Proteína C reativa,
dosagem de complementos, sumário de urina e proteinúria 24 horas.
Uma amostra em tubo seco foi enviada para o Laboratório do Instituto de Química e
Biotecnologia da Ufal, com o qual foi feita a parceria para a análise metabolômica.

5.3.3 Avaliação do risco cardiovascular

O RCV foi realizado através do Score de Framingham (FRS) (WILSON et al., 1998),
que avalia as variáveis idade, sexo, pressão arterial sistólica, diagnóstico de HAS, DM,
tabagismo, colesterol total e HDL. Para os pacientes com LES, foi utilizado o FRS modificado,
que multiplica o padrão por 2 para melhorar a acurácia do exame, uma vez que este subestima
o risco cardiovascular no paciente com LES. Urowitz e colaboradores testaram diferentes
fatores de multiplicação (1,5, 2, 3 e 4), e sua análise confirmou que o fator 2 forneceu a mais
apropriada classificação de moderado/alto risco cardiovascular com suficiente sensibilidade e
especificidade, que foi confirmada com a melhora da acurácia (UROWITZ et al., 2016). Para
o grupo controle não foi utilizado fator de multiplicação. Os pacientes com LES e controles
foram classificados como baixo risco FRS <10%, intermediário FRS 10-19% e alto risco FRS
≥20%.

5.3.4 Análise metabolômica
Foi realizada através de Ressonância Nuclear Magnética (RNM), com a triagem das vias
de todos os metabólitos, e, ao surgir a via mais prevalente, esta foi avaliada para uso na análise
estatística.
Para análise de RNM, a amostra de plasma (500 μL) foi centrifugada a 14.000 rpm por
15 min a 4ºC e 350 μL, e pipetada para um tubo de NMR (5 mm) com 350 μL de tampão fosfato
(contendo ácido trimetilsililpropiônico-d4 sal de sódio 0,1 mM em D2O).
Os espectros de RMN foram adquiridos utilizando um espectrômetro Bruker 600 MHz
Ascend (Bruker BioSpin, Alemanha), operando a 600,13 MHz e equipado com sonda PABBO
600S3 BBF-H-D-05 Z SP. Antes de iniciar os experimentos, o espectrômetro de RMN foi
calibrado diariamente, seguindo rigorosos procedimentos de operação padrão para garantir a
mais alta qualidade espectral e reprodutibilidade preparada, de acordo com o procedimento
padrão. Todas as manhãs, a amostra de referência padrão de RMN (sonda de 5 mm) metanold4 (MeOD) e sacarose 2 mM foi adquirida para verificar as condições ideais do espectrômetro.
Primeiro, uma temperatura estável na sonda de RMN foi verificada para evitar variações de
deslocamentos químicos, especialmente o pico de água para supressão de água. Para isso, um
tubo selado de calibração contendo uma amostra padrão MeOD 99,8% foi usado para garantir
que as amostras de plasma fossem executadas a 310K. A estabilidade da temperatura ao longo
do tempo na sonda de RMN foi controlada com o comando "edte". O segundo tubo de
calibração foi uma amostra de sacarose para otimizar a supressão de água e a sensibilidade do
espectrômetro. Uma sintonia e correspondência automáticas foram realizadas, bloqueadas
(90%H2O+10%D2O_salt) e automaticamente ajustadas (topshim 3D 1H ordmax=8). Os

espectros de 1H NMR foram registrados usando a sequência de pulso Carr-Purcell-MeiboomGill (CPMG) com pré-saturação de água (programa de pulso: cpmgpr1d), implementando um
filtro T2 para suprimir os amplos sinais de proteínas e outras macromoléculas. Essa sequência
de RMN permite a detecção seletiva de sinais provenientes apenas de metabólitos de baixo peso
molecular. Para todos os experimentos, 128 varreduras foram registradas após 16 varreduras
fictícias, 64k pontos de dados, uma largura espectral de 20,0290 ppm, atraso de relaxamento de
4s, tempo de aquisição de 2,73s e alargamento de linha de 0,3Hz. Antes de aplicar a
transformada de Fourier, os decaimentos de indução livres foram multiplicados por uma função
exponencial equivalente a um fator de alargamento de linha de 0,3Hz. O processamento
espectral foi realizado automaticamente, corrigindo fase e linha de base, e calibrado para o TSP
em δ 0,00 ppm, utilizando TopSpin 3.5 (Bruker BioSpin). Os espectros unidimensionais
identificam os picos usando The Human Metabolome Database (HMDB) Versão 4.0 e o
ChenomX NMR Suite (Chenomx Inc., Edmonton, Canadá).

5.3.5 Análise de dados
Os dados obtidos após coleta foram digitados em planilha no programa Microsoft
Excel 2013. Foi utilizado o software JASP versão 0.16.1. O teste de Shapiro-Wilk
determinou a normalidade da distribuição das variáveis numéricas. Os dados foram descritos
como frequência para variáveis categóricas e média ± SD para variáveis contínuas.
Os conjuntos de dados espectrais foram analisados usando a plataforma online
MetaboAnalyst 5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/) (CHONG; WISHART; XIA, 2019).
Inicialmente, foi realizada a análise não supervisionada (PCA), no intuito de se obter uma
perspectiva preliminar dos dados e facilitar uma visão geral de ambos os grupos (LES,
controles; LES com intermediário/alto RCV e baixo RCV) por meio dos componentes
principais (PC1 vs. PC2), revelar tendências e potenciais outliers, bem como fornecer uma visão
sobre os pesos das variáveis em cada componente. O mapa de calor foi construído utilizando
um método de agrupamento euclidiano. O formalismo OPLS-DA foi realizado para avaliar a
capacidade dos dados metabolômicos de distinguir os grupos analisados. A região de confiança
foi de 95%, e 2000 permutações foram realizadas para avaliar o modelo. Os metabólitos
importantes foram selecionados pelo limiar do VIP baseado no gráfico VIP (gráfico de
importância variável) ≥ 1,5.

6 PRODUTO ( Segundo as normas da “LUPUS na international jornal” )

Systemic lupus erythematosus and cardiovascular risk: a study of metabolomic profile in
brazilian patients

Vanessa Miranda Pereira Fausto1, Jeferson Santana Ursulino2, Larissa da Silva Pinto3, Jaciel
de Oliveira Clementino4, Patrícia Lúcia Silva Sampaio Leite5, Thiago Sotero Fragoso6

___________________
1

Master's student in Medical Sciences, Faculty of Medicine, Federal University of Alagoas, Brazil.
https://orcid.org/0000-0001-9913-2684

Nucleus of Analysis and Research in Nuclear Magnetic Resonance - NAPRMN, Institute of Chemistry and
Biotechnology, Federal University of Alagoas, Maceió, Brazil https://orcid.org/0000-0002-6292-4546

MD; Rheumatology division; Professor Alberto Antunes Hospital, Federal University of Alagoas,

Brazil.

https://orcid.org/0000-0001-8987-9565
4

Nurse; Professor Alberto Antunes Hospital; Federal University of Alagoas, Brazil. https://orcid.org/00000002-8293-2930

Graduate student in medicine, Faculty of Medicine, Federal University of Alagoas, Brazil.
https://orcid.org/0000-0001-5534-0203

PhD; Rheumatology division; Faculty of Medicine; Federal University of Alagoas, Brazil.
https://orcid.org/0000-0002-0192-0760

Corresponding author: Thiago Sotero Fragoso.
E-mail: thiago.reumato@gmail.com

Abstract
Background: Systemic Lupus Erythematosus is a chronic and inflammatory autoimmune
disease with atherosclerosis accelerate. Metabolomics is a relatively new field in autoimmunity

that could be applied in the discovery of novel biomarkers for SLE and its comorbidities and
providing key insights into SLE pathophysiology and events before the traditional exams and
onset of the clinic symptoms. Methods: This was a cross-sectional study, where we analyzed
the profile of plasma metabolites in SLE and compare them with controls by proton nuclear
magnetic resonance (1H NMR) and compare the metabolites of SLE with high/intermediary and
low cardiovascular risk (CVR). Results: The result of OPLS-DA (Orthogonal Partial LeastSquares Discriminant Analysis) revealed clear separation between SLE and control groups,
showing excellent performance demonstrated by permutation test. Important metabolites for
discriminating between the groups, were selected for by the VIP-plot (Variable Importance
Plot) based on VIP threshold ≥ 1.5. Glutathione, tyrosine, phenylalanine, alanine, m-histidine,
glutamine and histamine were increased in plasma of SLE patients compared to controls, but
we did not distinguish high/intermediary from low CVR subgroups by OPLS-DA model.
Conclusion: The increased level of amino acids probably occurred in response to immunologic
alterations linked to oxidative stress. More longitudinal research with large sample size in
different populations are necessaries.
Keywords: Systemic Lupus Erythematosus; metabolomics; cardiovascular risk.

Introduction
Systemic Lupus Erythematosus (SLE) is a complex and heterogeneous autoimmune
disease with chronic inflammation and damaged of almost organ or system.1 The prognostic of
SLE has been modified in the last decades with early detection and treatment improvement. So,
the patients have experimented the consequences of an inflammatory and chronic disease, and,
because of the atherosclerosis accelerate, the cardiovascular diseases have become the main
cause of mortality.2,3 Thus, it is important to detect the high cardiovascular risk (CVR)
individuals to prevent premature deaths in SLE.

In the last years is coming a rediscovery of immunometabolism, where each immune
cell has its own metabolism.4,5 Metabolomics is the analysis of concentration profiles of low
molecular weight metabolites present in biological fluids, which is a relatively new field
including autoimmunity.6,7 One important application could be the discovery of novel
biomarkers for SLE and its comorbidities. In addition, with the ability to measure changes in
circulating and tissue concentrations of metabolites, metabolomics can provide key insights into
SLE pathophysiology and events before the traditional exams and onset of the clinic symptoms.
So, the better understanding of metabolic profile of SLE patients could be applied in the clinical
field, with development of new diagnostic methods and treatments, improvement of patient’s
follow-up and early identification of comorbidities, such as cardiovascular diseases.
Therefore, the aim of this study was to analyze the profile of plasma metabolites in SLE
patients and compare them with controls without systemic autoimmune diseases by proton
nuclear magnetic resonance (1H-NMR). We also compare the plasma metabolites profile of
SLE patients with high/intermediary and low CVR.

Materials and methods
Study design and population
This was a cross-sectional study with patients who fulfilled the classification criteria for
SLE made by the American College of Rheumatology (ACR) from May 2021 to October 2022.8
A consecutive sample of seventy-nine (79) patients aged over 20 years old was included from
the Lupus Outpatient Clinic at the Professor Alberto Antunes University Hospital (HUPAA),
Federal University of Alagoas (UFAL), Brazil. This SLE outpatient clinic is a reference unit
for lupus care in the state of Alagoas, northeast of Brazil. It was not included pregnant or
patients with another immune rheumatic disease. The Control group was composed for

individuals matched for age and genre and without autoimmune or inflammatory chronic
diseases.

Ethical aspects and procedures
This study was approved by local Ethics Committee for Research of the Federal
University of Alagoas (No. 4.472.515; CAAE: 39956520.2.0000.5013) and complied with the
Helsinki Declaration. Written informed consent was obtained from each participant.

Clinical and sociodemographic data
Sociodemographic information, life habits, clinical aspects/disease characteristics and
organ or system involvement data were obtained from electronic medical records and clinical
consultation. We evaluated the following clinical aspects: medication, comorbidities (obesity,
systemic arterial hypertension, diabetes mellitus and dyslipidemia), cardiovascular risk, disease
activity and organ damage.
We considered the individuals with systolic blood pressure ≥ 140 mmHg and/or
diastolic pressure ≥ 90 mmHg, or treatment; 9 diabetes mellitus when the fasting blood glucose
was ≥ 126 mg/dl in two measurements or treatment; 10 and dyslipidemia the fasting blood
cholesterol was ≥ 190 mg/ dl , LDL ≥ 130 mg/dl and triglycerides was ≥ 150 mg dl or
treatment.11 Individuals with BMI (weigh/ height square) ≥ 30 kg/m2 were classified as
obesity.12
To identify cardiovascular risk, we used the Framingham Score (FRS) which utilizes
the variables age, gender, systolic blood pressure, diagnosis of systemic hypertension, diabetes
mellitus, smoking, total cholesterol and HDL. For patients with SLE, the modified FRS was
used, which multiplies by 2 to improve the accuracy of the score.13 We classified as low-risk
FRS < 10 %, intermediate FRS 10 – 19 %, and high risk FRS ≥ 20 %.14

The Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index (SLEDAI), in its 2K
modified version, was used to assess disease activity.15 We consider active SLE when SLEDAI2K ≥ 4.16 The Systemic Lupus International Collaborating Clinics/ American College of
Rheumatology – Damage Index (SLICC-ACR) was performed to verify organ damage. It was
considered irreversible organ damage when SLICC ≥ 1.17

Laboratorial tests and plasma samples preparation
Two blood samples were obtained from a peripheral venous access after 12 hours fast
for biochemical and metabolomics analysis, in the same day of clinical data collection. The
samples were collected in tubes with EDTA-K3 6 mL, 13x100 mm (FL5-1306M) and the
plasma was separated by centrifugation at 1400 rpm for 10 min and was stored at -80ºC until
metabolomics analysis was performed. The serum was also separated by centrifugation and the
biochemical tests were performed in the same day with analytical procedures Blood glucose
was determined using a bedside glucose analyzer (glucose-oxidase method; YSI, Yellow
Springs Instruments, Yellow Springs, OH) and all other blood parameters on an ADVIA 1800
clinical chemistry system (Siemens Healthcare systems, Erlangen, Germany).

Plasma measurements NMR
The plasma samples (1500 μL) were centrifuged at 14.000 rpm for 15 min, and 350 μL
pipetted to an NMR tube (5 mm) with 350 μL phosphate buffer (containing
trimethylsilylpropionic acid-d4 sodium salt, TSP 0.1 mM, and 100% D2O).
NMR spectral were acquired using a Bruker 600 MHz spectrometer Ascend (Bruker
BioSpin, Germany) operating at 600.13 MHz and equipped with probe PA BBO 600S3 BBFH-D-05 Z SP. 1H NMR spectra were recorded using pulse sequence Carr-Purcell-MeiboomGill (CPMG) with water presaturation (pulse program: cpmgpr1d), implementing a T2 filter to

suppress the broad signals of proteins and other macromolecules. This NMR sequence allows
the selective detection of signals arising only from low molecular weight metabolites. For all
experiments, 128 scans were recorded after 16 dummy scans, 64k data points, a spectral width
of 20.0290 ppm, relaxation delay of 4 s, 2.73 s acquisition time. The processing spectral was
realized automatically correcting phase and baseline and calibrated to the TSP at δ 0.00 ppm,
using TopSpin 3.6.5 (Bruker BioSpin). The one-dimensional spectra identified the peaks using
The Human Metabolome Database (HMDB) Version 5.0, and the ChenomX NMR Suite
(Chenomx Inc., Edmonton, Canada).

Processing data and statistical analysis
Shapiro-Wilk test was used to determine the normality of the distribution of numeric
variables. All of them were normally or approximately normally distributed. Data were
described as number (frequency) for categorical variables and mean ± SD for continuous
variables.
Statistical analysis of the metabolic was performed using R software version 4.1.0
(http://cran.rproject.org/) with R packages mrbin (version 1.6.5), ggplot2 (version 3.4.0), and
online platformed MetaboAnalyst 5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/).
In we data metabolomics, all metabolites were normalized by a median to minimize the
effect of different concentrations. Unsupervised heatmap was used as the first exploratory
analysis to obtain a preliminary data outlook and facilitate a general overview of both groups,
thus heatmap built using a distance measure Euclidean clustering method. The statistical
method used was supervised analysis using Orthogonal Partial Least Squares-Discriminant
Analysis (OPLS-DA). OPLS-DA is a multivariate statistical method that is commonly used to
analyze complex data sets, such as metabolomics data. This supervised method aims to find a
model that can separate the samples into groups based on the variables (metabolites) that are

most important in distinguishing the groups. In this study, OPLS-DA was used to identify the
metabolites that were differentially abundant between the experimental groups, allowing the
key metabolites responsible for the observed differences in the metabolic profiles to be
identified. The model performance was showed by permutation test (n = 2000).
The Variable Importance in the Projection (VIP) plot is a statistical method used to rank
the variables (metabolites) in the OPLS-DA model based on their importance in discriminating
between the two groups. The VIP score measures the contribution of each variable to the model
and is calculated by considering both the explained variation of the variable and its covariance
with the response variable (experimental group). In the VIP plot, the metabolites are ranked
according to their VIP scores, and those with VIP scores greater than 1.5 are considered
important for the classification of the groups. To identify the cardiovascular risk effect in the
metabolome of different subgroups of SLE patients, a model was built based on intermediary
or high CVR subgroups and Low risk.

Results
Clinical characteristics of patients and controls are shown in Table 1.

Table 1 – Clinical data of subjects.
SLE
(N=79)

Controls
(N = 45)

Female

75 (94.94)

43(95.56)

Age (Years) Mean ± DP

38.55 ± 12

37 ± 10.86

Disease duration (Years) Mean ± DP

8.70 ± 6.57

SLICC ≥ 1, n (%)

35 (44.30)

SLEDAI ≥ 4, n (%)

25 (31.65)

Gender , n (%)

Medications, n (%)

Steroid

41 (51.90)

Hydroxychloroquine

75 (94.94)

Immunobiological

6 (7.59)

Cyclophosphamide

2 (2.53)

Methotrexate

5 (6.33)

Azathioprine

41 (51.90)

Mycophenolato de mofetila

8 (10.12)

Cholecalciferol

23 (20.11)

Hypertension

37 (46.84)

5 (11.11)

Diabetes Mellitus

12 (15.19)

2 (4.45)

Dyslipidemia

29 (36.70)

15 (33.3)

Smoking

6 (7.59)

Alcohol consumption

2 (2.53)

Obesity

44 (55.70)

10 (22.22)

Low

58 (73.42)

43 (95.56)

Intermediate/high

21( 26.58 )

2 (4.45)

Comorbidities, n (%)

Cardiovascular risk, n ( %)

NA = Not applicable, n = number

The heatmap demonstrated one trend and patterns changes in the metabolic profile of
SLE and controls. Thus, two clusters of blood metabolites were observed, and two clusters,
lupus patients (red) and controls (green).

Figure 1 – Cluster heatmap diagram for the Control (green) and Lupus groups (red). For each
metabolites cluster, the color corresponds to the expression for each group. Red, upregulated
for group; blue, downregulated for group.

The result of analysis supervised showed clear separation, in the model built by OPLSDA (Figure 2A), between SLE and control groups, and presented excellent performance
demonstrated by the 2000 x permutation test (Q2 0.778, R2Y 0.901, and p < 0.0005) (Figure
2B). The OPLS-DA model was used to filter out the signals irrelevant to the model
classification and, thus, to reveal the important metabolites. That way, the model ranked the
metabolites effectively based on their importance in discriminating between the groups, as
shown in the VIP plot.

Figure 2 – Supervised Analysis of the 1H NMR Spectral Dataset. (A) The OPLS-DA assessment
plot between controls (green) and Lupus (red) shows the predictive component and the
orthogonal component. (B) 2000x permutation test.

We used the VIP plot to reveal the important metabolites and effectively rank them
based on their significance in discriminating between the groups. Metabolites with a VIP score
≥ 1.5 were deemed important for group classification. A total of 7 characteristic metabolites
were found to be increased in SLE group.

Figure 3 - Variable Importance in Projection (VIP) plot showing the contribution of each
metabolite to the classification of the studied groups. The VIP values were calculated using the
OPLS-DA model, and metabolites with VIP values above 1.5 are considered important for the
classification.

When we compared two subgroups of SLE patients, high/intermediary and low
cardiovascular risk, the results didn’t provide clear evidence of the presence of metabolic
disturbances. The OPLS-DA formalism wasn´t able to separate of the subgroups (Figure 4A),
and presenting bad performance demonstrated by the 2000 x permutation test (Q2 - 0.00648
and p = 0.073, R2Y 0.266 and p = 0.055), as show figure 4B.

Figure 4 - Supervised Analysis of the 1H NMR Spectral Dataset. (A) The OPLS-DA assessment
plot between low cardiovascular risk (green) and intermediate/high cardiovascular risk (red)
shows the predictive component and the orthogonal component. (B) 2000x permutation test.

Discussion
Metabolomics has received increasing attention in recent years because of its assistant
role in helping to identify biomarkers. Unfortunately, it has been studied less extensively for
use in detecting SLE patients, especially those with high/intermediary cardiovascular risk. 20,6
This is the first study to evaluate SLE metabolomic profile in Brazilian patients analyzing the
six mainly metabolomic pathways in plasma.
We observed different metabolic profile between patients and controls, with increased
levels of glutathione (GSH), tyrosine (Tyr), phenylalanine (Phe), alanine (Ala), methylhistidine (m-His), glutamine (Gln) and histidine (His) in SLE group. All of them are included
in amino acid pathway. Amino acids display wide-ranging metabolic and regulatory roles,
including intracellular protein turnover, gene expression, synthesis and secretion of hormones,
nutrient metabolism, oxidative defense, and immune function.21
SLE is a chronic inflammation disease that presents mitochondrial dysfunction,
oxidative stress, decreased ATP production, increased reactive oxygen intermediates (ROS),
activation of mTORC1 and increased glucose flux.22,23 These processes are metabolically
demanding, requiring not only an increased uptake of nutrients (mostly glucose, fatty acids and

Gln), but also a switch to specialized metabolic pathways corresponding to specific effector
functions.24 In our research all metabolites increased in SLE were amino acids. During their
catabolism, the carbon and the amino groups are channeled into separate but interconnected
pathways, namely the Krebs cycle and urea cycle, respectively.6 Amino acids entering the Krebs
cycle may contribute to energy generation, but in humans, the oxidative energy derived from
the catabolism of amino acids comprise only a minor fraction.25
Gln is the most abundant amino acid in the blood. The Gln is a precursor of glutamate
(Glu) and during these conversion release ammonium ions. The cytosolic Glu then participates
in the biosynthesis of GSH and not essential amino acids (Ala, proline, aspartate, asparagine,
and arginine). We found in SLE group higher levels of GSH and Ala possible originated from
glutamine pathway, demonstrating the correlation of these metabolites. Cytosolic Gln supports
nucleotide biosynthesis, which is essential for rapidly proliferating cells.26,27 Glutaminolysis
has a vital role in energy production in proliferating cells including T cells, with indispensable
roles in the generation of proinflammatory effector T cells Th1 and Th17 cells, that are involved
in SLE pathogenesis.28 Apart from glucose, Gln is one of the most common energy sources in
human cells,29 because Gln-derived carbon is an important substrate that supports the Krebs
cycle and is so important to maintaining mitochondrial function in human, mainly when there
is dysfunction mitochondrial.30 Beyond, the Gln produces GSH for redox homeostasis,
maintaining nitrogen balance, or other functions in immune cells.31,32 Ala is also important in
T cell activation and it is transported through SLC38A1 in CD4+ T cells and TCR stimulation
induces its expression.33
In human Phe is an essential amino acid which must be supplied in the dietary proteins.
Once in the body, Phe may follow any of three paths. It may be (1) incorporated into cellular
proteins, (2) converted to phenylpyruvic acid, or (3) converted to Tyr. This last can be converted
into L-DOPA, which is further converted into dopamine (DA), noradrenaline, and adrenaline.34

The Tyr can be converted in melanin. This last reaction necessity of GSH.35 The elevated Phe
levels in SLE patients are indicative of oxidative stress.36 The decomposition of Tyr can end up
as fumarate or acetoacetate, and both molecules may enter the TCA cycle.34 Beyond, DA is a
neuroregulatory and immunoregulatory molecule that has significant effects on cells that are
involved in the immune response.37
His is a semi-essential amino acid that exerts anti-inflammatory action through its
imidazole ring that scavenges ROS. It serves as a precursor for His that is an inflammatory
peptide stored in the secretory granules of leucocytes and plays an important role in acute
inflammation.34,38 Both clinical and preclinical data suggest that His has strong anti-oxidative
and anti-inflammatory effects.39 Another study has also established the coordination between
histidine transporter SLC15A4 and mTOR-dependent inflammatory responses.40
Cardiovascular disease is the mainly cause of death in SLE,3 however there are lack of
studies for biomarkers that helping identify SLE patients with high cardiovascular risk. We
found, in the scientific literature, only one study of metabolomic profile in adult patients with
SLE and cardiovascular disease/risk.41 It evaluated lipidomic profile and atherosclerotic
plaques, but neither cardiovascular risk nor the others metabolic pathways were studied. We
observed in SLE group high levels of metabolites that could implicated in ROS response when
compared with controls. ROS is involved in the pathogenesis of both: cardiovascular disease
and SLE.42 We also verified a high prevalence of individuals with high/intermediary
cardiovascular risk than in controls, but we could not discriminate the high/intermediary and
low risk cardiovascular groups by the OPLS-DA model. Possibly the sample size was the main
determinant for this finding.
When interpreting the results of metabolomics studies, it is important to keep in mind
that metabolites are extensively influenced by various coexisting factors other than the disease
per se. We did not evaluate the association of metabolites with disease activity, medications, or

others environmental factors. For instance, the sample size is relatively small, so it was also
challenging for us to classify subgroups according to their clinical data.

Conclusions
We did not distinguish high/intermediary from low CVR subgroups by OPLS model
probably because the limited sample size. Our findings showed clear separation, in the model
built by OPLS-DA between SLE and control groups with increased levels of GSH, Tyr, Phe,
Ala, m-His, Gln and His in plasma of SLE patients. These amino acids probably occurred in
response to immunologic alterations linked to mitochondrial dysfunction and oxidative stress.
So, metabolites involved in this process should be more studied to became possible biomarkers
for SLE diagnostics and its complications.
Our study had some limitations and more longitudinal research with large sample size
in different populations are necessaries.

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7 CONCLUSÕES


Os modelos metabolômicos criados não foram capazes de discriminar o grupo de LES
com intermediário/alto RCV do grupo com baixo RCV, porém foi capaz de discriminar
pacientes com LES dos controles;



Foi verificado que os indivíduos com LES apresentaram alterações na via metabólica
dos aminoácidos em relação ao grupo controle, com níveis plasmáticos aumentados de:
GSH, Tyr, Phe, Ala, m-His, Gln e His.



Os pacientes com LES apresentaram maior prevalência de RCV intermediário e alto em
relação ao controle, conforme o esperado, porém esse subgrupo para análise
metabolômica foi pequeno, o que, provavelmente, influenciou nos resultados do modelo
metabolômico.

8 LIMITAÇÕES

Ao interpretar os resultados dos estudos de metabolômica, é importante ter em mente
que os metabólitos são amplamente influenciados por vários fatores coexistentes além da
doença em si. Não avaliamos a associação de metabólitos com atividade da doença,
medicamentos ou outros fatores ambientais. Além disso, trata-se de um estudo transversal com
tamanho da amostra relativamente pequeno, então também foi um desafio classificar os
subgrupos de acordo com seus dados clínicos, sobretudo o RCV.

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APÊNDICE A – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E
ESCLARECIDO (TCLE)

O (a) Sr.(sra.) esá sendo convidado(a) a participar como voluntário(a) do estudo
“AVALIAÇÃO E DIAGNÓSTICO DA OBESIDADE E SUA ASSOCIAÇÃO COM
BIOMARCADORES PREDITORES DO RISCO CARDIOVASCULAR NOS
PACIENTES COM LÚPUS ERITEMATOSO SISTÊMICO”, que será realizado no
Ambulatório de Reumatologia do Hospital Universitário Professor Alberto Antunes/HUPAA.
Receberá dos pesquisadores Vanessa Miranda Pereira Fausto e Thiago Sotero Fragoso as
seguintes informações:
1. A pesquisa se destina a estudar a obesidade e o risco de desenvolver doenças cardiovasculares
(como infarto e acidente vascular cerebral) em um grupo de pacientes com e lúpus eritematoso
sistêmico no ambulatório de Reumatologia do Hospital Professor Alberto Antunes.
2. A importância deste estudo é a de conhecer melhor o comportamento do Lúpus Eritematoso
nos pacientes atendidos neste serviço. Esta pesquisa é importante para que se possam
estabelecer programas de tratamento e assistência mais adequados à nossa realidade.
3. Os resultados que se desejam alcançar são os seguintes: quantificar a porcentagem de
pacientes com obesidade e sarcopenia (perda de massa muscular) dentre os participantes;
descobrir novos exames que possam ajudar a prevenir infarto e acidente vascular cerebral. A
partir desses dados, desenvolver medidas de tratamento e prevenção. Com isso, objetivamos
reduzir o risco cardiovascular (ocorrência de doenças como infarto e acidente vascular
cerebral).
4. A coleta de dados começará em 29 de maio de 2021 e terminará em 29 de outubro de 2022.
5. O estudo será feito da seguinte maneira: Durante a consulta de rotina com seu médico
reumatologista, serão coletadas informações sobre a sua doença e tratamento, serão realizados
exame físico e coleta de sangue – semelhantes daqueles que você faria como parte da avaliação
de rotina com o seu médico. A diferença é que:
- Na coleta de sangue, avaliaremos substâncias chamadas de metabólitos ( produzidos devido à
inflamação causada pela sua doença) que serão utilizados como exames para avaliar a doença;
- Serão avaliados de peso, altura e circunferência abdominal através de balança e fita métrica.

6. A sua participação será nas seguintes etapas: consulta médica com reumatologista com
realização de exame físico, realização de exames de sangue, realização de exame clínica e
medida de peso, altura e circunferência abdominal.
7. A sua participação neste estudo é totalmente voluntária e a sua recusa em participar não
influenciará de nenhuma forma o relacionamento com a equipe médica que lhe assiste.
8. Os incômodos e possíveis riscos à sua saúde física e/ou mental são: demora no atendimento
(na sala de espera); dor no local de retirar sangue (numa veia da mão ou do braço).
9. Os benefícios esperados com a sua participação no projeto de pesquisa, mesmo que não
diretamente são: ao descobrir a presença de obesidade, o seu médico irá recomendar medidas
para melhoria desses parâmetros podendo assim diminuir os riscos de desenvolver algumas
doenças do coração e acidente vascular cerebral.
10. Você poderá contar com a seguinte assistência: se você precisar de algum tratamento, ou
encaminhamento devido novos achados em sua avaliação médica, ou por se sentir prejudicado
por causa da pesquisa, você será encaminhado (a) para ambulatórios específicos do Hospital
Universitário Professor Alberto Antunes, de acordo com o fluxo de marcação do mesmo.
11. Você será informado (a) do resultado final do projeto e sempre que desejar, serão fornecidos
esclarecimentos sobre cada uma das etapas do estudo.
12. A qualquer momento, você poderá recusar a continuar participando do estudo e, também,
que poderá retirar seu consentimento, sem que isso lhe traga qualquer penalidade ou prejuízo.
13. As informações conseguidas através da sua participação não permitirão a identificação da
sua pessoa, exceto para a equipe de pesquisa, e que a divulgação das mencionadas informações
só será feita entre os profissionais estudiosos do assunto após a sua autorização. Os dados
apresentados publicamente serão sempre analisados no conjunto de todos os pacientes, sem
identificação de nenhum dos participantes do estudo.
14. O estudo não acarretará nenhuma despesa para você.
15. Você será indenizado (a) por qualquer dano que venha a sofrer com a sua participação na
pesquisa (nexo causal)., desde que seja relacionado a prejuízos advindos dos procedimentos
que serão realizados.
16. Você receberá uma via do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido assinado por todos.

Endereço d(os,as) responsáve(l,is) pela pesquisa (OBRIGATÓRIO):
Instituição: Hospital Universitário Professor Alberto Antunes – UFAL
Endereço: Avenida Lourival Melo Mota, s/n, Cidade Universitária
Cidade/CEP: Maceió – AL CEP 57072900 Telefone: (82) 3202-3800
Ponto de referência: Ao lado da universidade Federal de Alagoas - UFAL

O Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) é um colegiado interdisciplinar e independente,
que deve existir nas instituições que realizam pesquisas envolvendo seres humanos no
Brasil, foi criado para defender os interesses dos sujeitos em sua integridade e dignidade e
para contribuir no desenvolvimento da pesquisa dentro dos padrões éticos (Resolução nº
466, de 12 de dezembro de 2012). O CEP é responsável pela avaliação e acompanhamento
dos aspectos éticos de todas as pesquisas envolvendo seres humanos. Este papel está bem
estabelecido nas diversas diretrizes éticas internacionais (Declaração de Helsinque,
Diretrizes Internacionais para as Pesquisas Biomédicas envolvendo Seres Humanos –
CIOMS) e Brasileira (Resolução CNS 196/96, Resolução CNS 466/12 e complementares),
diretrizes estas que ressaltam a necessidade de revisão ética e científica das pesquisas
envolvendo seres humanos, visando a salvaguardar a dignidade, os direitos, a segurança e o
bem-estar do sujeito da pesquisa. Além disso, o CEP contribui para a qualidade das
pesquisas e para a discussão do papel da pesquisa no desenvolvimento social da
comunidade. Contribui ainda para a valorização do pesquisador que recebe o
reconhecimento de que sua proposta é eticamente adequada. Desta maneira e de acordo com
a Resolução CNS 466/12, “pesquisas envolvendo seres humanos devem ser submetidas à
apreciação do Sistema CEP/CONEP, que, ao analisar e decidir, se torna corresponsável por
garantir a proteção dos participantes."

ATENÇÃO: O Comitê de Ética da UFAL analisou e aprovou este projeto de pesquisa. Para
obter mais informações a respeito deste projeto de pesquisa, informar ocorrências
irregulares ou danosas durante a sua participação no estudo, dirija se ao: Comitê de Ética
em Pesquisa da Universidade Federal de Alagoas- Prédio do Centro de Interesse
Comunitário (CIC), Térreo, Campus A. C. Simões, Cidade Universitária. Telefone: 32141041 Horário de Atendimento: das 8:00 as 12:00hs. E-mail:comitedeeticaufal@gmail.com.
Finalmente, tendo eu compreendido perfeitamente tudo o que me foi informado sobre a minha
participação no mencionado estudo e, estando consciente dos meus direitos, das minhas
responsabilidades, dos riscos e dos benefícios que a minha participação implica, concordo em
participar da pesquisa e, para tanto eu DOU O MEU CONSENTIMENTO SEM QUE PARA
ISSO EU TENHA SIDO FORÇADO (A) OU OBRIGADO (A).
Maceió, ________ de ______________________ de __________.

_________________________________________

Assinatura ou impressão datiloscópica do (a) voluntário (a)
(rubricar as demais folhas)
_________________________________________
Assinatura do responsável pelo Estudo
(rubricar as demais folhas)

APÊNDICE B – FORMULÁRIO PARA COLETA DE DADOS CLÍNICOS E
SOCIODEMOGRÁFICOS

(1) IDENTIFICAÇÃO
Nome (iniciais): ___________________________ Prontuário: _______________
Telefone: ____________________ Data da coleta: ____/____/____
Data de nascimento: _____/____/__________ Idade: ___________________
Sexo: ( ) Masculino ( ) Feminino
Cor: ( ) Branco ( ) Preto ( ) Pardo ( ) Amarelo
Estado civil: ( ) Solteiro ( ) Casado/união estável ( ) Viúvo ( ) Divorciado
( ) Outros
Escolaridade em anos de estudo: ____________
Situação ocupacional: ( ) Ativo com renda ( ) Inativo com renda (aposentadoria/ pensão) ( )
Ativo sem renda ( ) Inativo/desempregado ( ) Dona de casa/ estudante
Grau de Instrução: ________________________________________________
Profissão:_______________________________________________________
Naturalidade: _______________________ Procedência: __________________
(2) DADOS CLÍNICOS
Doença (diagnóstico): ( ) Lúpus eritematoso sistêmico , critérios diagnósticos:
________________________________________________________________
________________________________________________________________
Data do diagnóstico da doença: ____/___/_____
Hipertensão arterial sistêmica
( ) Sim ( ) Não
Diabetes mellitus
( ) Sim ( ) Não
Tabagismo
( ) Sim ( ) Não
Etilismo
( ) Sim ( ) Não
Atividade física
( ) Sim ( ) Não
Medicamentos em uso:
Glicocorticoide
Hidroxicloroquina
Imunobiológico
Metotrexato
Azatioprina
Micofenolato de mofetil
Colecalciferol
Alendronato ou bifosfonados
Anti-hipertensivos
Antidiabéticos
Estatina
AAS

(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(

) Sim (
) Sim (
) Sim (
) Sim (
) Sim (
) Sim (
) Sim (
) Sim (
) Sim (
) Sim (
) Sim (
) Sim (

) Não
) Não
) Não
) Não
) Não
) Não
) Não
) Não
) Não
) Não
) Não
) Não

Dose: __________

(3) EXAME FÍSICO e AVALIAÇÃO ANTROPROMÉTRICA
Medida de pressão arterial: _____________________
Altura: __________cm
Peso: _________Kg
IMC: ____________Kg/m²
Circunferência abdominal: _____________
(4) AVALIAÇÃO LABORATORIAL
EXAME
HB
LEUCO
PLAQUETAS
PCR
C3
C4
COOMBS DIRETO
RETICULÓCITOS
URÉIA
CREATININA

RESULTADO

EXAME
TGO
TGP
GLICEMIA JEJUM
INSULINA
COLESTEROL TOTAL
HDL
LDL
TRIGLICÉRIDES
SUMÁRIO DE URINA
PROTEINÚRIA 24 HORAS

RESULTADO

APÊNDICE C – SLEDAI-2K MODIFICADO
PESO

DESCRIÇÃO

DEFINIÇÃO

Convulsão

Início recente. Excluindo causas metabólicas, infecciosas ou por drogas.

Psicose

Habilidade alterada de realizar atividades normais devido à grave
distúrbio na percepção da realidade. Inclui alucinações, incoerência,
perda significativa de associações, conteúdo inadequado do pensamento,
pensamento ilógico, comportamento bizarro, desorganizado ou
catatônico. Exclui uremia e drogas.

Função mental alterada com prejuízo da orientação, memória ou outra
função intelectual, com início e flutuações súbitas. Inclui alteração do
nível de consciência com diminuição da capacidade de concentração e
S. cerebral orgânica incapacidade de sustentar atenção no meio-ambiente associado a 2 dos
seguintes: distúrbios persecutórios, discurso incoerente, insônia ou
sonolência diurna, atividade psicomotora aumentada ou diminuída.
Excluir causas infecciosas, metabólicas ou drogas.

Distúrbio visual

Alterações retinianas do LES. Inclui corpos citóides, hemorragia
retiniana, exsudato seroso ou hemorragia na coróide, neurite ótica.
Excluir hipertensão, infecção e drogas.

Alteração de par
craniano

Início de neuropatia sensorial ou motora.

Cefaléia lúpica

Cefaléia intensa e persistente podendo ser tipo enxaqueca, mas tem que
ser resistente ao uso de narcóticos.

AVC

AVC novo. Exclui aterosclerose.

Vasculite

Ulceração, gangrena, nódulos em dedos, infartos periungueais,
hemorragias pontuais, biópsia ou arteriografia comprovando vasculite.

Artrite

Mais de 2 articulações com dor e flogose.

Miosite

Fraqueza/ dor muscular proximal associado a aumento de CK-T/ aldolase
ou ENMG ou biópsia muscular.

Cilindrúria

Granular hemático ou celular de hemácias

Hematúria

> 5 hemácias/ cp. Excluir infecção, nefrolitíase ou outra causa.

Piúria

> 5 leucócitos/ cp. Excluir infecção.

Proteinúria

> 0.5 mg/ 24 hs (independente de início recente ou recorrência).

Nova erupção
cutânea

Erupção cutânea nova ou recorrente com sinais de inflamação.

Alopécia

Início recente ou recorrência de queda de cabelo anormal difusa ou
localizada.

Úlcera mucosa

Início recente ou recorrência de úlceras orais ou nasais.

Pleurite

Dor torácica pleurítica com atrito ou derrame pleural ou espessamento
pleural.

Pericardite

Dor pericárdica com mais um dos seguintes: derrame, atrito ou ECG, ou
ECO.

Febre

> 38º C. Excluir infecção.

Trombocitopenia

< 100.000 plaquetas/ mm3

Leucopenia

< 3.000 leucócitos/ mm3. Excluir drogas.

Escore Total:

/ 101

APÊNDICE D – SLICC

ANEXO A – PARECER CONSUBSTANCIADO DO CEP

Mestrado em Ciências Médicas - PPGCM