Dissertação Lucas Correia.pdf

Dissertação Lucas Correia.pdf
Documento PDF (1.4MB)

Exibir conteúdo Baixar

UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS
FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS

Lucas Correia Lins
2020101292 matrícula

Perfil dos Metabólitos Intestinais em Indivíduos com Doença Inflamatória
Intestinal

Maceió
2022

Lucas Correia Lins

Perfil dos Metabólitos Intestinais em Indivíduos com Doença Inflamatória
Intestinal

Projeto de Mestrado apresentado ao Programa de
Pós-graduação
em
Ciências
Médicas
da
Universidade Federal de Alagoas-UFAL, como parte
das exigências para a obtenção do título de Mestre
em Ciências Médicas.
Área de Concentração: Medicina
Orientadora: Profa. Dra. Fabiana Andrea Moura
Coorientador: Prof. Dr. Manoel Álvaro de Freitas
Lins Neto

Maceió
2022

Catalogação na Fonte
Universidade Federal de Alagoas
Biblioteca Central
Divisão de Tratamento Técnico
Bibliotecário: Marcelino de Carvalho Freitas Neto – CRB-4 – 1767
L759p

Lins, Lucas Correia.
Perfil dos metabólitos intestinais em indivíduos com doença inflamatória
interstinal / Lucas Correia Lins. – 2022.
48 f. : il.
Orientadora: Fabiana Andrea Moura.
Coorientador: Manoel Álvaro de Freitas Lins Neto.
Dissertação (Mestrado em Ciências Médicas) – Universidade Federal de
Alagoas. Faculdade de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Ciências
Médicas. Maceió, 2022.
Inclui produto educacional.
Bibliografia: f. 38-39.
Apêndices: f. 40-44
Anexos: f. 45-48.
1. Doença de Crohn. 2. Colite ulcerativa. 3. Metabolômica. 4. Calprotectina.
I. Título.
CDU: 616.34

Folha de Aprovação

Lucas Correia Lins

Perfil dos Metabólitos Intestinais em Indivíduos com Doença Inflamatória
Intestinal
Dissertação submetida ao corpo docente do Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas
da Universidade Federal de Alagoas em 28 de Abril de 2022.

________________________________________________
Profa. Dra. Fabiana Andrea Moura
Universidade Federal de Alagoas
Orientadora

_______________________________________________
Prof. Dr. Manoel Álvaro de Freitas Lins Neto
Universidade Federal de Alagoas
Coorientador
Assinado de forma digital por
JORGE ARTUR
ARTUR PECANHA DE
Banca Examinadora:
PECANHA DE MIRANDA JORGE
MIRANDA COELHO:02788815484
COELHO:02788815484 Dados: 2022.11.08 18:10:56 -03'00'
_______________________________________________

Prof. Dr. Jorge Artur Peçanha de Miranda Coelho
Universidade Federal de Alagoas
Examinador interno
_______________________________________________
Profa. Dra. Juliana Célia de Farias Santos
Universidade Federal de Alagoas
Examinador interno
________________________________________________
Prof. Dra. Ana Luiza Exel
Centro Universitário Tiradentes - Alagoas
Examinador externo

Dedico esse trabalho a todas as pessoas que dependem do Sistema Único de Saúde
(SUS), em especial aos pacientes de doença inflamatória intestinal.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente agradeço a Universidade Federal de Alagoas e ao Hospital
Universitário Professor Alberto Antunes, em especial a Clínica Cirúrgica, e o serviço de
Endoscopia e Coloproctologia. Locais onde concluí a graduação em medicina, residência
médica em Cirurgia Geral e Coloproctologia, e agora o programa de mestrado pela Faculdade
de Medicina (FAMED).
Pela minha formação na Universidade pública e no Sistema Único de Saúde (SUS), não
consigo deixar de manifestar aqui o meu repúdio a todos que manifestam discursos de ódio
direcionados aos estudantes, professores, serviços e servidores públicos. Discursos tais que
muitas vezes são encabeçados pelo presidente da república Bolsonaro.
De forma particular, agradeço meus pais, avós e meu amigo-irmão Thomás que
terminou recentemente seu mestrado sendo minha inspiração como profissional e ser humano
ímpar. Agradeço aos meus orientadores: professora Fabiana Moura, que me incentivou a
terminar o trabalho quando eu achava que seria impossível, e professor Manoel Álvaro, que
me acompanha desde a graduação na minha formação, sendo exemplo de pessoa e profissional
que tanto admiro.
Aos meus amigos, agradeço a toda equipe do Instituto de Habilidades em Microbiota
Intestinal (InHaMMI), em especial a Eliana Almeida, Claudia Costa, João Otávio e Josiete
Acioli. Matheus Amaral e Julia Watanabee, estudantes que me ajudaram a todo momento.
Minhas amigas Bruna Wanderley e Isabelle Lameirinhas. Ao químico Alessandre, um
agradecimento especial, pois foi o grande impulsionador do trabalho. Agradecer minha amiga
Júnia Meire, ao meu lado desde o início do projeto. E a minha esposa e companheira Camila
Wanderley sempre me ajudando e apoiando a prosseguir no trabalho, amo você!!!

RESUMO

Introdução: A doença inflamatória intestinal (DII) é representada pela doença de Crohn (DC)
e pela colite ulcerativa idiopática (CUI). Apresenta-se como afecção de origem autoimune e
sem etiologia conhecida, de caráter crônico com períodos de remissão e agudização. Seu
diagnóstico é feito através dos sintomas clínicos, exames de imagem e colonoscopia. Para
acompanhamento, utiliza-se um marcador biológico, calprotectina fecal. Outra via possível com
potencial de identificar biomarcadores para acompanhamento é a metabolômica. Essa técnica
analítica faz parte das ciências ômicas e busca analisar os metabólitos presentes em meios
biológicos e pode ser utilizada para identificação de fatores patológicos. Objetivo: Analisar o
perfil da metabolômica fecal dos pacientes com DII e correlacionar com a atividade da doença
pelos níveis da calprotectina fecal. Metodologia: Estudo observacional, transversal, por
conveniência, com amostragem de pacientes com DII. Foram coletados dados clínicos,
realizadas dosagens da calprotectina fecal para avaliar atividade da doença e metabolômica
fecal através da espectrometria de massas pela técnica de GC-MS. Foram considerados
pacientes com doença ativa aqueles que apresentaram calprotectina superior a 200 μg/g. Foram
realizados testes estatísticos com auxílio do SPSS v21 para análise de qui quadrado/teste de
Fisher, sendo considerado significante quando p<0,05. Para análise da metabolômica fecal, foi
utilizado o software MetaboAnalyst 5.0, com análise de forma multivariada. Resultados:
Foram analisados 52 pacientes (n=29 com CUI e n=23 com DC). A atividade inflamatória foi
identificada em 36 (69,2%) pacientes. Foram identificados 56 metabólitos através da
metabolômica fecal. Na população do nosso estudo, os metabólitos mais sensíveis para
diferenciar a DC da CUI foram: ácido hexadecanóico, esqueleno e ácido octadecanoico. Os
metabólitos que melhor se correlacionaram com a atividade da doença entre os pacientes com
CUI foram: ácido octadecanoico, 11-hexadecen-1, ácido hexadecanoico e a pentadecanona; já
entre os pacientes com DC, foram: ácido octadecanoico, ciclodecasiloxona, ácido oleico-1 e
ciclopentadecanoico. O ácido octacanóico, 11-hexadecen-1, pentadecanona e ácido oléico-2
foram os mais sensíveis para avaliar maior grau de atividade de doença entre CUI e DC.
Conclusão: A metabolômica pode ser utilizada como exame não invasivo na propedêutica da
doença inflamatória intestinal, auxiliando no diagnóstico e identificação da atividade de doença.
Palavras-chave: Doença de Crohn. Colite Ulcerativa. Metabolômica. Fezes. Calprotectina.

ABSTRACT

Introduction: Inflammatory bowel disease (IBD) is represented by Crohn's disease (CD) and
idiopathic ulcerative colitis (IUC). It presents as an autoimmune condition with unknown
etiology. It has a chronic nature with periods of remission and exacerbation. The diagnosis is
made through clinical symptoms, imaging tests and colonoscopy. For follow-up, the fecal
calprotectin is used as a biomarker. Another possibility with the potential to identify biomarkers
for follow-up is metabolomics. This analytical technique is part of the omics sciences, used to
find metabolites in biological materials and can be used to identify pathological factors.
Objective: To analyze the fecal metabolomics profile of patients with IBD and correlate it with
disease activity by fecal calprotectin levels. Methodology: Observational, cross-sectional,
convenience sampling study of patients with IBD. Clinical data were collected, measurements
of fecal calprotectin were performed to assess disease activity and fecal metabolomics through
mass spectrometry using the GC-MS technique. Patients with active disease were considered
to be those with calprotectin greater than 200μg/g. Statistical tests were performed using SPSS
v21 for chi-square analysis/Fisher's test, being considered significant when p<0.05. For
analysis of fecal metabolomics, the MetaboAnalyst 5.0 software was used, with multivariate
analysis. Results: 52 patients were analyzed (n=29 with IUC and n=23 with CD). Inflammatory
activity was identified in 36 (69.2%) patients. 56 metabolites were identified through fecal
metabolomics. In the population of our study, the most sensitive metabolites to differentiate CD
from ICU were: hexadecanoic acid, squalene and octadecanoic acid. The metabolites that best
correlated with disease activity among patients with ICU were octadecanoic acid, 11hexadecen-1, hexadecanoic acid and pentadecanone. Among patients with CD, the metabolites
were octadecanoic acid, cyclodecasilloxona, oleic-1 acid and cyclopentadecanoic.
octadecanoic acid, 11-hexadecen-1, pentadecanone and oleic-2 acid were the most sensitive to
assess a higher degree of disease activity between ICU and CD.
Conclusion: Metabolomics can be used as a non-invasive test in the workup of inflammatory
bowel disease, helping in diagnosis and identification of disease activity.

Keywords: Crohn Disease; Ulcerative Colitis. Metabolomic. Feces. Calprotectin.

LISTA DE TABELA
Tabela 1 – Associação entre atividade da doença, identificada pelos níveis de calprotectina fecal, e os tipos de
doença inflamatória intestinal dos pacientes avaliados

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Visão geral dos padrões de separação entre doença de Crohn (DC) e colite ulcerativa
indeterminada (CUI) com resultados da análise discriminante por mínimos quadrados parciais
(PLS-DA) (A). Acurácia, R2 e Q2 por permutação dos cinco metabólitos mais sensíveis (B).
Figura 2: Impressões por variação dos metabólitos pela análise discriminante por mínimos
quadrados parciais (PLS-DA) (A). Sensibilidade e especificidade segundo a curva ROC (B).
Resultados segundo a atividade doença medida pelos níveis de calprotectina fecal (CF: em
atividade (CF > 200 μg/g), em remissão (CF < 200 μg/g).
Figura 3: Colite ulcerativa idiopática - Padrão de separação dos valores de calprotectina fecal
(CF) (A). Impressão por concentração de metabólitos pela análise discriminante por mínimos
quadrados parciais (PLS-DA); resultado segundo a atividade da doença medida pelos níveis de
CF: em atividade (CF > 200 μg/g), em remissão (CF<200μg/g).
Figura 4: Colite Ulcerativa Idiopática - Impressões por variação dos metabólitos pela análise
discriminante por mínimos quadrados parciais (PLS-DA (A; sensibilidade e especificidade
segundo a curva ROC (B). Resultados segundo a atividade doença medida pelos níveis de
calprotectina fecal (CF: em atividade (CF > 200 μg/g), em remissão (CF < 200 μg/g).
Figura 5: Doença de Crohn – Padrão de separação dos valores de calprotectina (A); e impressão
por concentração de metabólitos pela análise discriminante por mínimos quadrados parciais
(PLS-DA. Resultados segundo a atividade da doença medida pelos níveis de calprotectina fecal
(CF): em atividade (CF > 200 μg/g), em remissão (CF < 200 μg/g).
Figura 6: Doença de Crohn - Impressões por variação dos metabólitos pela análise
discriminante por mínimos quadrados parciais (PLS-DA) (A); sensibilidade e especificidade
segundo a curva ROC (B). Resultados segundo a atividade doença medida pelos níveis de
calprotectina fecal (CF: em atividade (CF > 200 μg/g), em remissão (CF < 200 μg/g).
Figura 7: Impressões por variação dos metabólitos pela análise discriminante por mínimos
quadrados parciais (PLS-DA) (A); e sensibilidade e especificidade segundo a curva ROC (B)
dos pacientes com doença inflamatória intestinal com maior atividade da doença (calprotectina
fecal - CF > 800µg/g).
Figura 8: Sensibilidade e especificidade segundo a curva ROC do ácido octadecanóico dos
pacientes com doença inflamatória intestinal com maior atividade da doença (calprotectina
>800µg/g).

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ACU

Área abaixo da curva

AGCC

Ácidos graxos de cadeia curta

CEP

Comitê de ética e pesquisa

Calprotectina fecal

CUI

Colite ulcerativa indeterminada

CVOs

Compostos voláteis orgânicos

D2O

Óxido de deutério

Doença de Crohn

DII

Doença inflamatória intestinal

HMDB

Do inglês Human Metabolome Database

Coeficiente de determinação

TALE

Termo de assentimento livre e esclarecido

TCLE

Termo de compromisso livre e esclarecido

PLS-DA

Análise discriminante por mínimos quadrados parciais,
do inglês Partial Least Squares Discriminant Analysis

Segundo quartil

ROC

Característica de operação do receptor

VIP

Variável de projeção

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 12
2. REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................................... 15
2.1 Doença de Crohn ............................................................................................................... 15
2.2 Colite ulcerativa idiopática ................................................................................................ 15
2.3 Etiologia e a microbiota na doença inflamatória intestinal ............................................... 16
2.3.1 Fatores genéticos ............................................................................................................ 16
2.3.2 Sistema imunológico ....................................................................................................... 16
2.3.3 Fatores ambientais ......................................................................................................... 17
2.3.4 Microbiota intestinal ....................................................................................................... 17
2.4 Diagnóstico e acompanhamento na doença inflamatória intestinal ................................... 18
2.5 Papel da calprotectina fecal na doença inflamatória intestinal .......................................... 18
2.6 Metabolômica e a medicina de precisão ............................................................................ 19
3. OBJETIVOS ........................................................................................................................ 20
3.1 Objetivo geral .................................................................................................................... 20
3.2 Objetivos específicos ......................................................................................................... 20
4. METODOLOGIA ............................................................................................................... 21
4.1 Caracterização do estudo ................................................................................................... 21
4.2 Critérios de elegibilidade ................................................................................................... 21
4.3 Métodos ............................................................................................................................. 21
4.3.1 Dados pessoais e clínicos .............................................................................................. 21
4.3.2 Avaliação Bioquímica .................................................................................................... 21
4.3.3 Avaliação da metabolômica .......................................................................................... 22
4.4 Considerações Éticas ........................................................................................................ 23
5. PRODUTO .......................................................................................................................... 24

5.1 Artigo: PROFILE OF INTESTINAL METABOLITES IN INDIVIDUALS WITH
INFLAMMATORY BOWEL DISEASE .................................................................................... 24
6. DISCUSSÃO ....................................................................................................................... 34
7. CONCLUSÃO .................................................................................................................... 37
REFERÊNCIAS ...................................................................................................................... 38
APÊNDICES ........................................................................................................................... 40
ANEXO .................................................................................................................................... 45

1. INTRODUÇÃO

A doença inflamatória intestinal (DII) refere-se principalmente a Doença de Crohn (DC)
e a Colite Ulcerativa (CUI), que corresponde a uma doença crônica que cursa com inflamação
no trato gastrointestinal e complicações extra intestinais (PILLAI et al., 2017). A exata etiologia
ainda é incerta, porém a interação entre genética, fatores imunológicos e ambientais contribuem
para seu desenvolvimento (VENNOU et al., 2019; URBANO et al., 2017).
Clinicamente a DC e a CUI apresentam-se com exacerbações e remissões da inflamação
e possuem sintomatologia semelhante, tal como dor abdominal, diarreia e perda de peso; porém
podem divergir quanto a extensão, localização, complicações e prevalência (PILLAI et al.,
2017; VENNOU et al., 2019).
Os estudos apontam um aumento da incidência e prevalência da DII no mundo
(BARROS; SILVA; LINS NETO, 2014), com incidência variando de 10 a 20 casos por 100
mil habitantes nos países desenvolvidos, e a prevalência sendo superior a 20 casos por cem mil
habitantes (KAPLAN, 2015). No Brasil, não há registros nacionais sobre incidência e
prevalência da DII, mas estudos pontuais estimam uma prevalência de 14,8/100.000 para a DC
no estado de São Paulo. Nas regiões Norte e Nordeste ainda é uma doença pouco prevalente,
porém nos Hospitais Universitários há um crescente aumento de atendimentos ambulatoriais e
internações hospitalares (PARENTE, 2014; PCDT, 2017).
Os custos para o sistema de saúde são considerados elevados e se deve a múltiplos
fatores como medicações, hospitalização, cirurgias e absenteísmo no trabalho (KAMAT et al.,
2017). Dados canadenses de 2012 mostraram que neste ano foram gastos apenas com fármacos
para o tratamento da DII mais de 1,2 bilhão de dólares canadenses, e com hospitalizações 395
milhões. Nesse mesmo ano, foram gastos na Europa entre 4,5 e 5,6 bilhões de euros com o
tratamento da doença (ROCCHI et al., 2012).
A DII representa um importante problema de saúde pública, afetando as atividades
laborais, produtividade, vida social, e interferindo na qualidade de vida dos pacientes. Seu
tratamento objetiva a remissão clínica, endoscópica e histopatológica, através de uma
abordagem complexa, contemplando terapêutica não farmacológica (psicológica, nutricional
etc.) e farmacológica (imunossupressores, anti-inflamatórios, imunobiológicos etc.), e - em
casos não responsivos à terapêutica tradicional - intervenção cirúrgica (URBANO et al., 2017;
PILLAI et al., 2017).

O trato gastrointestinal é o local que apresenta o maior número e diversidade de
microrganismos no corpo humano, e, em especial, a microbiota intestinal que exerce grande
influência sobre homeostase corporal (WILLEY, SHERWOOD., 2009). Dessa forma, a
manutenção do equilíbrio desse ambiente, a eubiose, impede a proliferação de microrganismos
patogénicos por competição, evitando, consequentemente, a infecção por esses agentes
(FIOCCHI, PEREIRA., 2012).
Nesse contexto, a presença de disbiose intestinal está intimamente relacionada à
patogênese e a complicações clínicas nas DII, porém ainda não é possível distinguir se essa
disbiose é causa ou consequência da doença (VERMEIRE et al., 2016). Dessa forma, diversas
terapêuticas com a finalidade de interferir nesse desbalanço vêm sendo investigadas
(CAMMAROTA et al., 2014; ISHIKAWA et al., 2011).
Para o diagnóstico da DII, além da avaliação clínica, são utilizadas medidas invasivas e
de alto custo, como o exame de colonoscopia e a avaliação histopatológica, as quais geram
desconforto aos pacientes. Devido a isso, nos últimos anos, estudos têm sido realizados para
encontrar um marcador laboratorial de alta sensibilidade e especificidade para diagnóstico e
acompanhamento não invasivo dessas doenças (FATEMEH et al., 2020). Exames séricos
tradicionais, como velocidade de hemossedimentação, proteína C reativa, leucócitos, plaquetas
e albumina, por expressarem resposta inflamatória sistêmica, não são específicos para a DII.
Por outro lado, a calprotectina fecal (CF) vem se apresentando como um marcador eficaz, de
baixo

custo e

alta

reprodutibilidade,

tanto para

o diagnóstico

como para

acompanhamento/monitoramento das DII (ROKKAS, PORTINCASA, KOUTROUBAKIS.,
2018).
A CF é uma proteína de ligação ao cálcio e ao zinco, derivada dos neutrófilos e
monócitos. É detectada em fluidos corporais, como sangue, urina, fezes e amostras de tecidos.
A CF é usada na propedêutica da DII, sendo um biomarcador não invasivo promissor
comparado a outros marcadores laboratoriais (ROKKAS, PONTICASA, KOUTROUBAKIS.,
2018). Apresenta sensibilidade e especificidade de 88,6 e 97,1 respectivamente, quando
comparado a estadiamento endoscópico e análise histológica na DII (VIEIRA et al., 2009).
Outra via possível com potencial de identificar biomarcadores para acompanhamento
da DII, na vigilância de exarcebações clínicas, é a metabolômica (KESHTELI et al., 2017).
Essa técnica analítica faz parte das ciências ômicas e busca analisar os metabólitos presentes
em meios biológicos e pode ser utilizada para identificação de fatores patológicos.

As técnicas analíticas mais utilizadas são a ressonância magnética nuclear, cromatografia
líquida LC-MS e cromatografia gasosa GC-MS (CANUTO et al., 2018; DANILUK et al.,
2019). Com relação à sua aplicação, o GC-MS é frequentemente utilizado para a análise de
ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) e outros compostos voláteis (GALLAGHER., 2020).
Estudos recentes confirmam alterações nos metabólitos em pacientes com DII
comparativamente a indivíduos saudáveis (KESHTELI et al., 2017). Adicionalmente, a
microbiota intestinal é alvo importante de estudos que objetivam sua modulação a fim de
reduzir sinais, sintomas e complicações clínicas comuns nos pacientes com DII. Dessa forma,
é fundamental identificar biomarcadores fecais - de baixo custo e de elevada reprodutibilidade
- que auxiliem a equipe médica na identificação da gravidade da doença e seus riscos, bem
como na avaliação da remissão e eficácia de tratamentos tradicionais ou não usados no curso
da doença.

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Doença de Crohn
A DC é uma doença inflamatória crônica e progressiva. Qualquer segmento do trato
gastrointestinal pode ser acometido, sendo o íleo terminal e o cólon os mais comuns. A
inflamação é segmentar, assimétrica e transmural, e pode desenvolver complicações ao longo
do tempo como estenoses, fístulas e abscessos (TORRES et al., 2016).
O início da doença geralmente ocorre entre a segunda e quarta década de vida, e um
segundo pico entre a quinta e sexta, e não há predisposição por sexo. A incidência e prevalência
vêm aumentando em todo o mundo, de forma maior em países desenvolvidos e em áreas
urbanas. A maior incidência anual é no Canadá, no norte da Europa, na Nova Zelândia e na
Austrália. A prevalência é mais alta na Europa, Canadá e EUA (MOLODECKY et al., 2012).
A etiologia da DC é incerta, porém acredita-se que resulte numa interação entre
genética, fatores ambientais e microbiota intestinal, resultando em uma resposta imune
anormal. A apresentação clínica mais comum é dor abdominal, diarreia crônica e perda de peso,
contudo os sintomas vão depender da localização, gravidade e comportamento da doença.
Outros sintomas são: fadiga, anorexia, sangramento retal, febre alta em vigência de quadro
séptico, doença perianal etc. Metade dos pacientes apresentam manifestações extra intestinais
articulares, cutâneas ou oculares. Algumas delas estão associadas à atividade da doença, como
o eritema nodoso; outras são independentes, como a colangite esclerosante primária (TORRES
et al., 2016).
Na DC existem períodos de remissão e recorrência/atividade de doença; a localização
tende a ser estável, mas o comportamento muda ao longo do tempo. A taxa de internação anual
chega a 20%, e nos primeiros 10 anos de doença metade dos pacientes necessitará de cirurgia
(TORRES et al., 2016).

2.2 Colite ulcerativa idiopática
A CUI é a outra principal forma de DII. Possui características compartilhadas com a
DC, mas possuem distinções quanto à predisposição genética, fatores de risco e características
clínicas, histológicas e endoscópicas. Tal qual a DC, a etiologia é desconhecida, entretanto a
inflamação intestinal decorre de indivíduos geneticamente suscetíveis com uma resposta imune
da mucosa intestinal desregulada pela microbiota intestinal e fatores ambientais (ABRAHAM,
CHO et al., 2009).

A inflamação na CUI é restrita à superfície da mucosa intestinal; o distúrbio se inicia
no reto e se estende proximalmente de forma contínua pelo cólon. A distribuição da doença se
dá em proctite, colite esquerda e pancolite (SILVERBERG et al., 2005).
A CUI, como a DC, apresenta padrão de incidência bimodal, sendo o pico principal
entre os 15 e 30 anos, e o segundo pico entre a quinta e sétima década de vida. Há uma
preferência em relação ao sexo masculino em relação ao feminino, e é mais prevalente que a
DC. O norte da Europa, EUA e Canadá apresentam as maiores taxas de incidência e
prevalência; e percebe-se um aumento na incidência em países que adotaram um estilo de vida
mais industrializado (ORDÁS et al., 2012).
Períodos de remissão e atividade de doença caracterizam o curso clínico da CUI.
Sintomas leves e moderados se apresentam na maioria dos pacientes no momento do
diagnóstico, limitando-se 10% para os casos graves. Cerca de 30-50% dos pacientes apresentam
colite distal (reto e cólon sigmóide), 20-30% colite esquerda e 20% pancolite. A colite distal
tem risco de 25-50% de progredir para formas mais extensa de doença. Essa progressão
geralmente segue um curso grave e necessita de vigilância e tratamento apropriado. A extensão
da doença é um preditor de casos cirúrgicos (colectomia), por refratariedade de tratamento
clínico ou risco de câncer colorretal (ORDÁS et al., 2012).

2.3 Etiologia e a microbiota na doença inflamatória intestinal
A etiologia da DII é desconhecida, porém há evidências de que sua patogênese está
associada à suscetibilidade genética, ao sistema imunológico, a fatores ambientais e à
microbiota intestinal (GUAN et al., 2019).
2.3.1 Fatores genéticos
Estudos do genoma já sequenciaram mais de 240 loci de risco genético para DII. Desses,
30 loci genéticos são compartilhados entre DC e CUI. A análise desses genes e loci genéticos
indicam vias importantes para homeostase intestinal através da defesa inata da mucosa, barreira
intestinal, regulação imunológica, migração celular, autofagia, homeostase, imunidade
adaptativa, entre outras vias metabólicas (GUAN et al., 2019).
2.3.2 Sistema imunológico
A DII caracteriza-se com a falha na regulação imune no controle da resposta
inflamatória associada ao dano epitelial em segmentos do trato gastrointestinal, expansão da
inflamação impulsionada pela disbiose intestinal e grande número de células (células T, células

B, macrófagos, células dendríticas e neutrófilos) infiltrando a lâmina própria (GUAN et al.,
2019).
Existe uma resposta imune atrelada à flora intestinal, e a desregulação que acontece na
DII promove uma resposta inflamatória defensiva. Há uma disfunção da barreira da mucosa
intestinal, proteínas antibacterianas, pH gástrico (que limita o crescimento bacteriano), células
imunológicas, citocinas e moléculas inatas, mediadas pelo sistema imune inato. Essas defesas,
não controlando a exposição dos patógenos presentes na disbiose na DII, ativam o sistema
imune adaptativo (células T e B) que promove uma tolerância imune e resposta inflamatória
em um ciclo vicioso, desregulando o equilíbrio intestinal e causando a DII (GUAN et al., 2019).
2.3.3 Fatores ambientais
A frequência da DII é maior em países desenvolvidos. A industrialização progressiva
nos países vem aumentando a incidência dessa doença, corroborando a influência dos fatores
ambientais na patogênese da doença. A ingestão de alimentos ricos em gorduras e açúcares
exacerbam a DII, da mesma forma que aditivos alimentares artificiais e fast food, prevalentes
nas dietas ocidentais. São alimentos que promovem inflamação, interferindo na barreira
intestinal. Em contraponto, a ingestão de frutas e vegetais tem sido associada à diminuição do
risco de DII (GUAN et al., 2019).
O tabagismo é outro fator que interfere na DII; fator complicador na DC e protetor na
CUI. O tabaco altera a resposta imunológica celular e humoral, e promove produção de muco
no cólon. Acredita-se que a piora na DC se dá devido ao fato de que a nicotina prejudica a
autofagia, especialmente envolvida na DC (GUAN et al., 2019).
Outros fatores ambientais como estresse psicológico, uso de medicamentos e
procedimentos cirúrgicos, como a apendicectomia, também influenciam na DII, porém os
mecanismos ainda não são totalmente compreendidos (GUAN et al., 2019).
2.3.4 Microbiota intestinal
A microbiota intestinal é o principal fator ambiental que implica na DII, e parece resultar
em respostas imunes anormais no hospedeiro. O trato gastrointestinal contém 1000 a 5000
espécies diferentes de microorganismos; as principais delas são provenientes de Firmicutes,
Bacteroidetes, Proteobacteria e Actinobacteria. Esses microrganismos contém cerca de 100
vezes mais genes que os presentes no genoma humano. Essa microbiota pode ser influenciada
por diversos fatores: dieta, probióticos, prebióticos, antibióticos, enzimas exógenas, entre
outros fatores ambientais. Existem microrganismos comensais necessários para o
desenvolvimento e diferenciação do sistema imunológico local e sistêmico, e a coexistência

com a microbiota deve ser benéfica para o metabolismo do hospedeiro. É necessário manter
essa coexistência com esses microrganismos, podendo uma disbiose levar ao surgimento de
doenças (GUAN et al., 2019).
Na DII, é difícil demonstrar uma relação causa-efeito definitiva relacionada à
microbiota intestinal. É improvável que uma única infecção cause ou desencadeie o surgimento
da DII, porém a microbiota intestinal está diretamente relacionada ao desenvolvimento da DII,
pois sabe-se que fatores microbianos desempenham papéis importantes no metabolismo do
hospedeiro, impactando no seu sistema imunológico (GUAN et al., 2019).

2.4 Diagnóstico e acompanhamento na doença inflamatória intestinal
O diagnóstico da DII tem base na história clínica e exame físico, associados a estudos
endoscópicos, histológicos e radiológicos, e exames laboratoriais. Diarreia crônica, dor
abdominal e perda de peso são manifestações típicas, e têm como diagnósticos diferenciais a
intolerância alimentar, o uso de medicamentos, infecções gastrointestinais e tabagismo. A DII
deve ser investigada em pacientes com deficiências nutricionais, alterações dermatológicas
(eritema nodoso, pioderma gangrenoso), artralgia, e déficit de crescimento em crianças
(WEHKAMP et al., 2016).
Exames laboratoriais como hemograma, função renal e hepática, biomarcadores
inflamatórios (proteína C reativa, velocidade de hemodiluição) e a calprotectina fecal estão
inclusos na avaliação inicial e acompanhamento da DII. O exame endoscópico (colonoscopia)
é o padrão ouro para o diagnóstico de DII, podendo avaliar alterações na mucosa do reto, cólon
e íleo terminal (WEHKAMP et al., 2016).
O seguimento da doença consiste como alvo um bom quadro clínico, a normalização de
valores laboratoriais e a cicatrização da mucosa (histologia realizada na colonoscopia). A partir
de 10 anos da manifestação da doença, a colonoscopia deve ser utilizada para vigilância de
neoplasia colorretal a cada 1-2 anos em todos os pacientes (WEHKAMP et al., 2016).

2.5 Papel da calprotectina fecal na doença inflamatória intestinal
A CF é um heterodímero de ligação ao zinco e ao cálcio pertencente à família S100. É
encontrada principalmente nos grânulos de células polinucleares (neutrófilos, monócitos e
macrófagos). Tem atividade antimicrobiana através do sequestro de zinco com consequente
inibição do crescimento bacteriano (MANCEAU et al., 2017).

A síntese de CF é intensificada durante um processo inflamatório, fornecendo um efeito
imunorregulador. É visto que a CF aumenta de valor nos pacientes com DII. Sua concentração
nas fezes correlaciona com a infiltração da mucosa intestinal por neutrófilos. Na DII, seus
valores se associam ao quadro clínico e histológico de atividade de doença; devido a isso, é
utilizada no diagnóstico e no monitoramento de atividade de doença, e pode ser utilizada para
detectar atividade inflamatória subclínica em pacientes assintomáticos (MANCEAU et al.,
2017). Um estudo demonstra uma sensibilidade de 70% e especificidade de 92% na avaliação
de atividade endoscópica com um ponto de corte CF de 200μg/g de fezes (BJARNASON,
2017).
A CF se correlaciona com os principais escores de avaliação endoscópica utilizados na
prática clínica (SES-CD, UCIS e Mayo), mais do que parâmetros inflamatórios não específicos
como PCR e hemograma (MANCEAU et al., 2017).

2.6 Metabolômica e a medicina de precisão
Uma interpretação da complexidade molecular em doenças humanas é feita em vários
níveis (genoma, epigenoma, transcriptoma, proteoma e metaboloma), chamados de
multiômicas. A disponibilidade do estudo e dados das multiômicas revoluciona o campo da
medicina e biologia, promovendo diversas vias de abordagens integradas (THEODORIDIS et
al., 2018).
A metabolômica consiste na análise de metabólitos presentes em células, tecido ou
fluidos, tendo foco em estudos de biomarcadores. Os metabólitos são produtos de processos
celulares, e presume-se que alterações sejam reflexos de alterações da função de enzimas e
proteínas mediadoras. As técnicas analíticas da metabolômica consistem na espectrometria de
massa (MS) gasoso (GC) ou líquido (LC), e a ressonância magnética (RNM) (THEODORIDIS
et al., 2018).
As análises dos dados de uma impressão digital metabólica consistem em métodos de
análise multivariada para identificar características espectrais biologicamente relevantes para
outras análises direcionadas. Dois métodos populares são a análise de componentes principais
(PCA do inglês principal component analysis) e a projeção de mínimos quadrados para
estruturas latentes (PLS do inglês projection to latent structures). PCA e PLS visam diferenciar
classes em conjunto de dados complexos (WORLEY, POWERS, 2013).

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral
▪

Analisar o perfil metabólico intestinal de pacientes com Doenças Inflamatórias

Intestinais e associar com perfil inflamatório identificado pelos níveis de Calprotectina Fecal.

3.2 Objetivos específicos
▪

Caracterizar o grau de atividade da Doenças Inflamatórias Intestinais com

biomarcadores – calprotectina e metabólitos fecais;
▪

Descrever e analisar o perfil metabólico intestinal dos pacientes com Doenças

Inflamatórias Intestinais ;
▪

Avaliar a relação entre Calprotectina Fecal e os metabólitos intestinais.

4. METODOLOGIA

4.1 Caracterização do estudo
Estudo tipo analítico transversal com amostragem por conveniência.

4.2 Critérios de elegibilidade
Critérios de inclusão:
Pacientes diagnosticados com DII acompanhados no ambulatório de Coloproctologia do
Hospital Universitário da Universidade Federal de Alagoas, de ambos os sexos, sem restrição
de idade, que concordaram em assinar o TCLE (APÊNDICE A) e TALE (APÊNDICE B).
Critérios de exclusão:
Pacientes com diagnóstico de outras colites não incluídas nas DII;
Pacientes submetidos a procedimento cirúrgico gastrointestinal nos últimos seis meses;
Pacientes que fizeram uso de antibióticos nos últimos três meses;
Pacientes em infecção vigente por vírus ou bactérias de qualquer origem;
Pacientes gestantes, lactantes ou puérperas.
Pacientes oncológicos e tabagistas.

4.3 Métodos
Foram selecionados pacientes com DII que foram submetidos a um questionário para
avaliação clínica, e colhida uma amostra fecal para análise da metabolômica e da CF.

4.3.1 Dados pessoais e clínicos
Colhidos através de um formulário clínico (APÊNDICE C).

4.3.2 Avaliação Bioquímica
Foram analisados valores da CF, processados no aparelho BÜHLMANN Quantum
Blue®, classificada como alterada quando maior ou igual a 200μg/g de fezes, valor com alto
valor preditivo positivo para doença intestinal (BJARNASON et al., 2017). As amostras de
fezes são colocadas em tubo de extração e diluídas com solução do kit da BÜHLMANN fCAL®
a 1:16 com tampão de extração. A mistura é agitada em vórtex por um minuto e centrifugada a

3000 x g / cinco minutos. A solução final é então analisada no aparelho por um período de 15
minutos com resultado da concentração quantitativa da proteína.
4.3.3 Avaliação da metabolômica
Análise dos Compostos Voláteis Orgânicos (CVOs):
CVOs presentes nas fezes dos doadores serão analisadas pela técnica de GC-MS/SPME,
conforme descrito por Ahmed e cols. (2016):
(1) Uma alíquota de 2g de fezes foi colocada em um tubo recipiente com headspace de
18mL (Agilent) com septo de silicone/polytetrafluoroetileno e armazenado a 20ºC até análise.
As amostras colocadas em banho-maria a 60 °C por 1 h. CVOs foram extraídos por 10 min
usando fibra pré-condicionada no cartucho de SPME (revestida de Carboxeno /
polydimethylsiloxano) exposta ao headspace, logo acima das fezes.
(2) Análise dos CVOs consistiu em três passos principais, sendo, primeiramente,
adsorção dos voláteis em cartuchos adsorventes, seguida de desadsorção térmica e análises por
GC-MS.
(3) Após sua obtenção, os CVOs foram termicamente desadsorvidos dos cartuchos de
SPME por transferência imediata e diretamente para dentro da porta de injeção (220 °C) do
GC-MS. O injetor é operado no modo splitless. A temperatura do forno foi programada assim:
40°C por 2 min, aumento de 6 °C/min até 220 °C, mantido por 4 min levando a um total de
corrida de 36 min. Hélio é o gás de arraste, usado em velocidade linear constante de 35 cm/s.
O GC-MS gera um cromatograma com picos representando os compostos individualmente.
(4) A identificação dos compostos é feita com uso da biblioteca existente no software
do GC-MS e comparada aos dados existentes no portal da metabolomica hmdb.ca. Os valores
das áreas obtidas serão utilizados para as análises estatísticas.

Análises Estatísticas dos dados de GC-MS:
A plataforma

online

MetaboAnalyst 5.0

(gratuitamente

disponibilizada no

https://www.metaboanalyst.ca) foi utilizada para realização de toda a análise estatística que
requer suporte computacional, pois além de ser um software livre, tem precisão numérica,
contribui para reprodutibilidade na ciência e seu uso é amplamente difundido e recomendado
para esse fim. Os dados dos cromatogramas obtidos por GC foram convertidos em uma matriz
de dados usando o software Chromeleon 7.2 (programa do equipamento). Regiões contendo
sinais de inferentes foram excluídas da análise. As concentrações dos metabólitos identificados
foram normalizadas pela mediana, seguido da transformação de dados em escala logarítmica

(base 10) e o dimensionamento de dados pela escala de Pareto. Foram realizadas análises
supervisionadas de Análise Discriminante por Mínimos Quadrados Parciais (PLS-DA) para
identificar os metabólitos discriminantes entre os grupos de amostras de fezes. O PLS-DA é um
método supervisionado que prevê a associação de classes através de informações obtidas por
técnicas de regressão multivariada. Calculamos as variações dos metabólitos das amostras
através da variável na projeção (VIP); essa é uma medida de importância variável no PLS-DA.
A VIP é uma soma ponderada de quadrados de cargas PLS levando a variação de cada
dimensão. Os escores VIP são calculados para cada componente separadamente. Neste estudo,
foram consideradas como significativas as medidas VIP acima de 2,0.
Análises Estatísticas dos dados da calprotectina fecal:
Para análise estatística da associação entre calprotectina fecal e os tipos de DII foi
realizado teste de qui-quadrado utilizando o pacote estatístico SPSS v21, sendo a significância
determinada quando p<0,05.

4.4 Considerações Éticas
Esta pesquisa está aprovada pelo Comitê de Ética e Pesquisa (CEP) da Universidade
Federal de Alagoas, de acordo com a Resolução no 466/12 do Conselho Nacional de Saúde,
com número 2725386.

5. PRODUTO
Artigo submetido ao periódico International Journal of Colorrectal Disease
Título: PROFILE OF INTESTINAL METABOLITES IN INDIVIDUALS WITH INFLAMMATORY BOWEL
DISEASE, according to the guidelines of the International Journal of Colorrectal Disease (ANEXO A).
Lucas C Lins ₁, Fabiana A Moura ₁, Manoel Álvaro ML Neto ₁
₁ Federal University of Alagoas, Brazil

Author information: Lucas Correia Lins, E-mail: lucascorreialins@gmail.com
Adress: Av. Julio Marques Luz, 877, Jatiuca, Maceió, Alagoas, Brazil

ABSTRACT
Purpose: Inflammatory Bowel Disease (IBD) presents as a condition of autoimmune origin and without known
etiology. The two major types of IBD are Crohn's disease (CD) and ulcerative colitis (UC). Clinical symptoms,
imaging tests, and colonoscopy are the most common techniques for IBD diagnosis. Usually, we use fecal
calprotectin to follow up on the disease activity as a biological marker. Another possible pathway with the
potential to identify biomarkers for follow-up is metabolomics. This analytical technique is part of the omics
sciences and seeks to analyze the metabolites present in biological media and can be used to identify pathological
factors. We propose investigating the fecal metabolomics profile of patients with IBD and correlating it with
disease activity by fecal calprotectin levels.
Methods: Observational, cross-sectional, convenience study with a sample of patients with IBD. Clinical data
were collected, and fecal calprotectin measurements were performed to assess disease activity. We extract fecal
metabolomics through mass spectrometry using the GC-MS technique. The patients with active disease were those
with calprotectin greater than 200μg/g. We used MetaboAnalyst 5.0 software with multivariate analysis to analyze
fecal metabolomics.
Results: 52 patients were analyzed (n=29 with IUC and n=23 with CD). Inflammatory activity was identified in
36 (69.2%) patients. Fifty-six metabolites were identified through fecal metabolomics. In our population study,
the most sensitive metabolites to differentiate CD from CU were: hexadecanoic acid, squalene, and octadecanoic
acid. The metabolites that best correlated with disease activity among patients with CU were octadecanoic acid,
11-hexadecen-1, hexadecanoic acid and pentadecanone. Among patients with CD, the metabolites were
octadecanoic acid, cyclodecasilloxona, oleic-1 acid and cyclopentadecanoic. Octadecanoic acid, 11-hexadecen1, pentadecanone, and oleic-2 acid were the most sensitive to assess a higher degree of disease activity between
CU and CD.
Conclusion: Metabolomics can be used as a non-invasive test in the workup of inflammatory bowel disease,
helping diagnose and identify disease activity.
Keywords: Crohn's disease; ulcerative colitis; omics; fecal metabolites; fecal calprotectin.

INTRODUCTION:
Inflammatory bowel disease (IBD) refers mainly to Crohn's Disease (CD) and ulcerative colitis (UC),
which is a chronic disease that causes inflammation in the gastrointestinal tract and extra-intestinal complications
[1]. People with suspected IBD are screened for flares and inflammation by measuring fecal calprotectin, a marker
for neutrophilic intestinal inflammation. However, calprotectin is a non-specific inflammatory marker (sensitivity
83%, specificity 60%), and the definitive diagnosis is made on biopsies collected through colonoscopy, which
carries a risk of pain, bleeding, and perforation. The etiology is unknown, but the interaction between genetics,
immunological and environmental factors contribute to its development [2, 3].
Clinically, CD and UC present with exacerbations and remissions of inflammation and have similar
symptoms, such as abdominal pain, diarrhea, and weight loss; however, they may differ in extent, location,
complications, and prevalence [1, 2].
Studies point to an increase in the incidence and prevalence globally [4], with an incidence ranging from
10 to 20 cases per 100,000 inhabitants in developed countries, the prevalence is more significant than 20 cases
per hundred. Thousand inhabitants [5]. In Brazil, there are no national records on the incidence and prevalence
of IBD, but specific studies estimate a prevalence of 14.8/100,000 for CD in the state of São Paulo. In the North
and Northeast regions, it is still a less prevalent disease, but there is a growing increase in outpatient visits and
hospital admissions [6].
The costs for the health system are considered high and are due to multiple factors such as medications,
hospitalization, surgeries, and absenteeism from work [7]. Canadian data from 2012 showed that more than 1.2
billion Canadian dollars were spent this year on drugs to treat IBD and 395 million on hospitalizations. In that
same year, between 4.5 and 5.6 billion euros were spent in Europe to treat the disease [8].
IBD represents a significant public health problem, affecting work activities, productivity, and social life
and interfering with patients' quality of life. Its treatment aims at clinical, endoscopic, and histopathological
remission through a complex approach, including non-pharmacological (psychological, nutritional, etc.) and
pharmacological

(immunosuppressant,

anti-inflammatory,

immunobiological,

etc.)

traditional-surgical

intervention [1 ,3].
The gastrointestinal tract has the most significant number and diversity of microorganisms in the human
body, particularly the intestinal microbiota, which exerts a considerable influence on body homeostasis [9]. Thus,
maintaining the balance of this environment, eubiosis prevents the proliferation of pathogenic microorganisms by
competition, thus preventing infection by these agentes [10].
In this context, intestinal dysbiosis is closely related to the pathogenesis and clinical complications of
IBD. However, it is still not possible to distinguish whether this dysbiosis is a cause or a consequence of the disease
[11]. Thus, several therapies to interfere with this imbalance have been investigated [12, 13].
For the diagnosis of IBD, in addition to clinical evaluation, invasive and costly measures are used, such
as colonoscopy and histopathological evaluation, which cause discomfort to patients. Due to this, in recent years,
studies have been carried out to find a laboratory marker of high sensitivity and specificity for non-invasive
diagnosis and monitoring of these diseases [14]. Traditional serum tests, such as erythrocyte sedimentation rate,
C-reactive protein, leukocytes, platelets, and albumin, as they express a systemic inflammatory response, are not
specific for IBD. On the other hand, fecal calprotectin (FC) has been presented as an effective, low-cost, and highreproducibility marker, both for the diagnosis and for the follow-up/monitoring of IBD [15].

FC is calcium and zinc-binding protein derived from neutrophils and monocytes. It is detected in body
fluids such as blood, urine, stool, and tissue samples. FC is used in the workup of IBD, being a promising noninvasive biomarker compared to other laboratory markers [15] It presents sensitivity and specificity of 88.6 and
97.1, respectively, when compared to endoscopic staging and histological analysis in IBD [16].
Another possible route to identify biomarkers for monitoring IBD in the surveillance of clinical
exacerbations is metabolomics [17]. This analytical technique is part of the omics sciences and seeks to analyze
the metabolites present in biological media and can be used to detect subclinical inflammatory activity in
asymptomatic patients [15]. One study demonstrates a sensitivity of 70% and specificity of 92% in assessing
endoscopic activity with a FC cut-off of 200μg/g of stool [18].
FC correlates with the top endoscopic assessment scores used in clinical practice (SES-CD, UCIS, and
Mayo) more than non-specific inflammatory parameters such as CRP and blood count [15].
An interpretation of molecular complexity in human diseases is made at several levels (genome,
epigenome, transcriptome, proteome, and metabolome), called multi-omics. The availability of multi-omics study
and data revolutionizes the field of medicine and biology, promoting several avenues of integrated approaches
[15].
Metabolomics analyzes metabolites present in cells, tissue, or fluids, focusing on biomarker studies.
Metabolites are products of cellular processes, and changes are assumed to reflect changes in the function of
enzymes and mediating proteins. The analytical techniques of metabolomics consist of gas (GC) or liquid (LC),
mass spectrometry (MS), and magnetic resonance imaging (MRI) [15].

METHODOLOGY:
This research was approved by the Research Ethics Committee (CEP) of the Federal University of
Alagoas, following Resolution 466/12 of the National Health Council, CAAE 55813816.2.0000.5013.
Fifty two patients were analyzed (n=29 with UC and n=23 with CD) . These patients were selected and
submitted to a questionnaire for clinical evaluation, and get a fecal sample for analysis of metabolomics and FC.
FC values were analyzed, processed in the BÜHLMANN Quantum Blue® device, and classifing as
altered when greater than or equal to 200μg/g of feces, a value with a high positive predictive value for intestinal
disease (BJARNASON et al., 2017). Stool samples are placed in an extraction tube and diluted with 1:16
BÜHLMANN fCAL® kit solution with extraction buffer. The mixture is vortexed for one minute and centrifuged
at 3000 x g / five minutes. The final solution is then analyzed in the instrument for 15 minutes due to the quantitative
concentration of the protein.
Analysis of Volatile Organic Compounds (VOCs):
CVOs present in the feces of donors will be analyzed by the GC-MS/SPME technique, as described by
Ahmed et al. (2016):
(1) A 2g aliquot of stool was placed in an 18mL headspace recipient tube (Agilent) with
silicone/polytetrafluoroethylene septum and stored at 20°C until analysis. The samples were placed in a water
bath at 60 °C for one h. CVOs were extracted for 10 min using preconditioned fiber in the SPME cartridge
(Carboxene/polydimethylsiloxane coated) exposed to the headspace, just above the feces.
(2) Analysis of CVOs consisted of three main steps being, first, adsorption of volatiles in adsorbent cartridges,
followed by thermal desorption and analysis by GC-MS.

(3) After being obtained, the CVOs were thermally desorbed from the SPME cartridges by immediate transfer
directly into the injection port (220 °C) of the GC-MS. The injector is operated in splitless mode. The oven
temperature was programmed as follows: 40°C for 2 min, increase of 6°C/min to 220°C, held for 4 min leading
to a full run of 36 min. Helium is the carrier gas used at a constant linear velocity of 35 cm/s. The GC-MS generates
a chromatogram with peaks representing individual compounds.
(4) The identification of compounds is done using the existing library in the GC-MS software and compared to the
current data on the metabolomic portal hmdb.ca. The values of the areas obtained will be used for the statistical
analyses.
Statistical Analysis of GC-MS data:
The online platform MetaboAnalyst 5.0 (available free of charge at https://www.metaboanalyst.ca) was
used to carry out all the statistical analysis that requires computational support and is free software. It has
numerical precision, contributing to reproducibility in science. And its use is widespread and recommended for
this purpose. The chromatogram data obtained by GC were converted into a data matrix using Chromeleon 7.2
softwares (equipment program). Regions containing inferential signals were excluded from the analysis.
The concentrations of the identified metabolites were normalized by the median, followed by the
transformation of data in a logarithmic scale (base 10) and the scaling of data by the Pareto scale. Supervised
Partial Least Squares Discriminant Analysis (PLS-DA) analyzes were performed to identify discriminating
metabolites between groups of stool samples. PLS-DA is a supervised method that predicts the association of
classes through information obtained by multivariate regression techniques.
We calculated the variations of the metabolites of the samples through the variable importance on
projection (VIP); this is score is a weighted sum of squares of the PLS loadings that considers the amount of
explained Y-variance of each component . In this study, VIP measurements above 2.0 were considered significant.

RESULTS
Fifty two patients with IBD, 29 UC, and 23 DC. Of these patients, 38 are women and 14 men, with a
mean age of 41 years, the youngest being 12 years old and the oldest being 69 years old. 36 patients (69.2%) had
fecal calprotectin elevate.There was no statistical difference between the prevalence of inflammation detected by
FC levels and the type of IBD (p>0.05).
Seventy-four metabolites were found through the mass spectrometry library (Chromeleon 7.2).
Metabolites were compared with data in the Human Metabolome Database (available at https://hmdb.ca), 18 of
which were unidentified (Unknown). The 56 identified metabolites were: p-cresol, 2-undecanone, undecanal,
indoleacetic acid, ethyl decanoate, ethyl-heptane, squalene, 1-decene, naphthalene, pentadecane, trimethyldodecathyene, tetradecanal, dodecanoic acid, dodecanoic-ethyl acid -ester, methyl amine, hexadecane,
cyclooctasiloxane, dodecanol, trimethyl amine, pentadeicin, pentadecanone, nonadecene, tridecan-1-ol, tricosene,
tetradecanoic acid, undecanone, pentadecanoic acid, hexadecanol, heptadecanone, skelene, pentadecanal,
cyclodecasiloxone, docosene, acid hexadecanoic acid, palmitic acid, 9-octadecenal, cis-11-hexadecenal,
octadecenal, 9-Octadecen-1-ol, linoleoyl chloride, octadecanol, oleic acid, cis-9-hexadecenal, octadecanoic acid,
11-hexadecen-1-ol , cyclononasiloxane, 1-hexadecanol, cyclopentadecane, heptacosane, cyclodecasiloxane,
octadecane, docosane, 11-butyl-, quantacure ITX, heptacosane, octacosane.

Figure 1 shows the result of the partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) of samples between
DC and UC. The points on the graph represents the metabolic profile of each patient. Thus, patterns of separation
can be seen in the data sets. There are patients with distinct profiles between UC and CD, and some in intersection
areas where there are metabolites with variations in common between the two groups. The method has good
accuracy (0.60) in groups of up to five primary metabolites.
The VIP score classification of the components of the CD and UC groups is shown in Figure 1. It includes
the most significant variations of metabolites that discriminate the UC and CD groups by the PLS-DA. Considering
necessary VIP measurements above 2.0 as pre-established in the methodology of the work, the metabolites found
were (highest score in the group UC): hexadecanoic acid, skelene, and octadecanoic acid. These three mentioned
metabolites were used to discriminate the groups through the ROC curve. The area under the curve (ACU) of the
model was 0.765 (95% CI 0.35, 1.0).

The relationship between the fecal calprotectin and the UC group was performed by PLS-DA, and the
patterns of separation between the groups with (FC greater than 200μg/g) and without (FC less than 200μg/g)
disease activity, are n shows the discriminating result between the group in Figure 2, The separation standards
for the datasets showed good accuracy (0.65). The main metabolites found in this analysis were: octadecanoic
acid (highest score in the group > 200), 11-hexadecen-1 (highest score in the group < 200), hexadecanoic acid
(highest score in the group > 200), and pentadecanone (highest score in the group < 200). The ROC curve using
such metabolites has resulted in an ACU of 0.77 within the confidence interval (95% CI 0.37, 0.98). We consider
that disease activity in can be identified by metabolomics, with the presence of octadecanoic acid and
hexadecanoic acid.

In patients with CD, the analysis by PLS-DA by evaluating remission and disease activity by the FC value
shows a pattern of separation with a distinction between groups. The separation standards for the datasets showed
good accuracy (0.60). Figure 3 shows metabolites that differentiate disease activity in CD. Using the VIP:
octadecanoic acid (highest score in the group > 200), cyclodecasiloxone (highest score in the group < 200), oleic
acid-1 (highest score in the group < 200), and cyclopentadecanoic acid (highest score in the group > 200). The
ROC curve, using such metabolites, shows ACU 0.85 within the confidence interval (95% CI 0-1). Octadecanoic
acid, as in the CD group, is the most relevant metabolite in patients with disease activity (FC greater than
200µg/g).

DISCUSSION
We analyzed patients' metabolic profile of IBD and its subtypes (CD and UC). We known that the
metabolites produced by the intestinal microbiota provide information about metabolism and its products, having
important clinical outcomes [19]. Authors identified mechanistic and causal relationships between bacteria and
metabolites that were abundant in IBD [20]. Analyzes of metabolites are usually performed by fecal samples,
urine, and plasma, not requiring invasive procedures [19]. In our study, the analysis was performed on fecal
samples by mass spectrometry using the GC-MS technique, and a signature of the IBD metabolome was identified,
with differences in the patterns of the metabolites for CD andUC. Other research has already demonstrated
statistical differences between the metabolites in IBD; one of them showed 14 metabolites among fecal samples
from 68 patients with UC and 13 with CD [19]. In another study, using a multivariate approach between fecal
samples in IBD, discrimination between patients with CD andUCI was demonstrated [21].
In our study we identify different metabolites in CD and UC that differentiated one each other in:
hexadecanoic acid, skelene and octadecanoic acid. Studies show increased levels of primary bile acids, α-amino
acids and sphingolipids in patients with IBD. There is also a decrease in several metabolic groups, such as
cholesterol, phenylbenozodiaxanes, indoles, tetrapyrroles and long-chain fatty acids [20]. Differences were
identified in the metabolites of fecal samples, serum and mucosa from patients with IBD compared to healthy
subjects, with elevated taurine and cadaverine levels in UC, and carnosine, ribose and choline correlated with
inflammation (identified by FC).
For ileal CD, tryptophan, bile acids and unsaturated fatty acids showed considerable increase There is
also a decrease in several metabolic groups, such as cholesterol, phenylbenozodiaxanes, indoles, tetrapyrroles,
and long-chain fatty acids [20]. Different metabolites were identified in the fecal samples, serum, and mucosa
from patients with IBD compared to healthy subjects, with elevated taurine and cadaverine levels in UC,
carnosine, ribose, and choline correlated with inflammation (identified by FC). For ileal CD, tryptophan, bile
acids, and unsaturated fatty acids showed a considerable increase [22]. There was no similarity between the
metabolites described in these studies and those found in our work..There was no similarity between the
metabolites described in these studies and those found in our work because we lost some material, which may have
contributed to the divergence of results.[22].
IBD-related inflammation promotes variations in the metabolome. This hypothesis was confirmed by
correlating the metabolite profile variation with FC, a biomarker of disease activity and inflammation [20].
Patients in remission have microbiomes and metabolomes similar to their healthy first-degree relatives [22]. In
line with the findings in the literature in the present study, we were able to assign a metabolomic signature to
patients in disease activity and remission, both in CD and UC. Active CD, octadecanoic acid, cyclopentasiloxane,
oleic-1 and cyclo pentadecanoic acid were the metabolites with the most significant variation in patients in
remission; in the UC, octadecanoic acid, 11-hexadecen-1, hexadecanoic acid, and pentadecanone were the most
commonly found metabolites. However, it is essential to remember that the associations of disease staging with
metabolome do not necessarily imply a causal relationship. Other factors can induce metabolites, such as eating
habits [19]. Due to these variations, some patients change from what would be expected for their metabolite
profile.
There is a relationship between host disease, microorganisms, and metabolites; however, questions about
the change in physiology and the impact of metabolites on the intestinal flora need to be studied. The works usually

perform a metabolome combination and analyze a small subset of already known molecules. Most metabolites are
uncharacterized, but there is potential to identify new disease-associated molecules. The computational approach
plays a vital role in prioritizing associations of microbial metabolism and its relationship with diseases. Thus,
therapeutic approaches can inhibit the microbial metabolism associated with the disease or increase beneficial
metabolites and their corresponding microorganisms, such as probiotic treatment and intestinal microbiota
transplantation (IMT) [22].
Future perspectives:
IMT is used in cases of Clostridium difficile infection, in which an altered bile acid profile is observed,
similar to patients with active IBD. These metabolites, after transplantation, could be restored, a well-established
treatment in the literature. Although this similarity in metabolic variation, transplantation in IBD is not
consensual. TMF can be used to induce remission of UC. A 2018 study demonstrated that patients' microbial and
metabolomic profiles changed, moving towards the donor. There was a reduction in acetate levels and an increase
in bupirate levels after transplantation [20]. Although the metabolites found in our study differ from the most
relevant ones in the literature, we were able to attribute the metabolic signature of the groups, being able to
attribute to metabolomics, a follow-up examination in IMT therapy.

CONCLUSION:
The main biomarkers found in IBD were: hexadacanoic acid, squalene and octadecanoic acid. In CUI,
the biomarkers that assess disease activity and remission are octadecanoic acid, cyclodecasiloxone, oleic acid-1,
and cyclopentadecanoic acid. While in CD, the biomarkers found were: octadecanoic acid, cyclodecasiloxone,
oleic acid-1, and cyclopentadecanoic acid. In this way, metabolomics can be an alternative to evaluate the
inflammatory activity similar to what we currently use FC, but more studies are needed to prove the method's
effectiveness.

REFERÊNCIAS
1.
2.
3.

PILLAI, Nadia et al. A systematic review of cost-effectiveness studies comparing conventional biologial ans
surgical interventions for inflammatory bowel disease PloS one v. 12, n. 10, p e0185500, 2017.
VENNOU, Konstantina E. et al. Multiple outcome meta-analysis of gene-expression data in inflammatory
bowel disease. Genomics, v. 112, n. 2, p. 1761-1767, 2020.
URBANO, Ana Paula Signori, et al. Associations among body composition, inflammatory profile and disease
extent in ulcerative colitis patients. Revista da Associação Médica Brasileira, v. 64, p. 133-139, 2018.

11. VERMEIRE, S. M.; KRISTIN, J. et al. Donor species richness determines the success of fecal microbiota
transplantation in inflammatory bowel disease
12. CAMMAROTA, Giovanni, et al. Gut microbiota modulation: probiotics, antibiotics or fecal microbiota
transplantation?. Internal and emergency medicine, v. 9, n. 4, p. 365-373, 2014.
13. ISHIKAWA, Hideki, et al. Beneficial effects of probiotic bifidobacterium and galacto-oligosaccharide in
patients with ulcerative colitis: a randomized controlled study. Digestion, v. 84, n. 2, p. 128-133, 2011.
14. KHAKI-KHATIBI, Fatemeh, et al. Calprotectin in inflammatory bowel disease. Clinica chimica acta, v. 510,
p. 556-565, 2020.
15. ROKKAS, Theodore; PORTINCASA, Piero; KOUTROUBAKIS, Ioannis E. Fecal calprotectin in assessing
inflammatory bowel disease endoscopic activity: a diagnostic accuracy meta-analysis. Journal of
Gastrointestinal & Liver Diseases, v. 27, n. 3, 2018.
16. VIEIRA, Andrea, et al. Inflammatory bowel disease activity assessed by fecal calprotectin and lactoferrin:
correlation with laboratory parameters, clinical, endoscopic and histological indexes. BMC research notes,
v. 2, n. 1, p. 1-7, 2009.
17. KESHTELI, Ammar Hassanzadeh, et al. Dietary and metabolomic determinants of relapse in ulcerative colitis
patients: a pilot prospective cohort study. World Journal of Gastroenterology, v. 23, n. 21, p. 3890, 2017.
18. BJARNASON, Ingvar. The use of fecal calprotectin in inflammatory bowel disease. Gastroenterology &
Hepatology, v. 13, n. 1, p. 53, 2017.
19. DE PRETER, Vicky et al. Faecal metabolite profiling identify medium-chain fatty acids as discriminating
compounds in IBD. Gut, v. 64, n. 3, p. 447-458, 2015.
20. LAVELLE, Aonghus; SOKOL, Harry. Gut microbiota-derived metabolites as key actors in inflammatory
bowel disease. Nature Reviews Gastroenterology & hepatology, v. 17, n. 4, p. 223-237, 2020.
21. MARCHESI, Julian R. et al. Rapid and noninvasive metabonomic characterization of inflammatory bowel
disease. Journal of proteome research, v. 6, n. 2, p. 546-551, 2007.
22. SCHIRMER, Melanie, et al. Microbial genes, and pathways in inflammatory bowel disease. Nature Reviews
Microbiology, v. 17, n. 8, p. 497-511, 2019.

6. DISCUSSÃO

No nosso estudo, analisamos o perfil metabólico na DII e seus subtipos (DC e CUI).
Sabe-se que os metabólitos produzidos pela microbiota intestinal fornecem informações sobre
o metabolismo e seus produtos, tendo importância para desfechos clínicos (DE PRETER et al.,
2015). Autores identificaram relações mecanicistas e causais entre bactérias e metabólitos que
eram abundantes na DII. (AONGHUS et al., 2020). As análises dos metabólitos geralmente são
realizadas por amostras fecais, urina e plasma, não sendo necessário procedimentos invasivos
(DE PRETER et al., 2015). Em nosso trabalho, a análise foi realizada em amostras fecais por
espectrometria de massas pela técnica GC-MS, sendo identificada uma assinatura do
metaboloma da DII, com diferenças nos padrões dos metabólitos para a DC e para a CUI. Outras
pesquisas já demonstraram diferenças estatísticas entre os metabólitos na DII; uma delas
apresentou 14 metabólitos entre amostras fecais de 68 pacientes com CUI e 13 com DC (DE
PRETER et al., 2015). Em outro estudo, utilizando de abordagem multivariada entre amostras
fecais na DII, demonstrou-se discriminação entre pacientes com DC e CUI (MARCHESI et al.,
2007).
Os principais metabólitos encontrados em nosso trabalho na diferenciação da DC da
CUI foram: ácido hexadecanóico, esqueleno e ácido octadecanoico. Estudos mostram aumento
dos níveis de ácidos biliares primários, α-aminoácidos e esfingolipídios em pacientes com DII.
Há

também

diminuição

vários

grupos

metabólicos,

como

colesterol,

fenilbenozodiaxanos, indois, tetrapirróis e ácidos graxos de cadeia longa (AONGHUS et al.,
2020). Foram identificadas diferenças nos metabólitos de amostras fecais, soro e mucosa de
paciente com DII em comparação a indivíduos saudáveis, com níveis de taurina e cadaverina
elevados na CU, e carnosina, ribose e colina correlacionados com inflamação (identificada pela
CF). Para DC ileal, o triptofano, ácidos biliares e ácidos graxos insaturados apresentaram
aumento considerável (MELANIE et al., 2019). Não houve semelhança entre os metabólitos
descritos nesses estudos e os encontrados em nosso trabalho. Acredita-se que a perda do nosso
material analisado, impossibilitando a análise de cadeias lipídicas, pode ter contribuído para a
divergência de resultados.
A inflamação relacionada a DII promove variações no metaboloma. Essa hipótese foi
confirmada correlacionando a variação do perfil metabólito com a CF, que é um biomarcador
de atividade de doença e inflamação (AONGHUS 2020). Os pacientes em remissão de doença
apresentam microbiomas e metaboloma semelhante a seus parentes sadios de primeiro grau

(MELANIE 2019). Em consonância com os achados da literatura na presente pesquisa,
conseguimos atribuir uma assinatura metabolômica para os pacientes em atividade de doença e
em remissão, tanto na DC quanto na CUI. Na DC em atividade, o ácido octadecanoico, a
ciclodecasiloxona, o ácido oleico-1 e o ciclopentadecanoico foram os metabólitos com maior
variação em relação aos pacientes em remissão; já na CUI foram o ácido octadecanoico, 11hexadecen-1, ácido hexadecanoico e a pentadecanona os metabólitos mais encontrados.
Contudo, é importante lembrar que as associações do estadiamento da doença com
metaboloma não implicam necessariamente numa relação causal. Os metabólitos encontrados
podem ser induzidos por outros fatores, como, por exemplo, hábitos alimentares (DE PRETER
et al., 2015). Supõe-se que, devido a essas variações, alguns pacientes fujam do que seria
esperado para o seu perfil metabólito.
Existe relação entre doença do hospedeiro, microorganismos e metabólitos; porém
questões sobre a alteração da fisiologia e o impacto dos metabólitos na flora intestinal precisam
ser estudadas. Os trabalhos geralmente realizam uma combinação do metaboloma e analisam
um pequeno subconjunto de moléculas já conhecidas. A maioria dos metabólitos não são
caracterizados, porém há potencial para identificar novas moléculas associadas a doenças. A
abordagem computacional tem um papel importante na priorização de associações do
metabolismo microbiano e sua relação com as doenças. Com isso, abordagens terapêuticas
podem ser utilizadas na inibição do metabolismo microbiano associado à doença, ou que
aumentam metabólitos benéficos e seus microorganismos correspondentes, como o tratamento
com probióticos e o transplante de microbiota intestinal (TMI) (MELANIE et al., 2019).

Perspectivas futuras
O TMI é uma proposta terapêutica para a DII. Ele é utilizado nos casos de infecção por
Clostridium difficile, em que se percebe um perfil de ácidos biliares alterados, semelhantes a
pacientes com DII em atividade. Esses metabólitos são restaurados após transplante de forma
eficaz, sendo um tratamento já bem estabelecido na literatura. Embora exista essa semelhança
da variação metabólica, o transplante na DII não é consensual. TMF pode ser utilizado na
indução da remissão da CUI. Um estudo de 2018 demonstrou que o perfil microbiano e
metabolômico dos pacientes modificaram, movendo-se em direção ao doador. Houve uma
redução nos níveis de acetato e aumento dos níveis de bupirato nos pós transplante (AONGHUS
et al., 2020). Embora os metabólitos encontrados no nosso estudo divirjam dos mais relevantes

na literatura, conseguimos atribuir uma assinatura metabólica dos grupos, podendo atribuir à
metabolômica um exame de acompanhamento na terapêutica do TMI.

7. CONCLUSÃO

Os principais biomarcadores encontrados na DII foram: o ácido hexadacanóico, o
esqualeno e o ácido octadecanóico. Na CUI os biomarcadores que se destacam para avaliar
atividade e remissão da doença são: o ácido octadecnóico, ciclodecasiloxona, ácido oleico-1 e
o ciclopentadecanóico. Enquanto na DC os biomarcadores encontrados foram: ácido
octadecanóico, ciclodecasiloxona, ácido oleico-1 e o ciclopentadecanóico. Houve uma
correlação entre a CF acima de 800µg/g e a presença dos biomarcadores: ácido octacanóico,
11-hexadecen-1, pentadecanona e ácido oléico-2.
Desta forma a metabolômica pode ser uma alternativa para avaliar a atividade
inflamatória semelhante ao que utilizamos atualmente (a CF), porém são necessários mais
estudos para comprovar a eficácia do método.

REFERÊNCIAS
1.

BARROS, Petrille André Cavalcante de; SILVA, Alberson Maylson Ramos da; LINS NETO, MÁdf. The
epidemiological profile of inflammatory bowel disease patients on biologic therapy at a public hospital in
Alagoas. Journal of Coloproctology (Rio de Janeiro), v. 34, p. 131-135, 2014.
2. BJARNASON, Ingvar. The use of fecal calprotectin in inflammatory bowel disease. Gastroenterology &
hepatology, v. 13, n. 1, p. 53, 2017.
3. BJERRUM, Jacob Tveiten et al. Metabonomics of human fecal extracts characterize ulcerative colitis, Crohn’s
disease and healthy individuals. Metabolomics, v. 11, n. 1, p. 122-133, 2015.
4. CAMMAROTA, Giovanni et al. Gut microbiota modulation: probiotics, antibiotics or fecal microbiota
transplantation?. Internal and emergency medicine, v. 9, n. 4, p. 365-373, 2014.
5. Clinical protocol and Therapeutic guidelines (PCDT) of Crohn’s didease 2017. Ministry of Health –
Department of health care Joint Ordinance Nº 14.
6. D'ODORICO, Irene et al. Role of fecal microbiota transplantation in inflammatory bowel disease. Journal of
digestive diseases, v. 19, n. 6, p. 322-334, 2018.
7. DE PRETER, Vicky et al. Faecal metabolite profiling identifies medium-chain fatty acids as discriminating
compounds in IBD. Gut, v. 64, n. 3, p. 447-458, 2015.
8. FIOCCHI, C; PEREIRA, H. S. S. Intestinal microbiota – Its importance and function. Brazilian Journal of
Medicine, v. 100, p. 30-38, 2012.
9. FIORI, Jessica et al. Assessment of gut microbiota fecal metabolites by chromatographic targeted
approaches. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, v. 177, p. 112867, 2020.
10. GALLAGHER, Kate et al. Metabolomic analysis in inflammatory bowel disease: a systematic review. Journal
of Crohn's and Colitis, v. 15, n. 5, p. 813-826, 2021.
11. GEVERS, Dirk et al. The treatment-naive microbiome in new-onset Crohn’s disease. Cell host & microbe, v.
15, n. 3, p. 382-392, 2014.
12. HANG, Junjie et al. The joint effects of lifestyle factors and comorbidities on the risk of colorectal cancer: a
large Chinese retrospective case-control study. PloS one, v. 10, n. 12, p. e0143696, 2015.
13. ISHIKAWA, Hideki et al. Beneficial effects of probiotic bifidobacterium and galacto-oligosaccharide in
patients with ulcerative colitis: a randomized controlled study. Digestion, v. 84, n. 2, p. 128-133, 2011.
14. KAMAT, Nagesh et al. Cost of illness in inflammatory bowel disease. Digestive Diseases and Sciences, v. 62,
n. 9, p. 2318-2326, 2017.
15. KAPLAN, Gilaad G. The global burden of IBD: from 2015 to 2025. Nature reviews Gastroenterology &
hepatology, v. 12, n. 12, p. 720-727, 2015.
16. KESHTELI, Ammar Hassanzadeh et al. Dietary and metabolomic determinants of relapse in ulcerative colitis
patients: a pilot prospective cohort study. World Journal of Gastroenterology, v. 23, n. 21, p. 3890, 2017.
17. KHAKI-KHATIBI, Fatemeh et al. Calprotectin in inflammatory bowel disease. Clinica chimica acta, v. 510, p.
556-565, 2020.
18. LAVELLE, Aonghus; SOKOL, Harry. Gut microbiota-derived metabolites as key actors in inflammatory bowel
disease. Nature reviews Gastroenterology & hepatology, v. 17, n. 4, p. 223-237, 2020.
19. LOZUPONE, Catherine A. et al. Diversity, stability and resilience of the human gut microbiota. Nature, v. 489,
n. 7415, p. 220-230, 2012.
20. MACKNER, Laura M. et al. Fecal microbiota and metabolites are distinct in a pilot study of pediatric Crohn’s
disease patients with higher levels of perceived stress. Psychoneuroendocrinology, v. 111, p. 104469, 2020.
21. MADIGAN, Michael T. et al. Brock biology of microorganisms. Upper Saddle River, NJ: Pearson Prentice Hall,
2006.
22. MARCHESI, Julian R. et al. Rapid and noninvasive metabonomic characterization of inflammatory bowel
disease. Journal of proteome research, v. 6, n. 2, p. 546-551, 2007.
23. PARENTE, J. M. L. Demographic characteristics and clinical phenotypes of inflammatory bowel diseases in
Northastern Brazil. UNICAMP, 2014.
24. PILLAI, Nadia et al. A systematic review of cost-effectiveness studies comparing conventional, biological and
surgical interventions for inflammatory bowel disease. PloS one, v. 12, n. 10, p. e0185500, 2017.
25. PREIDIS, Geoffrey A.; VERSALOVIC, James. Targeting the human microbiome with antibiotics, probiotics, and
prebiotics: gastroenterology enters the metagenomics era. Gastroenterology, v. 136, n. 6, p. 2015-2031,
2009.
26. ROCCHI, Angela et al. Inflammatory bowel disease: a Canadian burden of illness review. Canadian Journal
of Gastroenterology, v. 26, n. 11, p. 811-817, 2012.

27. ROKKAS, Theodore; PORTINCASA, Piero; KOUTROUBAKIS, Ioannis E. Fecal calprotectin in assessing
inflammatory bowel disease endoscopic activity: a diagnostic accuracy meta-analysis. Journal of
Gastrointestinal & Liver Diseases, v. 27, n. 3, 2018.
28. SAIRENJI, Tomoko; COLLINS, Kimberly L.; EVANS, David V. An update on inflammatory bowel disease.
Primary Care: Clinics in Office Practice, v. 44, n. 4, p. 673-692, 2017.
29. SANTORU, Maria Laura et al. Cross sectional evaluation of the gut-microbiome metabolome axis in an Italian
cohort of IBD patients. Scientific reports, v. 7, n. 1, p. 1-14, 2017.
30. SCHIRMER, Melanie et al. Microbial genes and pathways in inflammatory bowel disease. Nature Reviews
Microbiology, v. 17, n. 8, p. 497-511, 2019.
31. SKELLY, Ashwin N. et al. Mining the microbiota for microbial and metabolite-based immunotherapies.
Nature Reviews Immunology, v. 19, n. 5, p. 305-323, 2019.
32. SOUZA, Mardem Machado de; BELASCO, Angélica Gonçalves Silva; AGUILAR-NASCIMENTO, José Eduardo de.
The epidemiological profile of patients with inflammatory Bowel disease in the State of Mato Grosso. Revista
Brasileira de Coloproctologia, v. 28, p. 324-328, 2008.
33. URBANO, Ana Paula Signori et al. Associations among body composition, inflammatory profile and disease
extent in ulcerative colitis patients. Revista da Associação Médica Brasileira, v. 64, p. 133-139, 2018.
34. VENNOU, Konstantina E. et al. Multiple outcome meta-analysis of gene-expression data in inflammatory
bowel disease. Genomics, v. 112, n. 2, p. 1761-1767, 2020.
35. VERMEIRE, S. M.; KRISTIN, J. et al. Donor species richness determines the success of fecal microbiota
transplantation in inflammatory bowel disease.
36. VIEIRA, Andrea et al. Inflammatory bowel disease activity assessed by fecal calprotectin and lactoferrin:
correlation with laboratory parameters, clinical, endoscopic and histological indexes. BMC research notes,
v. 2, n. 1, p. 1-7, 2009.
37. VINDIGNI, Stephen M.; SURAWICZ, Christina M. Fecal microbiota transplantation. Gastroenterology Clinics,
v. 46, n. 1, p. 171-185, 2017.
38. WILLEY, J. M., SHERWOOD, L. M.; WOOLVERTON, C. J. Nonspecific (innate) Host Resistance. Prescott’s
Principles of Microbiology. McGraw-Hill Higher Internacional Education, p. 656-677. 2009.

APÊNDICES
APÊNDICE A – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido – TCLE
Eu____________________________________________________, fui convidado(a) a
participar como voluntário (a) do estudo “Eficácia Clinica do Transplante da Microbiota
Intestinal em Pacientes com DIIs” recebi do Prof. Dr. Manoel Álvaro de Freitas Lins Neto,
chefe do Serviço de Coloproctologia do HUPAA-UFAL- Universidade Federal de Alagoas,
responsável por sua execução, as seguintes informações que me fizeram entender sem
dificuldades e sem dúvidas os seguintes aspectos:
Que o estudo se destina a: avaliar a eficácia do transplante da microbiota intestinal em
▪
paciente com doenças inflamatórias intestinais;
Que a importância deste estudo é a de: auxiliar os médicos, nutricionistas e demais
▪
profissionais da área da saúde para que tenham um melhor conhecimento sobre a nossa
realidade e assim possam oferecer um atendimento mais adequado e individualizado aos
pacientes portadores de doença inflamatória intestinal;
Que os resultados que se desejam alcançar são os seguintes: melhorar e alterar o
▪
prognóstico e tratamento das doenças inflamatórias intestinais, evitar o uso de medicações de
alto custo e melhorando ou evitando o tratamento convencional;
Que a coleta de dados deste estudo começará em setembro de 2019 e setembro de 2020;
▪
Que o estudo será feito da seguinte maneira: para o estudo serão necessários coletar os
▪
dados: gênero, idade, altura, peso, dobra cutânea tricipital, circunferência do braço; que não
trarão nenhum risco à sua saúde. Também serão coletados exames laboratoriais como: proteínaC-reativa, albumina, hemograma, calprotectina fecal que será pelo exame de fezes. Esses dados
coletados não terão nenhum risco ao senhor(a), e não trazem nenhum tipo de dano e essas
medidas não causam dor.
Os exames laboratoriais, serão colhidos durante seu acompanhamento ambulatorial e
▪
não serão acrescentados nenhuma coleta extra para o projeto. Os pacientes que não aceitarem
participar do projeto ou aqueles que não se adéquam aos critérios propostos permanecerão tendo
o mesmo acompanhamento.
O termo de responsabilidade da realização do exame de colonoscopia se encontra em
▪
anexo a este documento, com todas as implicações associadas ao procedimento;
Que eu participarei das seguintes etapas: entrevista inicial, avaliação nutricional, com
▪
coleta de dados: altura, peso, dobra cutânea tricipital, circunferência do braço; exames
laboratoriais de sangue e a coleta de fezes;
Que os incômodos que poderei sentir com a minha participação são os seguintes: a
▪
punção venosa durante a coleta de sangue e leve pressão na aferição da dobra cutânea triciptal,
algum possível constrangimento para entrega das fezes coletadas;
Que os possíveis riscos à minha saúde física e mental seriam aqueles relacionados às
▪
etapas de coleta das fezes, coleta de sangue e colonoscopia;
Que terei toda assistência da equipe que realizarão as coletas: médicos, enfermeiros,
▪
nutricionistas, técnicos de enfermagem, entre outros;
Que a minha participação será acompanhada com a assistência da equipe
▪
multiprofissional do ambulatório de Coloproctologia do HUPPA;
Que, sempre que desejar, serão fornecidos esclarecimentos sobre cada uma das etapas
▪
do estudo;
Que eu serei informado sobre o resultado final da pesquisa, assim como resultado dos
▪
meus exames realizados;

Que, a qualquer momento, eu poderei recusar a continuar participando do estudo e,
▪
também, que eu poderei retirar meu consentimento, sem que isso me traga qualquer penalidade
ou prejuízo;
Que as informações conseguidas através da minha participação não permitirão a
▪
identificação da minha pessoa, exceto aos responsáveis pelo estudo, e que a divulgação das
mencionadas informações só será feita entre os profissionais estudiosos do assunto;
Que o estudo não acarretará nenhuma despesa para o participante da pesquisa; E será
▪
garantida a indenização (nexo causal) judicial ou extrajudicial pela equipe de pesquisa se
porventura ocorrer algum tipo de dano durante a participação do indivíduo no período da
pesquisa.
Que eu receberei uma via do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido;
▪
Finalmente, tendo eu compreendido perfeitamente tudo o que me foi informado sobre a
▪
minha participação no mencionado estudo e estando consciente dos direitos, das
responsabilidades, dos riscos e dos benefícios que a participação implica, concordo em autorizar
a participação e para isso eu DOU O MEU CONSENTIMENTO SEM QUE PARA ISSO EU
TENHA SIDO FORÇADO OU OBRIGADO.
Endereço d(o,a) paciente e/ou responsável
Domicílio: (rua, praça, conjunto):
Bloco: /Nº: /Complemento:
Bairro: /CEP/Cidade: /Telefone:
Ponto de referência:
Contato de urgência: Júnia Elisa Carvalho de Meira / Lucas Correia
Domicílio: Rua Antônio Fellinto, 93
Bloco: Complemento:
Bairro: Riacho Doce /CEP: 57039-520 /Cidade: Maceió /Telefone: (82) 981817755
Ponto de referência:
Endereço da responsável da pesquisa:
Nome: Júnia Elisa Carvalho de Meira / Lucas Correia
E-mail: junia.meira@gmail.com / ucas0@hotmail.com (preferência por contato via e-mail)
Telefone: (82) 981817755 (Junia) / (82) 8809-5957 (Lucas)
Ponto de referência:
ATENÇÃO: Para informar ocorrências irregulares ou danosas durante a sua participação no
estudo, dirija-se ao:
Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Alagoas
Prédio da Reitoria, 1º Andar, Campus A. C. Simões, Cidade Universitária
Telefone: 3214-1041, Maceió-AL

Maceió, ___/___/____
Assinatura ou impressão datiloscópica d(o,a) Nome e Assinatura do(s) responsável (eis)
voluntári(o,a) ou responsável legal e rubricar as demais pelo estudo (Rubricar as demais páginas)
folhas

APÊNDICE B – Termo de Assentimento Livre e Esclarecido – TALE
Você____________________________________________________,
responsável
pelo
menor _______________________________________, está sendo convidado(a) a participar
do estudo “Eficácia Clinica do Transplante da Microbiota Intestinal em Pacientes com DIIs”
recebi do Prof. Dr. Manoel Álvaro de Freitas Lins Neto, chefe do Serviço de Coloproctologia
do HUPAA-UFAL- Universidade Federal de Alagoas, responsável por sua execução, as
seguintes informações que me fizeram entender sem dificuldades e sem dúvidas os seguintes
aspectos:
Que o estudo se destina a: avaliar a eficácia do transplante da microbiota intestinal em
▪
paciente com doenças inflamatórias intestinais;
Que a importância deste estudo é a de: auxiliar os médicos, nutricionistas e demais
▪
profissionais da área da saúde para que tenham um melhor conhecimento sobre a nossa
realidade e assim possam oferecer um atendimento mais adequado e individualizado aos
pacientes portadores de doença inflamatória intestinal;
Que os resultados que se desejam alcançar são os seguintes: melhorar e alterar o
▪
prognóstico e tratamento das doenças inflamatórias intestinais, evitar o uso de medicações de
alto custo e melhorando ou evitando o tratamento convencional;
Que a coleta de dados deste estudo começará em setembro de 2019 e setembro de 2020;
▪
Que o estudo será feito da seguinte maneira: para o estudo serão necessários coletar os
▪
dados: gênero, idade, altura, peso, dobra cutânea tricipital, circunferência do braço; que não
trarão nenhum risco à sua saúde. Também serão coletados exames laboratoriais como: proteínaC-reativa, albumina, hemograma, calprotectina fecal que será pelo exame de fezes. Esses dados
coletados não terão nenhum risco ao senhor(a), e não trazem nenhum tipo de dano e essas
medidas não causam dor.
Os exames laboratoriais, serão colhidos durante seu acompanhamento ambulatorial e
▪
não serão acrescentados nenhuma coleta extra para o projeto. Os pacientes que não aceitarem
participar do projeto ou aqueles que não se adéquam aos critérios propostos permanecerão tendo
o mesmo acompanhamento.
O termo de responsabilidade da realização do exame de colonoscopia se encontra em
▪
anexo a este documento, com todas as implicações associadas ao procedimento;
Que eu participarei das seguintes etapas: entrevista inicial, avaliação nutricional, com
▪
coleta de dados: altura, peso, dobra cutânea tricipital, circunferência do braço; exames
laboratoriais de sangue e a coleta de fezes;
Que os incômodos que poderei sentir com a minha participação são os seguintes: a
▪
punção venosa durante a coleta de sangue e leve pressão na aferição da dobra cutânea triciptal,
algum possível constrangimento para entrega das fezes coletadas;
Que os possíveis riscos à minha saúde física e mental seriam aqueles relacionados às
▪
etapas de coleta das fezes, coleta de sangue e colonoscopia;
Que terei toda assistência da equipe que realizarão as coletas: médicos, enfermeiros,
▪
nutricionistas, técnicos de enfermagem, entre outros;
Que a minha participação será acompanhada com a assistência da equipe
▪
multiprofissional do ambulatório de Coloproctologia do HUPPA;
Que, sempre que desejar, serão fornecidos esclarecimentos sobre cada uma das etapas
▪
do estudo;
Que eu serei informado sobre o resultado final da pesquisa, assim como resultado dos
▪
meus exames realizados;
Que, a qualquer momento, eu poderei recusar a continuar participando do estudo e,
▪
também, que eu poderei retirar meu consentimento, sem que isso me traga qualquer penalidade
ou prejuízo;

Que as informações conseguidas através da minha participação não permitirão a
▪
identificação da minha pessoa, exceto aos responsáveis pelo estudo, e que a divulgação das
mencionadas informações só será feita entre os profissionais estudiosos do assunto;
Que o estudo não acarretará nenhuma despesa para o participante da pesquisa; E será
▪
garantida a indenização (nexo causal) judicial ou extrajudicial pela equipe de pesquisa se
porventura ocorrer algum tipo de dano durante a participação do indivíduo no período da
pesquisa.
Que eu receberei uma via do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido;
▪
Finalmente, tendo eu compreendido perfeitamente tudo o que me foi informado sobre a
▪
minha participação no mencionado estudo e estando consciente dos direitos, das
responsabilidades, dos riscos e dos benefícios que a participação implica, concordo em autorizar
a participação e para isso eu DOU O MEU CONSENTIMENTO SEM QUE PARA ISSO EU
TENHA SIDO FORÇADO OU OBRIGADO.
Endereço d(o,a) responsável
Domicílio: (rua, praça, conjunto):
Bloco: /Nº: /Complemento:
Bairro: /CEP/Cidade: /Telefone:
Ponto de referência:
Contato de urgência: Júnia Elisa Carvalho de Meira / Lucas Correia
Domicílio: Rua Antônio Fellinto, 93
Bloco: Complemento:
Bairro: Riacho Doce /CEP: 57039-520 /Cidade: Maceió /Telefone: (82) 981817755
Ponto de referência:
Endereço da responsável da pesquisa:
Nome: Júnia Elisa Carvalho de Meira / Lucas Correia
E-mail: junia.meira@gmail.com / ucas0@hotmail.com (preferência por contato via e-mail)
Telefone: (82) 981817755 (Junia) / (82) 8809-5957 (Lucas)
Ponto de referência:
ATENÇÃO: Para informar ocorrências irregulares ou danosas durante a sua participação no
estudo, dirija-se ao:
Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Alagoas
Prédio da Reitoria, 1º Andar, Campus A. C. Simões, Cidade Universitária
Telefone: 3214-1041, Maceió-AL

Maceió, ___/___/____
Assinatura ou impressão datiloscópica d(o,a) responsável Nome e Assinatura do(s) responsável (eis)
legal e rubricar as demais folhas
pelo estudo (Rubricar as demais páginas)

APÊNDICE C – Cadastro individual
DATA:___ /___ /_______
Identificação
CNS
|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|
CÓDICO DO PACIENTE – HUPAA CÓDIGO DA PESQUISA (iniciais do nome + número cadastro)
|__|__|__|__|__|__|__|__| |__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|
NOME COMPLETO:
|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|
__|__|__|
|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|
__|__|__|
E-MAIL: TELEFONE:
|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__| |__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__
ENDEREÇO:
|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|
BAIRRO: MUNICÍPIO: ESTADO:
|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__| |__|__|__|__|__|__|__|__|__|__|__| |__|__|
DATA DE NASCIMENTO:___ /___ /_______ IDADE: ___________ SEXO: () F () M
NACIONALIDADE: () Brasileira () Naturalizado () Estrangeiro MUNICÍPIO E UF DE NASCIMENTO:
__________________________(____)
ETNIA: ( ) Negro ( ) Branco ( ) Pardo ( ) Índio ( ) Amarelo
Antecedentes:
TABAGISMO: ( ) Não ( ) Sim
Há quanto tempo?_____ Quantos cigarros por dia?_____ ( ) EX-TABAGISTA Parou há quantos anos?__________
ETILISMO: ( ) Não ( ) Sim Quanto na semana?_____________________________________________________________
COMORBIDADES: ( ) Não ( ) Sim Quais?________________________________________________________________
USO DE MEDICAÇÃO: ( ) Não ( ) Sim Quais?______________________________________________________________
CIRURGIAS: ( ) Não ( ) Sim Quais?______________________________________________________________________
Doença inflamatória intestinal
DIAGNÓSTICO:
Retocolite Ulcerativa ( ) Doença de Crohn ( ) Colite Indeterminada ( )
MEDICAÇÕES EM USO:
Sulfassalazina ( ) Desde: __________ Dose: __________ Mesalazina ( ) Desde: __________Dose: __________
Azatioprina ( ) Desde: __________Dose: __________ Predisona( ) Desde: __________Dose: ___________
Imunobiológico ( ) Qual? __________________ Desde: __________Dose: __________ Fez corticoide no início do
biológico?______
Exames:
CALPROTECTINA FECAL (___/___/_____):
Coleta das fezes
DATA DA COLETA DAS FEZES (___/___/_____)
DATA DA ENTREGA DAS FEZES (___/___/_____)
DATA DA CONGELAÇÃO DAS FEZES (___/___/_____)
OBSERVAÇÕES:

ANEXO
ANEXO A – Normas do periódico International Journal of Colorectal Disease.
https://www.springer.com/journal/384/submission-guidelines
Title
The title should be concise and informative.
Author information
The name(s) of the author(s)
The affiliation(s) of the author(s), i.e. institution, (department), city, (state), country
A clear indication and an active e-mail address of the corresponding author
If available, the 16-digit ORCID of the author(s)
If address information is provided with the affiliation(s) it will also be published.
For authors that are (temporarily) unaffiliated we will only capture their city and country of
residence, not their e-mail address unless specifically requested.

Abstract
Please provide a structured abstract of 150 to 250 words which should be divided into the
following sections:
Purpose (stating the main purposes and research question)
Methods
Results
Conclusion
For life science journals only (when applicable)
Trial registration number and date of registration for prospectively registered trials
Trial registration number and date of registration followed by “retrospectively
registered”, for retrospectively registered trials

Keywords
Please provide 4 to 6 keywords which can be used for indexing purposes.

Statements and Declarations

The following statements should be included under the heading "Statements and Declarations"
for inclusion in the published paper. Please note that submissions that do not include relevant
declarations will be returned as incomplete.
Competing Interests: Authors are required to disclose financial or non-financial
interests that are directly or indirectly related to the work submitted for publication. Please
refer to “Competing Interests and Funding” below for more information on how to complete
this section.
Please see the relevant sections in the submission guidelines for further information as well as
various examples of wording. Please revise/customize the sample statements according to your
own needs.

Please note:
If the article was written by two lead authors, the title page must include a footnote stating that
"author xx and author yy contributed equally…“.
The total number of authors should not exceed 12.

Text Formatting
Manuscripts should be submitted in Word.
Use a normal, plain font (e.g., 10-point Times Roman) for text.
Use italics for emphasis.
Use the automatic page numbering function to number the pages.
Do not use field functions.
Use tab stops or other commands for indents, not the space bar.
Use the table function, not spreadsheets, to make tables.
Use the equation editor or MathType for equations.
Save your file in docx format (Word 2007 or higher) or doc format (older Word
versions).
Manuscripts with mathematical content can also be submitted in LaTeX. We recommend
using Springer Nature’s LaTeX template.

Headings
Please use no more than three levels of displayed headings.

Abbreviations
Abbreviations should be defined at first mention and used consistently thereafter.

Footnotes
Footnotes can be used to give additional information, which may include the citation of a
reference included in the reference list. They should not consist solely of a reference citation,
and they should never include the bibliographic details of a reference. They should also not
contain any figures or tables.
Footnotes to the text are numbered consecutively; those to tables should be indicated by
superscript lower-case letters (or asterisks for significance values and other statistical data).
Footnotes to the title or the authors of the article are not given reference symbols.
Always use footnotes instead of endnotes.

Acknowledgments
Acknowledgments of people, grants, funds, etc. should be placed in a separate section on the
title page. The names of funding organizations should be written in full.

References
Citation
Reference citations in the text should be identified by numbers in square brackets. Some
examples:
1. Negotiation research spans many disciplines [3].
2. This result was later contradicted by Becker and Seligman [5].
3. This effect has been widely studied [1-3, 7].

Reference list
The list of references should only include works that are cited in the text and that have been
published or accepted for publication. Personal communications and unpublished works should
only be mentioned in the text.
The entries in the list should be numbered consecutively.
If available, please always include DOIs as full DOI links in your reference list (e.g.
“https://doi.org/abc”).
•

Journal article

Gamelin FX, Baquet G, Berthoin S, Thevenet D, Nourry C, Nottin S, Bosquet L (2009) Effect of
high intensity intermittent training on heart rate variability in prepubescent children. Eur J
Appl Physiol 105:731-738. https://doi.org/10.1007/s00421-008-0955-8
Ideally, the names of all authors should be provided, but the usage of “et al” in long author
lists will also be accepted:
Smith J, Jones M Jr, Houghton L et al (1999) Future of health insurance. N Engl J Med
965:325–329
•

Article by DOI

Slifka MK, Whitton JL (2000) Clinical implications of dysregulated cytokine production. J Mol
Med. https://doi.org/10.1007/s001090000086
•

Book

South J, Blass B (2001) The future of modern genomics. Blackwell, London
•

Book chapter

Brown B, Aaron M (2001) The politics of nature. In: Smith J (ed) The rise of modern genomics,
3rd edn. Wiley, New York, pp 230-257
•

Online document

Cartwright J (2007) Big stars have weather too. IOP Publishing PhysicsWeb.
http://physicsweb.org/articles/news/11/6/16/1. Accessed 26 June 2007
•

Dissertation

Trent JW (1975) Experimental acute renal failure. Dissertation, University of California
Always use the standard abbreviation of a journal’s name according to the ISSN List of Title
Word Abbreviations, see ISSN.org LTWA
If you are unsure, please use the full journal title.
Authors preparing their manuscript in LaTeX can use the bibliography style file sn-basic.bst
which is included in the Springer Nature Article Template.

Mestrado em Ciências Médicas - PPGCM