Dissertação Vannessa.pdf
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                    UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS
FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS

Vannêssa Rodrigues Teles Maia

Perfil antimicrobiano e antioxidante de extratos de fungos filamentosos do bioma
Caatinga.

Maceió
2023

VANNÊSSA RODRIGUES TELES MAIA

Perfil antimicrobiano e antioxidante de metabólitos produzidos por fungos filamentosos
do bioma Caatinga.

Maceió
2023

Aos meus pais,
Maria das Graças (in memoriam) e
Valderêdo (in memoriam),
por terem sido exemplo
de doação, força, honra e amor.
A minha filha, esposo, irmãs,
incluindo a de coração, e
sobrinhos, dedico este trabalho.

AGRADECIMENTOS
A Deus, por Sua imensa graça e infinita misericórdia.
A minha família, por todo apoio, força, compreensão, auxílio emocional e financeiro,
e por acreditarem mais em mim do que eu mesma! Destaco o apoio do Artur, meu esposo,
pela paciência e dedicação.
Em especial ao meu orientador, Prof. Dr. Alysson Wagner F. Duarte, por tamanha
paciência, dedicação constante e todo conhecimento transmitido, pelas palavras de apoio,
acolhimento e incentivo, além de ser uma grandiosa fonte de inspiração.
A minha coorientadora, Profa. Dra. Aline C. de Queiroz, por seus ensinamentos,
correções, sua doçura e ser fonte inspiradora. É um imensurável privilégio poder contar com
ambos para desenvolver pesquisa!
Aos meus companheiros de laboratório, Nicolle, Kaline, Averlane, Jessia, Mariana,
Kelly, Gilberto, Vanessa, Mayanne, agradeço pela amizade, companheirismo, pelos momentos
divertidos e pela imensa ajuda de todos vocês nas práticas laboratoriais. Vocês certamente
tornaram o percurso mais leve. Admiro cada um por tanta dedicação ao que fazem, vocês são
raros! Em especial à Emanuelly Sampaio, que foi a responsável por me acolher, guiar e
ensinar uma infinidade de práticas laboratoriais, você é dona de um coração lindo, sem falar
na sua inteligência e capacidade enormes. Obrigada pela amizade que construímos!
Ao prof. Dr. Adeildo por disponibilizar o Laboratório de Química e prestar imenso
auxílio nos procedimentos e análises que enriqueceram esse trabalho.
Aos colegas do Laboratório de Farmacologia e Imunidade – LAFI pelo acolhimento,
apoio nas práticas desenvolvidas e momentos de descontração, Eder, Márcio, Kaycke, Cibele,
Lillyana, Shakira, Camila, Anderson, vocês foram fantásticos!
Ao meu amigo querido, Magliones que tanto me incentivou e apoiou para que pudesse
ingressar nessa etapa, você é muito especial!
À Universidade Federal de Alagoas - UFAL, ao Programa de Pós-graduação de
Ciências Médicas – PPGCM, ao Laboratório de Microbiologia e Parasitologia – LABMIP, à
Central Analítica do Núcleo de Ciências Exatas – CA-NCEx e ao Laboratório de
Farmacologia e Imunidade – LAFI, pela estrutura de pesquisa para a condução deste estudo.
A todos que contribuíram, direta ou indiretamente, no desenvolvimento desta
pesquisa.

“Toda a nossa ciência, comparada com a realidade,
é primitiva e infantil - e, no entanto, é a coisa
mais preciosa que temos.”
Albert Einstein

RESUMO
O advento dos antibióticos revolucionou os tratamentos médicos, possibilitando o
desenvolvimento de técnicas invasivas e cirúrgicas com viabilidade de recuperação e
manutenção da vida dos indivíduos após os procedimentos cirúrgicos, como também a cura de
doenças infecciosas antes fatais. Não obstante, o uso excessivo e irregular, além dos
mecanismos genéticos desenvolvidos pelos próprios micro-organismos, fez emergir a
resistência microbiana, problema crescente que se tornou uma preocupação mundial no século
XXI, trazendo à tona a necessidade da pesquisa por novos antimicrobianos. A busca por
novos compostos bioativos advindos de substâncias naturais tem grande potencial de
aplicação e uso, além da atividade antimicrobiana, na busca por compostos com atividade
antioxidante, essencial no combate ao processo de envelhecimento do organismo humano e às
doenças degenerativas. Nessa perspectiva, a busca por fungos filamentosos produtores de
bioativos do bioma Caatinga, bioma exclusivamente brasileiro, pode ser estratégico, uma vez
que este ambiente se caracteriza por condições climáticas e ambientais únicas e os organismos
endêmicos possivelmente produzem metabólitos secundários diferenciados. Assim,
objetivou-se avaliar o potencial antimicrobiano e antioxidante de metabólitos secundários
produzidos por fungos filamentosos de liquens da Caatinga de Alagoas. Para tanto foram
selecionados 35 fungos, realizada a produção de metabólitos secundários por cultivo em meio
sólido Ágar Czapek durante 15 dias à 30.0 ºC, seguido da extração em acetato de etila
(C4H8O2) e avaliação de rendimento. A determinação da atividade antimicrobiana foi pelo
método de difusão em disco e microdiluição de em caldo Sabouraud e o potencial de inibição
antioxidante foi avaliado utilizando os métodos do radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazil (DPPH)
e do poder de redução do ferro (FRAP). Dos 35 fungos avaliados, quatro (11%) apresentaram
atividade antimicrobiana e seis (17%) com perfil antioxidante. O extrato de Penicillium sp.
2UVC8, seguido do Fusarium sp. 3UVLFC1, demonstraram as melhores atividades contra
Staphylococcus aureus, com concentração inibitória mínima (CIM) de 125 μg/mL e 250
μg/mL, respectivamente. As frações do extrato de Fusarium sp. 3UVLFC1 de acetato de etila,
clorofórmica e hexânica, exibiram potencial promissor contra S. aureus. Na avaliação da
atividade antifúngica, o extrato de Fusarium sp. 4UVLFC2 exibiu CIM = 31,2 μg/mL, frente
à C. albicans. Contudo, para as cepas de bactérias Gram-negativas E. coli e P. aeruginosa
nenhum extrato exibiu efeito inibitório. Na determinação antioxidante, o extrato de Fusarium
sp. 4LCEM2 obteve resultado promissor, com CE = 180 μg/mL. No tocante à ação citotóxica
frente aos linfócitos sanguíneos humano, os extratos de Fusarium sp. 3UVLFC1, Penicillium
sp. 2UVC8 e Penicillium sp. 11LCL5 não apresentaram citotoxicidade mesmo em
concentrações altas como 2000 e 1000 μg/mL. Já na análise dos extratos fúngicos realizadas
em Espectrômetro de Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR), foram encontrados
sinais bastante complexos e outros bem semelhantes mesmo entre gêneros diferentes.
Destarte, os resultados evidenciaram atividade antimicrobiana promissora para S. aureus,
como também potencial antioxidante, sendo não citotóxicos aos linfócitos humanos. Tais
resultados exaltam a riqueza da biodiversidade da Caatinga e a prospecção de seus
micro-organismos, que são fontes de metabólitos com alto potencial biotecnológico.
50

Palavras-chave: Antimicrobianos. Atividade antioxidante. Extratos fúngicos. Semiárido.
Prospecção microbiana. Concentração inibitória mínima.

ABSTRACT
The advent of antibiotics has been revolutionary in medical treatment, allowing the
development of invasive and surgical techniques that have made it possible to recover and
sustain human life after surgery, as well as to cure previously fatal infectious diseases.
However, their excessive and irregular use, together with the genetic mechanisms developed
by the microorganisms themselves, have led to the emergence of microbial resistance, a
growing problem that has become a global concern in the 21st century, highlighting the need
for research into new antimicrobial agents. In addition to antimicrobial activity, the search for
new bioactive compounds derived from natural substances has great potential for application
and use in the search for compounds with antioxidant activity, which is essential in combating
the ageing of the human body and degenerative diseases. In this perspective, the search for
filamentous fungi producers of bioactives from the Caatinga biome, an exclusively Brazilian
biome, may be strategic, since this environment is characterised by unique climatic and
environmental conditions and the endemic organisms may produce differentiated secondary
metabolites. Thus, the aim of this study was to evaluate the antimicrobial and antioxidant
potential of secondary metabolites produced by filamentous fungi from lichens of the
Caatinga of Alagoas. For this objective, 35 fungi were selected and the production of
secondary metabolites was performed by cultivation in Czapek solid agar medium for 15 days
at 30.0 ºC, followed by extraction in ethyl acetate (C4H8O2) and evaluation of the yield.
Antimicrobial activity was determined by disc diffusion method and microdilution in
Sabouraud broth, and antioxidant inhibition potential was evaluated by
2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical and iron reducing power (FRAP) methods. Of
the 35 fungi evaluated, four (11%) showed antimicrobial activity and six (17%) exhibited an
antioxidant activity. The extract of Penicillium sp. 2UVC8, followed by Fusarium sp.
3UVLFC1, demonstrated the best activities against Staphylococcus aureus with minimum
inhibitory concentrations (MIC) of 125 μg/mL and 250 μg/mL, respectively. The ethyl
acetate, chloroform and hexane fractions of Fusarium sp. 3UVLFC1 extract revealed
promising potential against S. aureus. In the evaluation of antifungal activity, the extract of
Fusarium sp. 4UVLFC2 demonstrated MIC = 31.2 μg/mL, against C. albicans. However,
neither extract showed any inhibitory effect on the gram-negative bacteria strains E. coli and
P. aeruginosa. In the antioxidant determination, the extract of Fusarium sp. 4LCEM2 obtained
promising results with CE50 = 180 μg/mL As far as the cytotoxic effect against human blood
lymphocytes is concerned, the extracts of Fusarium sp. 3UVLFC1, Penicillium sp. 2UVC8
and Penicillium sp. 11LCL5 did not show any cytotoxicity even at high concentrations such
as 2000 and 1000 μg/mL. Fourier transform infrared spectrometer (FTIR) analysis of the
fungal extracts revealed quite complex signals. Others were very similar even among different
genera. The results showed promising antibacterial activity against S. aureus and antioxidant
potential without human lymphocyte cytotoxicity. These results emphasize the richness of the
biodiversity of the Caatinga and the prospection of its microorganisms, which are sources of
metabolites with a high biotechnological potential.

Keywords: Antimicrobials. Antioxidant activity. Fungal extracts. Semiarid. Microbial
prospection. Minimum inhibitory concentration.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 - Demonstração de mecanismos de resistência bacteriana aos antibióticos. ..

18

Quadro 1 - Aspectos gerais da produção de antimicrobianos por fungos filamentosos
de origem ambiental: espécie fúngica, meio de incubação, forma de extração dos
metabólitos, composto antimicrobiano, micro-organismos sensíveis e referências. .... 29
Figura 2 - Demonstração geral do mecanismo de oxidação lipídica, onde RH- ácido
graxo insaturado, R°- radical livre, ROO° - Radical peróxido e ROOH –
hidroperóxido. ............................................................................................................... 34
Figura 3 - Mapa do Brasil destacando o bioma Caatinga. ............................................

38

Figura 4 - Ensaio de produção de biomassa fúngica de isolados da Caatinga. (A)
Pesquisadora vertendo, com auxílio de pipeta de 20 mL, o meio de cultura nas placas
de Petri. (B) Repique do fungo com o uso de perfurador. (C) Distribuição dos discos
de fungo desenhando um triângulo. .............................................................................. 43
Figura 5 - Visualização do processo de extração de metabólitos secundários
produzidos por fungos da Caatinga. (A) Fungo crescido após 14 dias em meio de
cultura Ágar Czapek, 2% de glicose; (B) Repartição e transferência dos micélios
fúngicos para Erlenmeyer. (C) Acetato de etila (100 mL) sendo adicionado aos
fungos. (D) Fungos repartidos, embebidos em acetato de etila e vedados com
parafilme. ...................................................................................................................... 44
Figura 6 - Visualização do esquema de filtração e concentração dos extratos
fúngicos. (A) Passagem dos extratos juntamente com o acetato de etila, por
filtragem, para outro Erlenmeyer. (B) Extratos pigmentados após filtragem. .............. 44
Figura 7 - Esquema de ensaio de triagem em meio líquido, utilizando microplaca de
96 poços em concentrações de 1000 µg/mL (cor púrpura) e 500 µg/mL (cor lilás).
Enquanto a cor cinza escura representa o DMSO 2%, a cor cinza representa o
DMSO 1%, a cor branca representa o branco e a cor azul clara representa o controle
positivo. Os poços em amarelo, da linha H, representam poços vazios. ....................... 47
Figura 8 - Esquema do ensaio de avaliação da concentração inibitória mínima dos
extratos fúngicos em microplaca de 96 poços, nas concentrações de 2000 μg/mL a
15,62 μg/mL. ................................................................................................................. 48
Figura 9 - Esquema de ensaio de microdiluição em microplaca de 96 poços, do
extrato 3UVLFC1 em frações de acetato de etila, clorofórmica e hexânica, em
concentrações de 2000 μg/mL a 15,62 μg/mL. ............................................................. 49

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ADE

Água Destilada Esterilizada

ADPRT

Adenosina Difosfato Ribosil Transferase

AHL

Acil homoserina lactona

AIEC

Escherichia coli Aderentes-invasoras

APEC

Escherichia coli patogênica aviária

A-YEPD

Ágar Yeast Extract Peptone Dextrose

Bap

Proteína associada a biofilme

BHT

Hidroxitolueno Butilado

BPS

Phosfate Buffered Saline

CDC

Centro de Controle e Prevenção de Doenças

CIM

Concentração Inibitória Mínima

ClfB

Fator de agregação B

C-YPD

Caldo Yeast Extract Peptone Dextrose

DD

Disco difusão

DMSO

Dimetilsulfóxido

DO

Densidade Óptica

DPPH

2,2-difenil-1-picril-hidrazil

EAEC

Escherichia coli Enteroagregativa

Eap

Proteína de aderência extracelular

ECM

Extracellular matrix

eDNA

DNA extracelular

EHEC

Escherichia coli enterohemorrágica

EIEC

Escherichia coli Enteroinvasora

EPEC

Escherichia coli Enteropatogênica

EPS

Exopolissacarídeos

ERO

Espécies Reativas de Oxigênio

ERN

Espécies Reativas de Nitrogênio

ExPEC

Escherichia coli Patogênica Extraintestinal

FDA

Food and Drug Administration

FnBPA
FnBPB

Proteína de ligação a fibrinogênio A
Proteína de ligação a fibrinogênio B

FRAP

Ferric Reducing Antioxidant Power

Hlb

Toxina beta

IRAS

Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde

ITU

Infecções do trato urinário

LABMIP

Laboratório

de

Microbiologia,

Imunologia

Parasitologia
LPS

Lipopolissacarídeo

MDR

Multidrug-resistant

MH

Mueller-Hinton

MRSA

Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus

MSSA

Methicillin-Susceptible Staphylococcus aureus

NMEC

Escherichia coli meningite neonatal

NTEC

Escherichia coli Necrotoxigênica

ONU

Organização das Nações Unidas

OMS

Organização Mundial de Saúde

PAI

Pathogenicity islands

PNAG

N-acetil-glucosamina polimérica

PQS

Pseudomonas quinolona sinal

RAM

Resistência antimicrobiana

SasG

Proteína de superfície de Staphylococcus aureus

STEC

Escherichia coli Produtora de Toxina Shiga

TGI

Trato gastrointestinal

TPTZ

2,4,6-tripiridil-s-triazina

TSA

Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos

UFAL

Universidade Federal de Alagoas

UPEC

Escherichia coli uropatogênica

VISA

Vancomycin-Intermediate Staphylococcus aureus

VRSA

Vancomycin-Resistant Staphylococcus aureus

SUMÁRIO

e

1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................14
2 OBJETIVOS ...........................................................................................................16
2.1 Objetivo Geral .....................................................................................................16
2.2 Objetivos Específicos ..........................................................................................16
3 REVISÃO DE LITERATURA ..............................................................................17
4 METODOLOGIA ...................................................................................................41
5 PRODUTO .............................................................................................................65
5.1 Artigo 1: Perfil antimicrobiano e antioxidante de metabólitos de fungos
filamentosos isolados de liquens da Caatinga ...........................................................66
6 CONCLUSÕES ....................................................................................................103
7 LIMITAÇÕES E PERSPECTIVAS .....................................................................104
REFERÊNCIAS ......................................................................................................105

1 INTRODUÇÃO

A busca e o desenvolvimento de novas fontes de compostos com atividade
antimicrobiana são urgentes conforme alerta da Organização das Nações Unidas (ONU), uma
vez que a escassez de novos antimicrobianos está aumentando a mortalidade e morbidade
devido à permanência das infecções que estão mais difíceis de tratar. Em 2017 a Organização
Mundial de Saúde (OMS) listou as bactérias mais ameaçadoras e, dentre elas, estão
Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa, que são responsáveis por causar um
crescente número de infecções com desfecho fatal, uma vez que estão envolvidas
principalmente em casos de Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde (IRAS) (WHO,
2017).
Poucos micro-organismos são tão adaptáveis quanto às bactérias Escherichia coli e a
levedura Candida albicans, as primeiras possuem grande versatilidade por serem
micro-organismos encontrados comumente na microbiota intestinal dos seres humanos e
outros mamíferos, mas podem ser potentes agentes patogênicos para o homem e para os
animais (Kaper, 2004). A incidência de infecções fúngicas vem aumentando juntamente com
a resistência medicamentosa e a C. albicans, bem como as últimas bactérias mencionadas, são
micro-organismos comensais, habitam a microbiota humana, mas quando há desequilíbrio da
imunidade podem se tornar patógenos ameaçadores e por em risco a vida de muitos
indivíduos (Vila et al., 2020).
Um aspecto comum desses micro-organismos mencionados e que atua como fator de
virulência é a capacidade de formação de biofilmes, os quais viabilizam o fortalecimento
desses micro-organismos, aumentando a sua resistência aos agentes terapêuticos, seja pela
dificuldade de acesso desses, seja pela produção de toxinas pelos micro-organismos. A
formação de biofilme por bactérias e leveduras constitui um dos principais mecanismos
associados à instalação e evolução de doenças no organismo humano. Os biofilmes são
estruturas complexas, constituídas por diferentes espécies microbianas, podendo ser
monoespécies ou multiespécies, envoltos em uma matriz orgânica, formada principalmente de
exopolissacarídeos (EPS), além de enzimas, proteínas e outras moléculas (Santos et al.,
2020b).
Por outro lado, a demanda por compostos com atividade antioxidante tem sido
crescente, uma vez que substâncias com essa atividade inviabiliza a ação de radicais livres,
substâncias resultantes das atividades orgânicas inerentes ao corpo humano e que causam
danos ao mesmo, como o processo de envelhecimento, doenças degenerativas, câncer entre
outras patologias (Tavares et al., 2018).

O uso de substâncias de fonte natural no combate a doenças tem origem antiga,
todavia ainda possui um grande potencial exploratório, posto que viabiliza a descoberta de
novos princípios ativos no intuito de impedir sua resistência ao uso repetitivo de substâncias
já conhecidas, amenizar ou inviabilizar efeitos adversos, além de propiciar a descoberta de
potencializadores dos efeitos de substâncias já utilizadas e isso incrementa seu potencial de
ação. E, nessa perspectiva, compostos naturais com atividade antimicrobiana oriundos de
organismos da região da Caatinga, bioma exclusivamente brasileiro, têm sido reportados,
como extratos de plantas (Dantas-Medeiros, 2020), óleos essenciais vegetais (Pereira;
Teixeira; Medeiros, 2021), e metabólitos microbianos, principalmente por actinobactérias
(Moura et al., 2021).
No entanto, são limitados os estudos com a avaliação de metabólitos produzidos por
fungos filamentosos da Caatinga, podendo esse ambiente ser um reservatório natural de
organismos promissores na descoberta de novos protótipos de fármacos antimicrobianos e
antioxidantes. Em vista disso, faz-se o questionamento: produtos naturais como metabólitos
fúngicos produzidos por isolados da Caatinga apresentam atividade antimicrobiana e/ou
antioxidante? A hipótese desse estudo é que fungos filamentosos desse ambiente pouco
conhecido podem produzir compostos com potencial antimicrobiano e antioxidante
diferenciado.

2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar o perfil antimicrobiano e antioxidante de metabólitos secundários produzidos
por fungos filamentosos isolados de liquens da Caatinga de Alagoas.
2.2 Objetivos específicos
​Cultivar fungos isolados de liquens da Caatinga para produção de metabólitos secundários;
​Realizar a extração de metabólitos secundários e avaliação de rendimento de produção;
​Avaliar a atividade antibacteriana dos extratos fúngicos contra cepas de E. coli, P. aeruginosa
e S. aureus e atividade antifúngica contra C. albicans;
​Avaliar o perfil antioxidante dos extratos fúngicos;
​Realizar o fracionamento de extratos fúngicos com atividade antimicrobiana e analisar a
respectiva atividade a partir das frações;
​Analisar a citotoxicidade dos extratos fúngicos em linhagens de linfócitos;
​Caracterizar os extratos quanto a sua composição química.

3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 Problemática das infecções microbianas
3.1.1

Resistência Antimicrobiana
Nos últimos anos tem sido crescente o relato da resistência antimicrobiana nos

diferentes ambientes de saúde, sendo as Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde
(IRAS), uma problemática urgente de saúde pública (Denissen et al., 2022). A resistência
antimicrobiana (RAM) adquirida acontece quando micro-organismos como bactérias e fungos
se modificam com o passar do tempo e, com isso, não respondem mais a antimicrobianos aos
quais anteriormente eram susceptíveis (WHO, 2021). Desse modo, as infecções ficam mais
complicadas de serem tratadas e o risco de disseminação de patógenos se eleva
consideravelmente, causando maior morbidade e mortalidade. Ressalta-se que o termo
antimicrobiano trata de antivirais, antifúngicos e antibacterianos (Boparai; Sharma, 2019).
A RAM configura-se como uma ameaça global à saúde pública, uma vez que a OMS
considera como uma das dez ameaças predominantes à saúde (ANVISA, 2021). Em 27 de
fevereiro de 2017 a OMS publicou o primeiro documento listando os agentes patogênicos
com maior resistência aos antibióticos e os classificou em três grupos de prioridades: crítica,
alta e média, conforme a demanda de desenvolvimento de novos antimicrobianos (WHO,
2017). Tal prioridade foi descrita de acordo com a demanda de desenvolvimento de novos
antimicrobianos que façam frente às bactérias multirresistentes.
Um êxito histórico foi a descoberta dos antibióticos, permitindo a cura de doenças e
infecções, fossem elas simples, complexas ou iminentemente fatais, como também
viabilizando a realização de transplantes de órgãos e demais procedimentos desafiadores da
medicina (Hutchings et al., 2019). No entanto, a dispersão das bactérias que possuem
resistência aos antimicrobianos está sendo um prenúncio do retorno aos tempos remotos,
antes das conquistas de tratamentos tão imprescindíveis à humanidade (Watkins, 2016).
Ao analisar, brevemente, o histórico dos antibióticos é possível observar que a
resistência também o acompanhou. Fato interessante aconteceu com a penicilina, pois sua
descoberta aconteceu em 1928 e o reconhecimento da ação de uma penicilinase bacteriana
aconteceu antes mesmo da utilização dessa substância como medicação (Lewis, 2020). Em
1937 as sulfonamidas foram difundidas, porém logo em seguida, aproximadamente após dois
anos, sua resistência foi relatada. Por outro lado, em 1944 foi inserida a estreptomicina e os

mecanismos de resistência contra ela surgiram durante o curso de sua utilização, fato
semelhante foi acontecendo com os demais medicamentos (Davies, 1996).
As bactérias podem manifestar determinados genes de resistência que provocam falha
no mecanismo de ação de fármacos, esses genes podem ser próprios do seu gênero ou ela
pode adquirir de outras bactérias, de vírus ou mesmo do ambiente, quando incorporam
material liberado de bactérias lisadas, assim como podem sofrer mutações nos seus genes
(Wang et al, 2022). Ademais, há diferentes estratégias que esses micro-organismos utilizam
para inativar os antimicrobianos: redução da permeabilidade da membrana plasmática,
aumento do sistema de efluxo, produção de enzimas capazes de modificar ou degradar o
antimicrobiano, alteração do local de ligação ou o bloqueio do alvo (Barbosa et al., 2020;
Pulingam et al., 2022) (figura 1).
Figura 1: Demonstração de mecanismos de resistência bacteriana aos antibióticos.

Fonte: Imagem adaptada de Pulingam et al., 2022.

As infecções acarretadas por bactérias multirresistentes a antimicrobianos têm
crescido assustadoramente ao tempo em que vêm ocasionando um número também crescente
de mortes, em 2020 estimava-se 700.000 mortes/ano em todo o mundo, supondo-se um
aumento para dez milhões de mortes no ano de 2050, equivalente a 1.200 mortes a cada hora.
Isto porque, há um crescente número de micro-organismos vem desenvolvendo estratégias

adaptativas, como mutações genéticas, com o intuito de esquivarem-se da ação dos
antibióticos, culminando com os diversos mecanismos de resistência e colocando em risco o
tratamento de infeções (Watkins, 2016). Assim, torna-se evidente o quanto a resistência
antibiótica é um problema crítico para a saúde mundial (Hampton, 2013; Paterson, 2020).
Outros fatores que contribuem consideravelmente para o aumento da resistência aos
medicamentos são as prescrições sem necessidade ou inadequadas, os pacientes que não
cumprem o regime adequado da prescrição medicamentosa ou que não seguem os horários
adequados e as recomendações médicas (Bologa et al., 2013).
3.2 Aspectos gerais de Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa
e Candida albicans
De maneira geral, cepas de S. aureus, E. coli, P. aeruginosa e C. albicans possuem
características comuns como a ocorrência na microbiota normal humana, entretanto, podem
causar graves infecções por serem organismos oportunistas (Gómez et al., 2022).
Especialmente quando ocorrem em sítios anatômicos diferentes daqueles que são reportados
como integrantes da microbiota própria, além da preocupação crescente dessas cepas com a
resistência antimicrobiana adquirida (Samreen et al., 2021).
Staphylococcus aureus são bactérias em forma de cocos, Gram-positivas, aeróbias,
catalase positivas, o que significa que são capazes de hidrolisar o peróxido de hidrogênio em
água e oxigênio. Enquanto crescem, essas bactérias podem produzir pigmentos carotenoides
de coloração amarelada ou dourada, daí a origem de seu nome (Kong, 2016). Nos seres
humanos, elas podem ser encontradas como integrantes da microbiota normal em pele e
mucosas, tendo preferência pela mucosa nasal. São responsáveis por causar desde simples
infecções de pele até toxemias graves, como pneumonia, infecções cardiovasculares,
síndrome da pele escaldada, síndrome do choque tóxico, dentre outras bacteremias
nosocomiais, além de relacionar-se à produção de enterotoxinas (Cheung, 2021).
A S. aureus tem imensa pluralidade de fatores de virulência, o que facilita sua
disseminação, tornando um micro-organismo com elevada resistência e endêmico em
hospitais, causando uma preocupante morbimortalidade. Dentre esses fatores de virulência
destacam-se: mecanismos de evasão do sistema imunológico do hospedeiro, produção de
grande variedade de toxinas, bem como de fatores proteicos e não proteicos que viabilizam a
colonização do hospedeiro (De Leo et al., 2010). Outro elemento que se destaca em sua

virulência é o fato de ser capaz de produzir coagulase, enzima que viabiliza a formação de
coágulo, impedindo o acesso do sistema imunológico ao foco de infecção (Kong, 2016).
Em 1961, dois anos após o início do uso de antibiótico no tratamento de infecções
causadas por S. aureus, foi registrada pela primeira vez a bactéria S. aureus resistente à
meticilina (MRSA do inglês Methicillin-Resistant S. aureus), a qual se espalhou facilmente ao
redor do mundo (Klevens et al., 2007), quando comparada com S. aureus sensível à meticilina
(MSSA do inglês Methicillin-Susceptible S. aureus). Diante dos seus fatores de virulência,
essa bactéria tem facilidade de adquirir resistência aos antibióticos mais utilizados, como
exemplo

as

cepas

S.

aureus

intermediário

à

vancomicina

(VISA

do

inglês

Vancomycin-Intermediate S. aureus) e S. aureus resistente à vancomicina (VRSA do inglês
Vancomycin-Resistant S. aureus) (Kong, 2016).
Conforme mencionado, S. aureus é uma espécie bacteriana que se destaca por causar
infecções comunitárias e nosocomiais, pois possui características bem versáteis e riqueza de
fatores de virulência. Antes do surgimento dos antibióticos a mortalidade causada por
infecções decorrentes desse patógeno era superior a 80%. Na década de 1940, com o advento
comercial da penicilina, houve uma melhoria radical no prognóstico dos pacientes infectados
(Santos et al., 2021). Apesar disso, logo em seguida, a resistência antibiótica começou a ser
registrada (Prescott, 2014), sendo um dos micro-organismos que mais se apresenta na
progressão das Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde (IRAS), sobretudo quando se
refere a pneumonias, bacteremias, endocardite e infecções de sítios cirúrgicos (Grudmann et
al., 2014). Em 2019 na China, essa espécie alcançou o primeiro lugar entre as bactérias
Gram-positivas segundo o resultado do Sistema de Vigilância de Resistência Antimicrobiana
desse país (Wang et al., 2022). Ainda, taxas de letalidade em torno de 15 a 25% foram
apresentadas em estudos populacionais em diferentes regiões no mundo, assim como taxas de
incidência de 15 a 40 por 100.000 habitantes por ano (Laupland et al., 2013).
Já a E. coli é uma espécie de bactéria que faz parte da família Enterobacteriaceae,
sendo bacilos Gram-negativos, habitantes preponderantes do trato gastrointestinal (TGI) dos
humanos, mais especificamente no intestino grosso em sua camada mucosa, mas também são
encontrados no intestino de outros mamíferos. Durante a infância, são as primeiras espécies
bacterianas que colonizam os humanos e são empregadas como indicadores de qualidade da
água e de alimentos, na verificação de contaminação de origem fecal (Tenaillon et al., 2010).
Ainda se caracterizam por seu metabolismo anaeróbio facultativo, sendo fermentativo e
respiratório, pois produzem ácido e gás, permitindo a fermentação de vários açúcares como a
lactose, maltose, glicose, entre outros (Andreatti Filho, 2007).

Durante seu processo evolutivo, cepas dessa bactéria alcançaram potencial patogênico,
através da obtenção de genes de virulência, viabilizado por mutações ou por meio de
transferência horizontal de material genético (Saviolli, 2010), conferindo-lhes maior
capacidade de adaptação (Kaper, 2004). Esses genes de virulência têm a capacidade de
codificar proteínas que propiciam a penetração, invasão e colonização dos seus hospedeiros,
ademais localizam-se em ilhas de patogenicidade no cromossomo bacteriano (PAIs do inglês
pathogenicity islands) ou em material genético extra-cromossômico, que são os plasmídeos
(Zhao et al., 2021).
A patogenicidade da E. coli ocorre pela junção de diferentes fatores de virulência, os
quais diferem conforme o sorotipo (Kuhnert et al., 2000). Os fatores de virulência estão
contidos no corpo bacteriano e a E. coli possui estruturas antigênicas que favorecem a
definição dos seus sorotipos. Tal definição leva em consideração a classificação de
Kauffmann, realizada em 1947, dos antígenos somáticos (Öhne - "O"), capsulares (Kapsei "K"), flagelares (Hauch - "H") e fimbriais (Fimbriae - "F"). Além dessas, ainda há amostras
rugosas, autoaglutinantes, que não devem ser sorotipadas em razão da perda da cadeia de
polissacarídeos, seja ela total ou parcial (Rocha, 2008). Vale ressaltar que o antígeno somático
"O" é um lipopolissacarídeo (LPS), substância que faz parte da parede celular das bactérias
Gram-negativas e confere-lhes resistência (Magalhães et al., 2007).
Há cepas de E. coli com diferentes estratégias adaptativas coexistindo ao mesmo
tempo, pois elas suportam ambientes inconstantes, de modo que a pressão seletiva de cada
hospedeiro difere (Tenaillon et al., 2010). Amostras patogênicas de E. coli evidenciam que
seus mecanismos de virulência são específicos e que podem ser constituintes inerentes do
micro-organismo ou de genes adquiridos por meio de plasmídeos, que definem o
aparecimento de linhagens diarreiogênicas e, nesse caso não causam doenças extraintestinais,
ou linhagens que causam patologias extraintestinais. Considerando esse fatores, foi realizada a
classificação dessas bactérias em patótipos: E. coli Enteropatogênica (EPEC), E. coli
Produtora de Toxina Shiga (STEC), E. coli Enteroagregativa (EAEC), E. coli
Enterotoxigênica (ETEC), E. coli Enteroinvasora (EIEC), E. coli uropatogênica (UPEC), E.
coli

patogênica aviária (APEC),

E.

coli meningite

neonatal (NMEC), E. coli

enterohemorrágica (EHEC), E. coli Necrotoxigênica (NTEC), E. coli Aderentes-invasoras
(AIEC) e E. coli Patogênica Extraintestinal (ExPEC), essas últimas não recebem
nomenclaturas específicas e podem ser isoladas de infecções em diferentes localidades como
os pulmões, abdômen, entre outros sítios anatômicos (Croxen, 2010; Saviolli, 2010).

Uma revisão de literatura realizada entre os períodos de janeiro de 2007 a março de
2018 evidenciou que bacteremias causadas por E. coli são comuns em países de alta renda, a
taxa de incidência foi de 40 por 100.000 pessoas por ano e que essa taxa foi aumentando
juntamente com o aumento da faixa etária atingida, chegando a ser maior que 300 em
indivíduos de 75 a 85 anos de idade. De modo geral, a E. coli causou 27% dos casos
registrados de bacteremia, desses 18% nosocomial, 32% associado à assistência médica e
33% adquirido na comunidade. Sendo a taxa de letalidade estimada em 12% (Bonten et al.,
2021). Ademais, estima-se que a cada 10 pessoas, uma delas adoeça por ingerir alimento
contaminado, em 2018 a espécie E. coli foi responsável por mais de 63.000 mortes por
doenças transmitidas por alimentos (WHO, 2018).
Por outro lado, a P. aeruginosa pertencente à família Pseudomonadaceae, apresenta-se
em forma de bacilos, sendo bactérias Gram-negativas, aeróbias, com simples exigências
nutricionais para desenvolverem-se, sendo capazes de oxidar glicose, possuindo motilidade
advinda de flagelos polares e habitam diversos ambientes, sejam eles terrestres ou aquáticos,
tecidos vegetais ou animais e locais bióticos ou abióticos (Azam, 2019). Ressalta-se que esses
micro-organismos fazem parte da microbiota habitual da pele humana e em indivíduos
saudáveis não provoca doenças, sendo então, um patógeno oportunista, que depende das
condições do hospedeiro em harmonia com a atuação dos seus fatores de virulência para
causar patologia (Pollack, 2000).
A OMS publicou uma lista prioritária de patógenos bacterianos, evidenciando que é
urgente a pesquisa e o desenvolvimento de novos antibióticos e a espécie P. aeruginosa está
elencada na categoria "crítica" dessa lista (Tacconelli et al., 2018). Esse patógeno está
relacionado à inúmeras infecções agudas e crônicas, como infecções do trato urinário (ITU),
otite externa, pneumonia associada à ventilação mecânica, fibrose cística, lesões de feridas e
queimaduras, ossos e infecções articulares, bacteremia e infecções sistêmicas (Botelho, 2019).
Essas bactérias possuem como característica própria uma baixa sensibilidade a
antimicrobianos, em razão da baixa permeabilidade da sua membrana, como também a sua
capacidade de formar biofilme, de produzir enzimas β-lactâmicas e aumentar a expressão da
bomba de efluxo (Jurado-Martin, 2021). Ademais, assim como a E. coli, as P. aeruginosa
expressam resistência através da aquisição de genes externos por intermédio da transferência
horizontal ou por mutações de genes cromossômicos. Tal fato limita as opções terapêuticas,
uma vez que esse micro-organismo é resistente a uma grande parte dos agentes
antimicrobianos, incluindo aqueles mais escolhidos para o tratamento de bactérias
multirresistentes (MDR do inglês multidrug-resistant): do carbapenem às cefalosporinas de

terceira geração (Azam, 2019), que são β-lactâmicos, fluorquinolonas e aminoglicosídeos, daí
decorrendo uma alta taxa de morbidade e mortalidade (Chegini, 2020).
De acordo com dados de um estudo realizado no período de 2010 a 2015, em 703
unidades de terapia intensiva ao redor do mundo, as infecções hospitalares causadas por P.
aeruginosa tornaram-se uma grande preocupação, sobretudo devido a sua resistência a
diferentes antimicrobianos. Corroborando com esse problema, em 2016 o Centro de
Prevenção e Controle de Doenças da Europa publicou um relatório com dados de 2014
informando que essa espécie bacteriana era a mais isolada em casos de pneumonia adquirida
em unidades de terapia intensiva em países europeus, bem como era a espécie mais prevalente
em infecções do trato urinário e sanguínea adquiridas em unidades de terapia intensiva
(Botelho, 2019). Estima-se que 11% das infecções nosocomiais são causadas por P.
aeruginosa e que sua taxa de mortalidade atinge 60%, tendo como mais suscetíveis os
indivíduos imunocomprometidos (Ambutsi, 2021).
Já a Candida albicans é um fungo dimórfico que comumente coloniza a mucosa dos
sistemas gastrointestinal e genitourinário dos humanos, onde convive em equilíbrio com os
demais componentes da microbiota, contudo quando há queda da imunidade do hospedeiro
esse micro-organismo tem capacidade patogênica (Vila et al., 2020). Outrossim, possui
habilidade de se adaptar às alterações de pH, de temperatura, de disponibilidade de O2 e
nutrientes (Santos et al., 2006).
Nas infecções em humanos, sejam superficiais ou invasivas e em diferentes
localizações do corpo, C. albicans tem sido frequentemente isolado em forma de levedura
(Simitsopoulou et al., 2013). Seus fatores de virulência viabilizam a adaptação da espécie ao
ambiente, dentre eles citam-se: produção de adesinas, de proteínas lipolíticas e proteolíticas.
Ademais, sua característica dimórfica enseja a mutação de leveduras para hifas e isso implica
em uma maior capacidade de invasão aos tecidos e maior termotolerância (Akbari, 2015),
além da capacidade de formação de biofilmes (Vila et al., 2020). O fato de ser comensal
facilita ainda mais sua rápida adaptação às mudanças ambientais do hospedeiro, mesmo
quando há restrição de nutrientes, sendo comum a indução à formação de pseudohifas como
um indicador de maior virulência dessa espécie (Dadar et al., 2018)
Esse fungo possui susceptibilidade inerente aos antifúngicos sistêmicos que são
aplicados na terapêutica de infecções sanguíneas (candidemia). Todavia, já foram registrados
casos de resistência adquirida aos azóis e equinocandinas, que são medicamentos antifúngicos
(Mattei et al., 2013). É relevante salientar que a espécie C. albicans tem elevada habilidade de
formar biofilme, promovendo a adesão não só aos tecidos do hospedeiro, mas também a

equipamentos médicos, como cateteres, por exemplo e isso viabiliza a disseminação do
patógeno via sistema circulatório, dificultando o tratamento (Vila et al., 2020).
A C. albicans está fortemente associada à candidíase invasiva, sendo responsável por
46,3% de incidência dessa patologia, como também está associada a uma taxa de mortalidade
de aproximadamente 40%, por infecções sistêmicas (Dadar et al., 2018). Infecções fúngicas
causadas por Candida spp., especialmente em indivíduos imunocomprometidos ou com
doença crônica de base, são de grande preocupação por elevada morbidade e mortalidade
(Santos et al, 2020b).
3.3 Fungos e a prospecção de antimicrobianos
3.3.1

Características gerais dos fungos filamentosos e produção de antimicrobianos
Os fungos fazem parte do reino Fungi, são eucariontes heterótrofos, podendo

apresentar-se de forma unicelular, como as leveduras ou de forma filamentosa, contendo hifas.
Ademais são dimórficos, ou seja, possuem a capacidade de mudar de forma de acordo com as
alterações ambientais onde se encontram (Tedersoo et al., 2010). Por apresentarem uma
notável habilidade de adaptação, são capazes de colonizar diversos ambientes, assim podem
ser encontrados em todos os ecossistemas, inclusive aqueles que possuem características
extremas (Onofri et al., 2011; Selbmann et al., 2013).
Em 2007, foi proposta a classificação mais atual do reino Fungi, sendo respaldada em
estudos filogenéticos e organizada da seguinte forma: sete filos, dez subfilos, 35 classes, 12
subclasses e 129 ordens. Os filos são: Ascomycota, Basidiomycota, Blastocladiomycota,
Chytridiomycota, Glomeromycota, Microsporidia e Neocallimastigomycota. Já o grupo
Zygomycota não possui mais valor taxonômico e passou a ser separado em quatro subfilos:
Entomophthoromycotina, Kicxellomycotina, Mucoromycotina e Zoopagomycotina (Hibbett
et al., 2007).
Os fungos filamentosos promovem a decomposição de matéria
orgânica complexa, como lignina e celulose, além de outros polímeros e realizam a ciclagem
de nutrientes, contribuindo, desse modo, para a sustentabilidade do meio ambiente (Dashtban
et al., 2010). Tais organismos ainda contribuem efetivamente na evolução de espécies
vegetais, uma vez que atuam em sua nutrição e constituem simbiose com plantas (Buée,
2009), por esses motivos têm relevância crucial nos diferentes ambientes em que se localizam.
Outrossim, esses organismos dispõem de alta diversidade metabólica, que lhes permite

degradar não somente resíduos orgânicos, mas também substâncias com características
tóxicas (Harms et al., 2011).
Os fungos possuem uma imensa diversidade de espécies e são reconhecidos por
gerarem uma grande variedade de compostos bioativos que atuam em diferentes áreas, como a
biomédica, farmacêutica, agricultura, industrial, têxtil e tantas outras. O Quadro 1 evidencia
um compilado de estudos com antimicrobianos produzidos por fungos filamentosos isolados
de diferentes localidades, como: solo, mar, mangue, raiz de planta, algas e esponjas marinhas.
Para tanto, foram utilizados diferentes meios de cultura com o intuito de fornecer um
ambiente adequado para o desenvolvimento dos micro-organismos pesquisados, entre os
meios empregados estão: Czapek enriquecido com glicose, ágar batata dextrose, levedura
sacarose, extrato de malte e caldo batata dextrose.

Quadro 1. Aspectos gerais da produção de antimicrobianos por fungos filamentosos de origem ambiental: espécie fúngica, meio de incubação, forma de extração dos
metabólitos, composto antimicrobiano, micro-organismos sensíveis e referências.
Fungo
Aspergillus sp.
DHE 4

Amostra e local de
isolamento
Solo (província de
Qalyubia, Egito)

Emericella sp.

Mar (não informa a
localização)
Pestalotia sp. Isolado da alga marrom
CNJ-32
Rosenvingea sp.
coletado nas Ilhas
Bahamas
Leucostoma
Mangue vermelho
persoonii
(Rhizophora mangle)
Leucostoma
Mangue vermelho
persoonii
(Rhizophora mangle)
Lindgomycetaceae
Isoladas de uma
family
esponja do Mar Báltico
e da Antártida.

Penicillium
meleagrinum var.
viridiflavu
Penicillium
meleagrinum var.

Meio de cultura /
Extração
Composto antimicrobiano
incubação
(solvente)
Czapek com glicose Acetato de etila 4 - hidroxi - 4 - metil - tetrido
por 4 dias a 28ºC e
- pirona; R (−)
ágar batata dextrose, 7
-mevalonolactona, composto
dias a 28ºC
poli-hidroxi esteroidal, ácido
kójico juntamente com uma
mistura de α/β-glicosídeo
NI
NI
Emericellamide A e B

Micro-organismos sensíveis (MIC)

Referência

Staphylococcus aureus,
Bacillus subtilis,
Candida albicans
(não informa a MIC)

ABDEL-RAZEK,
A.S. et al., 2020

MRSA (A, MIC 3.8; B, MIC 6.0 μM)

BARBOSA, F. et
al., 2020

NI

NI

Pestalone

MRSA (MIC 0.037 μg/mL) VREF (MIC
0.078 μg/mL)

NI

NI

Cytosporone B

MRSA (MIC 78 μM)

NI

NI

Cytosporone E

MRSA (MIC 72 μM) MSSA (MIC 72 μM)

NI

NI

Lindgomycin (50) e
ascosetin (51)

Mar (não informa a
localização)

NI

NI

Melearoride A e B

B. subtilis (50, MIC 2.2; 51, MIC 3.4 μM),
Staphylococcus epidermidis (50, MIC 4.6; 51
, MIC 6.3 μM)
S. aureus (50 , MIC 2.7; 51 , MIC 2.9 μM)
Propionibacterium acnes (50 , MIC 4.7; 51 ,
MIC 2.8 μM) MRSA (50 , MIC 3.2; 51, MIC
5.1 μM)
Candida albicans (50, MIC 5.7; 51, MIC 8.0
μM)
Sinergismo com
fluconazol contra C. albicans resistente a azol

Mar (não informa a
localização)

NI

NI

PF1163A, B, H e F

C. albicans resistente ao azol (A,

viridiflavu

MIC 1; B, MIC2; H, MIC 16; F, MIC 8
μg/mL) Sinergismo com fluconazol contra C.
albicans resistente

Stagonosporopsis
cucurbitacearum

Mar (não informa a
localização)

NI

NI

Didymellamide A

Trichoderma sp.

Mar da Groenlândia

NI

NI

Pyridoxatin

Aspergillus
candidus KUFA
0062

NI

NI

Preussin

Zygosporium
sp. KNC52

NI

NI

Sulfoalkylresorcinol

NI

NI

Petromurin C

Aspergillus
candidus
KUFA 0062
Aspergillus
terreus var.
africanos

Isolado da esponja
marinha Epipolassis sp.
Solo (Sultanato de
Omã)

Quatro meios
Extraído com
diferentes (extrato de
n-butanol
levedura sacarose
(saturado com
batata dextrose,
água) e
czapek's dox e extrato
reextraído
de malte de levedura novamente por
ágar extrato de malte) quatro vezes
e incubadas por 5-7
repetidas.
dias a 25°C

Petromurin C

C. albicans resistente ao azol (MIC 3,1
μg/mL)
C. albicans sensível ao azol (CIM 3,1 μg/mL)
C. glabrata (CIM 3,1 μg/mL) Cryptococcus
neoformans (CIM 1,6 μg/mL)
B. subtilis (IC 50 5 μM) S. epidermidis (IC 50
4 μM) MRSA (IC 50 4 μM)
C. albicans (IC 50 26 μM) Trichophyton
rubrum (IC 50 4 μM)
S. aureus (MIC 32 μg/mL) Enterococcus
faecalis (MIC 32 μg/mL) MRSA (MIC 32
μg/mL) VRE (MIC 32 μg/mL) Efeito
sinérgico com oxacilina contra MRSA Efeito
sinérgico com colistina contra E. coli
MRSA (MIC 12.5 μg/mL) MDR
Mycobacterium tuberculosis (MIC 166
μg/mL) Mycobacterium bovis (MIC 166
μg/mL) Mycobacterium avium (MIC 166
μg/mL) MDR P. aeruginosa (MIC 50 μg/mL)
Efeito sinérgico com oxacilina
contra MRSA
Candida albicans, Lactobacillus acidophilus, ALKHULAIFI, M.
Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus
et al., 2019
gordonii, e Streptococcus mutans

Aspergillus flavus
DPUA 1451

Alternaria
alternata

Fusarium
proliferatum
ACQR8

​

Solo (Sultanato de
Omã)

Quatro meios
Extraída por
diferentes (extrato de refluxo em 2
levedura sacarose
litros de etanol
batata dextrose,
fervido por 120
czapek's dox e extrato min e reextraída
de malte de levedura novamente por
ágar extrato de malte)
três vezes
e incubadas por 5-7
dias a 25°C
Isolado de Picrorhiza Ágar batata dextrose
metanol e
kurroa de Garhwal incubado por 15 dias a acetato de etila
Himalaia, Índia.
25°C

Não informado

Candida tropicalis,
C. parapsilosis e
C. albicans DPUA 1706

NI

Escherichia coli (MTCC 443)
Serratia marcescens (MTCC-97),
Bacillus subtilis (ATCC-441),
Staphylococcus
aureus (MTCC-740)

CHANDRA, H. et
al., 2021

Tecidos radiculares de Caldo batata dextrose, Extraído com
ácido N-hexadecanóico K. pneumoniae (40 mg/mL), S. boydii (46.67
Cissus quadrangularis
21 dias a 27°C
acetato de etila,
(19,54%), fenol,
mg/mL), E. faecalis (120 mg/mL), E. coli
SINGH, A. et al.,
L.
filtrado por três 2,4-di-terc-butil (16,94%), (106.67 mg/mL), S. aureus (70 mg/mL), S.
2021
vezes utilizando
ácido
typhi (50 mg/mL), A. hydrophila (66,67
tecido de
1,2-benzenodicarboxílico,
mg/mL), R. solani (0,2 mg/mL), F.
musseline em
éster dibutílico (7,93%),
oxysporum (1,6 mg/mL), T. mentagrophyte
funil, a parte
metil 14(2,0 mg/mL), M. gypseum (2,33 mg/mL)
orgânica foi
metilpentadecanoato
coletada e
(5,86)%, E-15-heptadecenal
concentrada em (4,91%), óxido de limoneno
evaporador
(2,97%), ácido
rotativo e foram 9-octadecenóico (Z)-, éster
para secagem
metílico (2,47%) e outros

NI = Não informado
Fonte: a autora (2023).

Já para realizar a extração dos compostos com atividade antimicrobiana, destacam-se
os solventes: acetato de etila (C4H8O2), n-butanol (C4H10O), etanol (C2H5OH) e metanol
(CH3OH). Esse compilado evidencia que, mesmo diante de diferentes técnicas e espécies
fúngicas, os metabólitos secundários produzidos por fungos de lugares distintos apresentaram
resultados satisfatórios em relação à ação antimicrobiana (Quadro 1). Esses estudos
enriquecem o conhecimento sobre os compostos sintetizados por fungos, bem como
intensifica o seu valor na área de produtos naturais (Singh et al., 2021).
3.4 Produtos naturais como fontes de antimicrobianos
3.4.1 Contextualização histórica
A utilização de micro-organismos para combater doenças remonta a um passado bem
distante, há registros em papiro de Ebers, datado de 1550 A.C., informando o uso de solo
medicinal e pão mofado como fármacos (Hass, 1999). Há mais de 2000 anos em locais como
China, Grécia e Egito aplicava-se emplastro de pão mofado para tratar feridas e também na
tentativa de utilizar micro-organismos produtores de antimicrobianos com o intuito de
prevenir doenças (Hutchings, 2019). Nessa conjuntura, no século XIX evidenciou-se que
bactérias causam infecções, fato que impulsionou a pesquisa de processos terapêuticos,
culminando, meio século depois, com a descoberta dos antibióticos (Davies, 2010).
Em 1890 relata-se a primeira vez em que um antibiótico foi utilizado. Os médicos
alemães Emmerich e Low isolaram micro-organismos de bandagens empregadas em feridas
infectadas e perceberam que havia uma coloração verde-azulada, em seguida realizaram a
cultura do Bacillus pycyaneus, que atualmente recebe o nome de P. aeruginosa, aplicaram
seus extratos em indivíduos doentes e os denominaram de piocianase (Hutchings, 2019). E em
1928 temos a descoberta da penicilina, famoso achado característico pela contaminação da
placa de Petri do biólogo e médico Alexander Fleming, enquanto ele estudava sobre a bactéria
S. aureus, a amostra bacteriana ficou por uma ou duas semanas em temperatura ambiente e
“mofou”, então ele observou que as bactérias haviam perdido sua ação ou haviam sido mortas
pelo fungo Penicillium notatum (Geddes, 2008). Então por volta de 1930 o termo
"antibiótico" foi utilizado pela primeira vez por Selman Waksman, bioquímico que registrou
que os micro-organismos são capazes de produzir compostos que destroem outros
micro-organismos, em tempo em que identificou Actinomycetes filamentosos que vivem no
solo e, a partir disso, descobriu diferentes antibióticos produzidos por produtos naturais ou
metabólitos secundários, dentre eles estreptomicina e neomicina (Waksman, 2010).

Diante de todas as conquistas a partir de produtos naturais com ações
antimicrobianas tão efetivas deu-se a era do ouro, de 1940 a 1960, lembrando que muitos
desses fármacos ainda estão em uso na atualidade. Já na década de 1970, com o uso excessivo
dos medicamentos, devido ao boom de descobertas e ao largo uso, possivelmente contribuiu
para o crescente desenvolvimento dos mecanismos de resistência dos micro-organismos. A
partir desse momento houve um hiato na história, novas descobertas foram realizadas, mas
relativamente pouco se comparada à época do auge (Prescott, 2014; Katz, 2016).
3.4.2 Caracterização dos produtos naturais de maneira geral e sua atividade antimicrobiana
Produtos naturais são definidos como substâncias químicas oriundas de fontes
fúngicas, bacterianas, vegetais e animais, que são classificados também como metabólitos
secundários e possuem diversas funções biológicas com aplicabilidade econômica na
medicina, veterinária, agricultura, dentre outros (Katz, 2016). O termo “metabólitos
secundários” é bastante utilizado para descrever substâncias que os organismos produzem,
mas que não possuem função primária no seu desenvolvimento, contudo são importantes para
sua sobrevivência, proporcionando vantagens adaptativas (Katz, 2016; Kavanagh, 2017).
A natureza tem uma imensa diversidade química, de forma que os produtos naturais
são tidos como montantes de compostos bioativos com capacidade terapêutica, assim cada vez
mais pesquisadores buscam isolar produtos naturais de micro-organismos em busca de
conhecer seus mecanismos de ação e explorar suas potencialidades (Huang, 2021). Além
disso, esses produtos geralmente apresentam boa biodisponibilidade, o que é ideal para os
ensaios funcionais (Ding et al., 2017). As principais ações descritas dos metabólitos
secundários são comunicação, regulação e defesa. Ademais, eles apresentam inúmeras
funções fisiológicas e químicas, podendo agir como hormônios, vitaminas, toxinas,
neurotransmissores, por exemplo. As possibilidades de atividades são incontáveis (Berdy,
2012). Outra ação estudada dos produtos naturais é sua ação antienvelhecimento, estima-se
que a cada 300 compostos que possuem essa atividade, 185 deles sejam derivados de produtos
naturais, uma vez que a maioria dos seus extratos têm apresentado ação antioxidante.
Ressaltando-se que os mecanismos de ação são diferentes entre si (Ding et al., 2017).

3.5 Micro-organismos como fontes de antimicrobianos
Se por um lado os micro-organismos causam doenças em humanos, por outro têm
contribuído sobremaneira na descoberta de drogas responsáveis por curar inúmeras
enfermidades, como ainda continuam sendo objeto de estudos e ensaios clínicos importantes,
fornecendo mais e mais pistas (Saklani, 2008). Os micro-organismos predominam no
desenvolvimento de agentes terapêuticos e, dentre eles, bactérias do filo Actinobacteria são os
que mais produzem compostos bioativos, sendo aplicados na agricultura, medicina e
veterinária (Jakubiec-Krzesniak et al., 2018). Dos antimicrobianos descobertos entre os anos
de 1945 e 1978, 55% foram derivados de actinomicetos do gênero Streptomyces e, dentre as
classes de antibióticos conhecidas até 2019, 64% delas foram derivadas de actinomicetos
filamentosos (Hutchings, 2019).
As drogas oriundas dos actinomicetos, apresentam atividades antimicrobianas
distintas, assim possuem espectros diferentes. De acordo com as condições de cultivo, bem
como com o meio de cultivo utilizado e da espécie isolada, a natureza dos ativos
desenvolvidos será distinta (Waksman, 2010). Diferentes métodos são constantemente
elaborados com o objetivo de ativar os metabólitos secundários dos actinomicetos, como, por
exemplo, o uso de culturas combinadas e com isso alcançar atividades distintas, como
antifúngica, antibacteriana, antiviral, antitumoral e enzimática (Jakubiec-Krzesniak et al.,
2018).
Os actinomicetos são bactérias Gram-positivas, conhecidas como actinobactérias e
possuem algumas características que se assemelham a fungos, como a formação de esporos
aeróbicos, ainda se caracterizam com substrato de micélio aéreo, além de serem filamentosas
e portarem hifas aéreas (Bhatti, 2017). As actinobactérias são amplamente difundidas, de
modo que são encontradas em ambientes terrestres, marinhos e também de água doce,
ademais suas atividades envolvem fragmentação de matéria orgânica e substâncias
xenobióticas (Ballav, 2012). Dentro do filo de actinobactérias, o gênero Streptomyces produz
diversas classes de antibióticos, dentre eles citam-se: eritromicina, cloranfenicol, neomicina,
estreptomicina, tetraciclinas, nistatina, como também agentes antitumorais, vitaminas e
aminoácidos (Santana, 2015).

3.6. Atividade antioxidante de produtos microbianos
3.6.1 Estresse oxidativo e Atividade antioxidante
Para o funcionamento habitual do organismo existe uma série de reações acontecendo
no corpo e determinadas reações provocam a liberação de Espécies Reativas de Oxigênio
(EROs) e Espécies Reativas de Nitrogênio (ERNs), que causam danos oxidativos em
biomoléculas importantes como ácidos nucléicos e lipídeos, além de influenciarem em
processos celulares como apoptose, provocando processos patológicos e degenerativos no
organismo humano (Ujam et al., 2021).
O oxigênio é de fundamental importância para o funcionamento do metabolismo dos
seres aeróbicos, porém quando ocorrem as reações de ganho e perda de elétrons, o que é
esperado dos processos celulares, há a formação dos compostos reativos, que são ou originam
radicais livres. As EROs são moléculas de O2 com elétrons isolados, altamente reativas e
originadas por reações endógenas e exógenas. Comumente, nas moléculas os elétrons se
organizam em pares, ganhando estabilidade e o contrário ocorre quando os elétrons estão
desemparelhados, o que viabiliza as reações em cadeia que findam por desestabilizar o
equilíbrio molecular (Scharffetter-Kochanek et al., 2000).
Analisando o oxigênio pela sua estrutura eletrônica, verifica-se que ele tende a ganhar
um elétron de cada vez, possibilitando a formação de compostos intermediários com alta
reatividade, tais como: o radical hidroxila (OH-), o ânion radical superóxido (O2-) e o
peróxido de hidrogênio (H2O2) (Ridaoui et al, 2021). Dentre as organelas e estruturas
celulares que participam das reações endógenas que originam os radicais livres podemos citar
as membranas, núcleos, mitocôndrias, peroxissomos, lisossomos e retículo endoplasmático. Já
as reações exógenas envolvidas nessa produção estão relacionadas a hábitos de vida dos
indivíduos, tais como o uso de tabaco, solventes orgânicos, pesticidas, exposição excessiva e
desprotegida à radiação solar e poluição ambiental (Boulebd, 2020).
É importante destacar que as ERO/ERN desempenham papéis fisiológicos como na
regulação do crescimento celular, na fagocitose, ação no sistema imunológico, sinalização
intracelular, produção de energia e atuação na formação de substâncias biológicas, tais como
enzimas e hormônios. Portanto, os radicais livres também são capazes de produzir efeitos
favoráveis ao organismo quando produzidos de maneira regular (Hadidi et al., 2022).
Contudo, quando a geração de ERO/ERN torna-se maior do que a capacidade antioxidante
celular, acontece uma condição designada estresse oxidativo, sendo bastante danosa às células
do organismo (Munteanu; Apetrei, 2021). Sendo assim, faz-se necessária a utilização de

substâncias com ação antioxidante, as quais são capazes de neutralizar os radicais livres
(Tavares et al., 2018), prevenindo a oxidação de moléculas do organismo e impedindo as
reações oxidativas em cadeia (Ujam et al., 2021).
As substâncias com ação antioxidante são classificadas em enzimáticas e não
enzimáticas, onde as primeiras são enzimas como a catalase (CAT), glutationa peroxidase
(GPx), glutationa redutase e superóxido-dismutase (SOD), enquanto as não enzimáticas são
vitaminas (A, C e E), pigmentos naturais, minerais, carotenoides, compostos fenólicos dentre
outras. Ademais, tais substâncias podem ter origem natural como o α-tocoferol, o ácido
ascórbico e ácido gálico ou podem ser de origem sintética e neste caso são umas das mais
aplicadas na indústria alimentícia, por exemplo, com o intuito de inviabilizar a oxidação
lipídica dos produtos, aumentando assim o tempo de vida de prateleira dos produtos
alimentícios.

Dentre

os

exemplos

de

antioxidantes

sintéticos,

destacam-se

o

butil-hidroxitolueno (BHT), o hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromo–2 ácido carboxílico (Trolox) e
butil-hidroxianisol (BHA) (Boulebd, 2020).
Outrossim, os antioxidantes também são classificados em primários e secundários,
sendo os primeiros doadores de elétrons aos radicais livres, assim permitem que os produtos
em que são aplicados fiquem mais estáveis termodinamicamente, nessa classe encontram-se o
BHT, BHA, carotenoides e tocoferóis. Enquanto os secundários decompõem hidroperóxidos
e, com isso, diminuem a taxa de iniciação da oxidação ao tempo em que favorecem a
atividade antioxidante dos primários, nesse grupo encontram-se os ácidos ascórbico, cítrico e
tartárico. Alguns antioxidantes possuem mais de um mecanismo de atuação e, por isso, são
tidos como antioxidantes de múltipla função (Couttolenc et al, 2020). Ainda, os antioxidantes
secundários também são classificados como sinergistas, uma vez que viabilizam a atividade
dos antioxidantes primários (Battistella, 2020).
O processo oxidativo acontece em três etapas: iniciação, propagação e término, como
pode ser visto na figura 2. Na iniciação, há a remoção de um hidrogênio de carbono alílico na
molécula do ácido graxo, o que viabiliza a formação de radicais livres, em condições
adequadas de luz e calor. Na etapa da propagação, os radicais livres suscetíveis ao ataque do
oxigênio são convertidos a outros radicais, que são os peróxidos e hidroperóxidos, produtos
primários da oxidação. Trata-se de um processo autocatalítico e os radicais formados nesta
etapa são propagadores da reação. Já na etapa do término, dois radicais se combinam e
formam produtos estáveis, secundário da reação e obtido por cisão e rearranjo dos peróxidos
(Battistella, 2020).

Figura 2: Demonstração geral do mecanismo de oxidação lipídica, onde RH- ácido graxo
insaturado, R°- radical livre, ROO° - Radical peróxido e ROOH – hidroperóxido.

Fonte: Ramalho e Jorge, 2006.

É importante ressaltar que, mesmo sendo bem efetivos e importantes para o aumento
da vida útil de diversos produtos, os antioxidantes sintéticos possuem seu uso restrito em
alguns países como o Canadá, por exemplo. Tal restrição é em razão de causarem efeitos
deletérios ao organismo humano e por isso há um grande interesse em prospectar novos
antioxidantes procedentes de fontes naturais (Liu, 2022).
3.6.2 Antioxidantes de origem fúngica
A produção de metabólitos secundários por micro-organismos é bastante estudada,
pois é a partir deles que se obtêm inúmeros compostos bioativos. Há em torno de 23.000
metabólitos secundários de ação conhecida, sendo cerca de 42% deles produzidos por fungos,
mais 42% produzidos por actinomicetos e 16% por eubactérias (Castro, 2020).
Na composição dos micro-organismos há grupos de genes críticos que ao serem
ativados quando estão submetidos a fatores limitantes ou situações extremas viabilizam a
produção dos metabólitos secundários e, muitos deles, apresentam potencial antioxidante
(Rani, 2021). Os fungos produzem diversas enzimas, dentre elas, as enzimas antioxidantes,
que atuam também como defesa microbiana contra à ação do sistema imunológico como
ocorre nos lisossomos, com altos níveis de agentes oxidantes, diante de infecções causadas

por esses micro-organismos patogênicos. As peroxirredoxinas (Pxr) são exemplos dessas
enzimas que atuam protegendo esses micro-organismos contra a ação oxidativa de defesa do
hospedeiro humano. Vale destacar, que as Prxs apresentam seis classes distintas e
relacionam-se com a patogênese dos micro-organismos (Oliveira et al, 2021).
Os fungos produzem uma gama de metabólitos secundários que apresentam atividades
com aplicabilidades biotecnológicas importantes, ao exibirem atividades antibacterianas e
antifúngicas, tendo como vantagem o fato de que a prospecção química dos seus metabólitos,
quando comparado a fontes vegetais, pode acontecer com mais facilidade e em larga escala
por meio do processo de fermentação, sem que haja prejuízos ao meio ambiente (Hyde et al,
2019; Keller, 2019). Além disso, fontes sintéticas dos compostos antioxidantes podem
provocar toxicidade ao homem, através dos produtos que originam na sua degradação, o que
limita seu uso (Kaur et al, 2020). Nessa conjuntura, a produção de compostos bioativos vem
se destacando na medicina, com ênfase em seu impacto positivo sobre as doenças
relacionadas ao estresse oxidativo. Uma vez que os compostos antioxidantes possuem
propriedades farmacológicas, por meio de atividades anti-inflamatórias, antimicrobianas e, até
mesmo, antitumorais (Hyde et al, 2019).
O metabolismo dos fungos é capaz de produzir diferentes compostos orgânicos com
atividade antioxidante, dentre eles estão as substâncias: alcalóides, ácidos fenólicos,
carotenoides, polifenóis, terpenos, xantonas e seus derivados, importantes na promoção da
atividade antioxidante, favorecendo à saúde tanto de humanos quanto de animais (Romão et
al, 2022). Nesse contexto, estudos referem que fungos dos gêneros Fusarium, Alternaria,
Aspergillus, Cladosporium, Colletotrichum, Curvularia, Diaporthe e Penicillium são capazes
de produzir substâncias bioativas com atividade antioxidante (Rai et al, 2022).
Os compostos fenólicos têm capacidade de inutilizar a peroxidação lipídica, promover
a quelação de íons metálicos e coibir a decomposição de hidroperóxidos em radicais livres,
tudo isso devido ao fato de serem doadores de hidrogênio bastante efetivos, ou seja, são
doadores de elétrons para radicais livres (Chandra, 2020), além disso sua estrutura favorece a
atividade antioxidante, pois esses compostos apresentam anéis aromáticos, ligações duplas e
muitos grupos funcionais (Duda-Chodak, 2023). Através do processo fermentativo, seja por
meio de cultura sólido ou líquido, possibilita meios adequados para que diferentes cepas
fúngicas produzam ácidos gálico e ferúlico, por exemplo. Tais ácidos orgânicos têm ação
antioxidante, pois apresentam de dois a quatro grupos hidroxilas reativas. Assim como esses,
outros compostos fúngicos, como a astaxantina e a zeaxantina, também possuem grupos
hidroxila reativos, o que associa ao efeito antioxidante (Zhang et al, 2018).

Ainda sobre a produção de compostos fenólicos, foi comprovado que os fungos
Chaetomium sp., Cladosporium sp., Torula sp. e Phoma sp. são bons produtores de
antioxidantes, destacando-se o ácido benzóico, rutina e terpenóides (Chandra, 2020). Em
relação à produção de carotenoides, os fungos filamentosos que recebem destaque na
formação de β-caroteno são: Blakeslea trispora, Fusarium sporotrichioides, Mucor
circinelloides, Neurospora crassa e Phycomyces blakesleeanus. β-caroteno é um pigmento
fúngico com atividade antioxidante, além de ser precursor da vitamina A, sendo importante
para beneficiar a visão, pele e sistema imunológico (Hyde et al, 2019). Outro carotenoide com
ação antioxidante é o licopeno, o qual é produzido pela espécie Blakeslea trispora,
3.6.3 Métodos de atividade antioxidante
A fim de pesquisar, in vitro, a atividade antioxidante de substâncias com esse
potencial, incluindo extratos vegetais, há diferentes métodos descritos na literatura que variam
de acordo com a forma de inibição da cadeia de reação de oxidação, ocorrendo das seguintes
formas: quando o antioxidante age como aceptor de elétrons ou como doador de hidrogênio,
formando radicais estáveis, ou ainda pela inibição de determinadas vias produtoras de radicais
livres (Couttolenc et al, 2020). Cada método possui uma forma de avaliação mais adequada,
que pode ser por espectrofotometria, cromatografia ou por técnica eletroquímica. Outrossim,
os ensaios baseados na transferência de elétrons estão na dependência do solvente e do pH,
por outro lado, os testes baseados na doação de hidrogênio dependem tanto do pH e do
solvente quanto da energia empregada na dissociação da ligação do grupo que atua doando o
hidrogênio (Siddeeg et al, 2021).
Os métodos que envolvem a doação de hidrogênio são os testes de: Parâmetro
Antioxidante de Retenção de Radicais Peroxil Total (TRAP), Capacidade Antioxidante de
Radicais Hidroxílicos (HORAC), Capacidade Total de Eliminação de Radicais Oxirídricos
(TOSC) e de Capacidade de Absorção de Radicais de Oxigênio (ORAC). Enquanto aqueles
que transferem um elétron são: Potência Antioxidante Redutora Férrica (FRAP), Capacidade
Antioxidante Redutora Cúprica (CUPRAC) e o de Folin–Ciocalteu. Já os testes que englobam
a transferência de elétron e de hidrogênio são os testes de: 2,2'-Azinobis-(3- ácido
3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico) (ABTS) e o 2,2-difenil-1-picril-hidrazil (DPPH) (Munteanu;
Apetrei, 2021).
Aqui serão destacados os métodos DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazil) e FRAP (do
inglês Ferric Reducing Antioxidant Power), que são técnicas colorimétricas, de rápida
execução e de baixo custo. O primeiro método fundamenta-se na captura do radical DPPH,

havendo uma reação de oxirredução, passando então para DPPH-H, ao mesmo tempo em que
há um declínio na absorbância e uma alteração da coloração que varia de roxo para amarelo
(Pires et al, 2017). Ao passo que, o método FRAP baseia-se na transferência de um único
elétron, para tal utiliza-se a substância TPTZ (2,4,6-tripiridil-s-triazina) que possui o íon Fe3+
e viabiliza a produção do íon Fe2+, assim quando a redução se processa há uma mudança na
cor da substância de roxo claro para roxo intenso (Pires et al., 2017; Munteanu; Apetrei,
2021).
3.7 Bioma Caatinga
3.7.1 Bioma Caatinga: Características gerais e riqueza biológica
A Caatinga é um bioma unicamente brasileiro, situado nas regiões de clima semiárido
dos seguintes estados: Alagoas, Bahia, Ceará, Paraíba, Pernambuco, Piauí, Rio Grande do
Norte, Sergipe e a parte norte de Minas Gerais (Figura 3), portanto sua maior concentração
ocorre na região nordeste do Brasil e abrange o total de 1.262 municípios. Apresenta uma área
aproximada de 844.453Km2, correspondendo a 11% do território brasileiro, 70% da região
nordeste (IBGE, 2014; IBGE, 2019) e uma população de 30 milhões de habitantes, sendo a
região semiárida mais populosa do mundo (Andrade et al., 2020), equivalente, em média, a
56% da população do Nordeste (IBGE, 2019).
Figura 3: Mapa do Brasil destacando o bioma Caatinga.

Fonte: Silva, 2019.
Esse bioma é habitualmente chamado de "Polígono da Seca", pois se caracteriza pelo
clima semiárido, com chuvas irregulares, vegetação arbustiva, seca, decídua e espinhosa.
Assim, as espécies da flora são adaptadas à escassez hídrica, já que o índice pluviométrico
anual varia de 240 a 1500 mm, geralmente limitado de janeiro a março. As temperaturas
anuais variam em torno de 27 °C, portanto, elevadas e com insolação, o que requer adequação
da biota à sobrevivência devido às particularidades ambientais da região (Lisboa et al., 2020),
ainda apresenta uma média anual de evaporação em torno de 2000mm e umidade relativa do
ar em torno de 50% (SUDENE, 2021).
Pela sua diversidade vegetal, a Caatinga é um território de valor inestimável, contudo
apenas 8,4% do seu território recebe proteção por unidades de conservação, ademais parte
significativa desse bioma não existe em outro local do globo, tornando-se de suma relevância
sua preservação (Moura et al., 2021). Após os biomas Mata Atlântica e Cerrado brasileiros, a
Caatinga é o bioma mais deteriorado pelas ações antrópicas (Magalhães et al., 2019),
principalmente pela cultura agrícola, pastagens e corte de madeira descomedido (Moura et al.,

2016), disso decorrem alterações significativas no solo, diminuição do desenvolvimento
vegetal e, até mesmo, perda da diversidade biológica (Coelho et al., 2018).
O nome Caatinga significa mata branca e é derivado do idioma tupi-guarani (Conafer,
2022), esse bioma foi batizado assim pela prevalência da sua vegetação típica do semiárido:
xerófitas. Supõe-se que haja 5000 espécies de plantas, sendo 380 delas endêmicas (Cavalcante
et al., 2017), destacando-se as seguintes: xique-xique, mandacaru, juazeiro e macambira
(Freitas, 2005; Queiroz et al., 2017). Em relação aos animais vertebrados, por volta de 1400
espécimes fazem parte desse bioma, sendo 23% delas endêmicas, ademais cerca da metade
das variedades de lagartos e peixes são endêmicas. Em 2018 foram registradas 548 espécies
de aves, delas 509 eram consideradas residentes da Caatinga e esse número provavelmente
deve aumentar, pois estudos taxonômicos ainda estão em andamento (Garda et al., 2018).
Essa região possui grande importância por sua biodiversidade e alta pluralidade de
espécies vegetais, incluindo plantas medicinais, que são amplamente manuseadas pela
população local. Tal fato contribuiu para o desenvolvimento de consistentes estudos
farmacológicos que evidenciaram que plantas desse bioma se mostraram capazes de evitar o
desenvolvimento e aderência bacteriana, bem como diminuir inflamação e viabilidade de
protozoários flagelados (Silva et al., 2015; Santos et al., 2018).
Conforme posto, muitas características da Caatinga não são encontradas em outras
localidades do globo e isto inclui, além, da vegetação e dos animais, os micro-organismos,
que desenvolvem adaptações exclusivas para sobreviver nessa região semiárida. Deste modo,
os micro-organismos retirados desse bioma, são verdadeiras fontes de biomoléculas com
grande potencial de apresentar novas atividades biológicas (Rocha et al., 2019). E, para que
eles sobrevivam adequadamente, precisam enfrentar as condições apresentadas pelo clima
característico da região, destarte é necessário que desenvolvam mecanismos para superar as
alterações de temperatura, insolação, solo com alta salinidade e pouca disponibilidade de
nutrientes. Assim, somente os micro-organismos com habilidade genética de adaptação
metabólica conseguem sobreviver (Cary et al., 2010; Caruso et al., 2011).
3.7.2

Fungos da Caatinga: aspectos gerais e potencial biotecnológico
Os fungos são encontrados em diversos locais no globo, uma vez que

se desenvolvem em diferentes substratos e condições ambientais, além de exercerem relações
com outros organismos, como plantas, animais e, até mesmo, com outros fungos. Outrossim,
eles possuem a capacidade de se adequar a altas e baixas temperaturas, de forma que vivem

satisfatoriamente bem em ambientes considerados extremos, como é o caso da região
semiárida (Oliveira et al., 2013).
Objetivando o enfrentamento das alterações climáticas do semiárido da Caatinga, a
maior parte da vegetação possui relação simbiótica com fungos micorrizos, vencendo, desse
modo, os estresses ambientais, pois os fungos proporcionam às plantas maior tolerância e
resistência, ao dirimir as deficiências nutritivas do solo e o estresse hídrico (Souza et al.,
2003). Outra associação mutualística importante ocorre entre os liquens e as algas, essas
últimas fornecem nutrientes aos fungos e recebem deles um ambiente adequado com acesso a
minerais e água, propiciando seu desenvolvimento (Barbosa-Silva et al., 2019).
No Brasil, há o registro de 5500 espécies de fungos e 850 delas localizam-se na região
semiárida. Considerando todas as características mencionadas, é possível compreender a
existência de uma ampla variedade de fungos na Caatinga e que, nessa região, interferem
ativamente nesse ecossistema (Silva et al., 2020c). Os fungos são essenciais para o equilíbrio
do ecossistema quando exercem suas funções de renovação de solo, ciclagem de nutrientes e
tratamento de resíduos, por exemplo. Mas eles também atuam em outro meio, o
biotecnológico, exercendo função importante na produção de bebidas, alimentos, bioplásticos,
biodiesel, indústrias têxtil, cosmética e farmacêutica (Peixoto; Luz; Brito, 2016).
No solo da Caatinga foram encontrados e registrados fungos filamentosos dos
gêneros: Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Cladosporium, Trichoderma, Pithomyces,
Humicola, Myrothecium, Curvularia, Drechslera, Monodictys, Paecilomyces, Scopulariopsis,
Scytalidium, Staphylotrichum e Stillbella. Salienta-se que houve predominância dos gêneros
Aspergillus e Penicillium, que são comumente encontrados em ambientes desérticos (Oliveira,
2013).
Sendo uma enorme parcela da riqueza genética da Caatinga exclusiva desse bioma, ela
passa a ser um importante local para bioprospecção (Melo, 2016), termo conhecido como a
maneira de se retirar o valor econômico da biodiversidade com base na exploração sistemática
de organismos com potencial econômico e que podem culminar no desenvolvimento de
produtos (Saccaro Júnior, 2011). Na indústria farmacêutica, os fungos recebem notório
destaque, principalmente na produção de antimicrobianos, imunossupressores e agente
hipocolesterolemiante. De modo que são uma rica fonte de compostos bioativos, que podem
apresentar novas ações em busca de suprir uma necessidade tão urgente de novas descobertas
quando se trata de antimicrobianos (Oliveira, 2013). Pois apesar do grande número de fungos
e bactérias encontrados no bioma Caatinga, os micro-organismos ainda têm seu potencial
biotecnológico pouco explorado (Costa et al., 2014).

Diante disso, acessar e estudar a riqueza fúngica do bioma Caatinga pode resultar na
descoberta de novas aplicabilidades desses organismos e a hipótese dessa pesquisa é que os
extratos produzidos por fungos filamentosos não liquenicos isolados de liquens da Caatinga
de Alagoas apresentam atividades antimicrobiana e antioxidante com perspectivas a
aplicações biotecnológicas nessas temáticas.
4

METODOLOGIA

4.1 Tipo de estudo
Trata-se de estudo experimental, de enfoque in vitro, desenvolvido no Laboratório de
Microbiologia, Imunologia e Parasitologia – LABMIP, em parceria com a Central Analítica
do Núcleo de Ciências Exatas – CA-NCEx e o laboratório de Farmacologia e Imunidade –
LAFI, todos da Universidade Federal de Alagoas - UFAL
4.2.Origem e cultivo dos fungos filamentosos da Caatinga
Foi utilizado um acervo de 35 fungos filamentosos previamente isolados de amostras
de liquens de uma região preservada, a Reserva da Tocaia e outra de impacto antrópico, a
Serra do Gugi, ambas do município de Santana do Ipanema, região do semiárido alagoano. Os
isolados de fungos filamentosos da Caatinga, pertencentes ao LABMIP estavam
criopreservados em glicerol (20%), armazenados em ultrafreezer a -80°C, de modo que foram
descongelados em temperatura ambiente. Os isolados foram reativados em meio de cultura
Ágar Sabouraud Dextrose, o qual fora vertido manualmente em placas de Petri (60x15mm)
recobrindo toda sua base, utilizando para isso, em média 10 mL de meio de cultura em cada
placa.
Após a solidificação do meio de cultura, cada placa de Petri recebeu um disco do
fungo utilizando-se uma alça microbiológica, adequadamente flambada e resfriada. Assim
como cada placa fora sinalizada com os códigos fúngicos, a data do procedimento e as iniciais
de quem o executou. As placas de Petri foram devidamente vedadas para evitar o risco de
contaminação e, em seguida, foram incubadas em estufa de 30°C por 7 dias para análise da
pureza e transferência dos isolados para os ensaios de produção de antimicrobianos.

4.3

Identificação dos fungos

4.3.1 Identificação macroscópica e microscópica de fungos filamentosos
As culturas das amostras que apresentaram atividade biológica foram
observadas em suas características macromorfológicas: aspecto da borda, coloração da
colônia e textura da superfície. Ademais, os fungos filamentosos foram submetidos à técnica
de microcultivo, o que permitiu a visualização microscópica das estruturas reprodutivas. Para
tanto, utilizou-se uma alça de inoculação para remover uma alíquota de cada colônia e
transferir para as extremidades de um quadrado pequeno (1 x 1 cm) de meio de cultura Agar
Sabouraud Dextrose, depositado sobre uma lâmina e, logo em seguida, foi posicionada uma
lamínula sobre o meio de cultura. Todo esse conjunto situava-se dentro de uma placa de Petri
e sobre um papel filtro previamente umedecido com solução salina, a fim de fornecer um
ambiente úmido adequado ao crescimento fúngico. Em seguida, foram incubados a 25°C e
visualizados no sétimo dia de crescimento.
4.4.
4.4.1.

Produção e extração dos metabólitos secundários
Produção dos metabólitos secundários fúngicos
Essa etapa foi executada em meio Ágar Czapek acrescido de glicose

(2%), conforme Oliveira (2013), com pequena modificação. Após esterilização do material e
do meio de cultura, utilizou-se pipeta de vidro de 20 mL, objetivando a padronização do
volume nas placas de Petri (90x15mm). Na sequência, os isolados que haviam sido reativados
foram, então, repicados para as placas de Petri com o meio de cultura já solidificado. Em cada
placa foram adicionados três discos do fungo, cada um com 6mm de diâmetro, correspondente
à medida do perfurador utilizado, espaçados de tal forma que desenhavam um triângulo. Para
essa fase foram feitas seis réplicas, pois o intuito foi de se obter uma grande quantidade de
biomassa produtora de extratos fúngicos (Figura 4). As placas de Petri foram incubadas em
estufa bacteriológica sob temperatura de 30,0°C por 14 dias.

Figura 4: Ensaio de produção de biomassa fúngica de isolados da Caatinga, em meio
Czapeck, acrescido de glicose (2%). (A) Pesquisadora vertendo, com auxílio de pipeta de 20 mL, o
meio de cultura nas placas de Petri. (B) Repique do fungo com o uso de perfurador. (C) Distribuição
dos discos de fungo desenhando um triângulo.

Fonte: a autora (2023).

4.4.2 Extração dos metabólitos fúngicos
Após 14 dias de crescimento dos fungos filamentosos e produção de pigmentos, foram
utilizadas 6 placas com biomassa para a extração de metabólitos, onde cada fungo foi retirado
das placas e transferido a um Erlenmeyer com solvente de extração. Para tanto, os micélios
fúngicos com Ágar foram repartidos utilizando-se uma espátula esterilizada e transferidos
para um Erlenmeyer e embebidos com 100 mL de acetato de etila PA, seguido de vedação
com parafilme e protegidos com papel de alumínio para evitar a fotodegradação e foram
armazenados em refrigeração em geladeira durante sete dias para posterior extração da fração
de acetato de etila (Figura 5).
Figura 5: Visualização do processo de extração de metabólitos secundários produzidos por
fungos da Caatinga. (A) Fungo crescido após 14 dias em meio de cultura Ágar Czapek, 2% de
glicose; (B) Repartição e transferência dos micélios fúngicos para Erlenmeyer. (C) Acetato de
etila (100 mL) sendo adicionado aos fungos. (D) Fungos repartidos, embebidos em acetato de
etila e vedados com parafilme.

Fonte: a autora (2023).

4.4.3. Filtração, concentração e secagem dos extratos fúngicos

Passados os sete dias da extração dos metabólitos secundários em
acetato de etila, eles foram submetidos à filtração com o auxílio de papel de filtro Whatman
(200 µm), logo em seguida os Erlenmeyers com os metabólitos foram adequadamente
vedados com parafilme e envolvidos com papel alumínio para impedir a fotodegradação dos
pigmentos. Na sequência, as amostras foram submetidas à concentração dos extratos
microbianos em evaporador rotativo acoplado à bomba de vácuo e temperatura de extração à
temperatura ambiente. Dessa forma, os extratos já concentrados, foram transferidos para
frascos pequenos esterilizados e acondicionados em freezer (-20,0ºC).
Figura 6: Visualização do esquema de filtração e concentração dos extratos fúngicos. (A)
Passagem dos extratos juntamente com o acetato de etila, por filtragem, para outro
Erlenmeyer. (B) Extratos pigmentados após filtragem.

Fonte: a autora (2023).

Os extratos fúngicos foram secos em dessecador acoplado à bomba de vácuo, os
frascos foram pesados antes e após a secagem para obtenção da diferença de peso e, em
seguida, os extratos foram ressuspendidos em dimetilsulfóxido (DMSO), padronizando-se a
concentração final de 100 mg/mL, 50 mg/mL ou 25 mg/mL, de acordo com o rendimento. Os
extratos foram filtrados em membranas de filtro de 0,22 µM e as amostras armazenadas em
tubos eppendorf e mantidas em freezer (-20,0ºC), ao abrigo da luz.
4.5.

Atividade antimicrobiana dos metabólitos secundários fúngicos

4.5.1. Avaliação da atividade antibacteriana dos extratos fúngicos
O Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos (TSA) foi realizado pelo
método de disco difusão (DD) em meio de cultura padronizado Ágar Mueller-Hinton (MH)
(NCCLS/CLSI, 2003), com o objetivo de avaliar a atividade dos extratos fúngicos contra E.
coli (ATCC 11775), P. aeruginosa (isolado clínico) e S. aureus (ATCC 6538). As cepas

seguiram para padronização em espectrofotômetro (0,9 a 1,0 de absorbância a 620 nm de
leitura), em solução salina 0,9%.
As placas de meio MH foram inoculadas com swab, em seguida, foram incluídos
discos de papel de filtro esterilizados sobre o meio de cultura e foi impregnado na superfície
do disco 10,0 μL dos extratos fúngicos produzidos anteriormente, na concentração de 1
mg/mL, com os discos equidistantemente distribuídos. O material foi incubado a 37,0 °C por
20 horas, em triplicata, e o halo de inibição foi avaliado.
Ressalta-se que o controle negativo utilizado foi o DMSO a 10% e os controles
positivos foram discos de antimicrobianos padrões: penicilina 10U.I, ampicilina 10mcg,
azitromicina

15mcg, piperacilina

110mcg, ceftazidima

30mcg,

amicacina 30mcg,

cloranfenicol 30mcg, gentamicina 10mcg e cefepime 30mcg.
4.5.2.

Atividade antifúngica contra Candida albicans (ATCC 10231)
O ensaio de sensibilidade a antifúngicos foi realizado pelo método de

disco difusão (DD) em meio de cultura padronizado Ágar Sabouraud Dextrose, com o
objetivo de avaliar a atividade dos extratos fúngicos contra C. albicans (ATCC 10231). O
bioensaio aconteceu de forma semelhante ao que foi descrito no item anterior, a diferença
ocorreu somente no uso da substância utilizada como controle positivo, que foi o antifúngico
de ação conhecida, a nistatina (100.000 UI).

4.6.

Ensaio qualitativo em meio líquido e avaliação da concentração inibitória mínima
Inicialmente avaliou-se o cultivo em meio líquido de forma qualitativa, com análise da

atividade antimicrobiana em 2 concentrações (1000 e 500 µg/mL). Os extratos fúngicos com
atividade antibacteriana e/ou antifúngica no ensaio qualitativo foram avaliados quanto à
concentração inibitória mínima (CIM). Para tanto, as culturas de micro-organismos recém
cultivadas foram transferidas para tubos de ensaio contendo 5 mL de solução salina 0,9%,
padronizadas por meio da leitura da suspensão a 600 nm, de modo que a densidade óptica
atingiu a absorbância entre 0,9 a 1,0. Foram avaliadas diferentes concentrações dos extratos
fúngicos a fim de determinar a menor concentração onde não há crescimento microbiano.
Ressalta-se, que as CIM registradas são as menores concentrações dos extratos onde não há
crescimento visível de micro-organismos (Yang et al., 2020).
Aplicando o método de microdiluição, desenvolvido por Eloff (1998) e normatizado
pelo Instituto de Padrões Clínicos e Laboratoriais (do inglês CLSI Clinical and Laboratory

Standards Institute), o mais utilizado internacionalmente (Amparo et al., 2018), foi realizada
uma avaliação preliminar onde todos os extratos produzidos foram adicionados em
concentrações de 1000 µg/mL e 500 µg/mL, com o intuito de realizar uma triagem da
possível atividade antimicrobiana e antifúngica direcionando as análises para ensaios em
concentrações menores.
O preparo das soluções foi realizado em eppendorfs enumerados em 1 e 2 para
facilitar o entendimento, no eppendorf 1 uma alíquota de 990μL de meio de cultura líquido
(MH para cepas bacterianas e Sabouraud para levedura) foi adicionado à 10μL de cada extrato
fúngico e foi homogeneizado em vórtex. Em seguida foi preparado o eppendorf 2, com 400μL
de meio de cultura adequado para cada cepa utilizada, adicionado à 400μL da solução retirada
do eppendorf 1, em seguida a solução foi homogeneizada em vórtex. Desta forma, o tubo 1
findou com concentração de 1000 µg/mL enquanto o tubo 2, com 500 µg/mL, ainda sendo
dois eppendorfs para cada extrato fúngico separadamente, foram preparados 68 tubos, além
dos eppendorfs contendo DMSO nas concentrações de 2% e 1%, que foram utilizados como
diluentes dos extratos fúngicos e, portanto, foi preciso avaliar se sua composição poderia
exercer atividade antimicrobiana, o que influenciaria a ação dos extratos fúngicos.
Utilizando uma pipeta, nos três primeiros poços (A, B e C) da primeira coluna, foi
então adicionado um volume de 100 μL proveniente do eppendorf 1, enquanto nos três
primeiros poços da segunda coluna foram adicionados 100 μL oriundos do eppendorf 2 e
assim sucessivamente (Figura 7).

Figura 7: Esquema de ensaio de triagem em meio líquido, utilizando microplaca de 96 poços
em concentrações de 1000 µg/mL (cor púrpura) e 500 µg/mL (cor lilás). Enquanto a cor cinza
escura representa o DMSO 2%, a cor cinza representa o DMSO 1%, a cor branca representa o
branco e a cor azul clara representa o controle positivo. Os poços em amarelo, da linha H,
representam poços vazios.

Fonte: do autor

Foram adicionados 100 μL de DMSO 2% e 1%, ambos em triplicata, em seguida, 10
μL de micro-organismos em cada poço, exceto nos orifícios denominados "branco", que
continham apenas 100 μL de meio de cultura específico. Destaca-se que cada cepa foi testada
em placas individualizadas e como controle positivo para cepas bacterianas foi utilizado o
antibiótico gentamicina, enquanto para levedura foi empregado o antifúngico anfotericina B.
Na sequência, as microplacas foram incubadas a 35,0 ºC por 22 horas em agitação. Logo após
esse período, foram adicionados 20 μL da solução de TTC (cloreto de 2,3,5 trifeniltetrazólio)
a 0,125% em cada poço, e as microplacas foram novamente incubadas por mais duas horas,
então foram realizadas as leituras visuais e em espectrofotômetro a 540 nm.
Foi repetida a técnica de microdiluição em poços, com diferentes concentrações de
cada extrato fúngico selecionado. Nessa etapa foi preparado um eppendorf para cada extrato,
contendo 980 μL de meio de cultura adequado e 20 μL do extrato, obtendo uma concentração
de 2000 μg/mL, sendo 200 μL dessa solução acondicionada em cada poço da linha "A" da
microplaca, conforme esquema exposto na figura 8. A partir da linha "B" até a linha "H"
foram adicionados 100 μL de meio de cultura, em seguida, com o auxílio de uma pipeta

multicanal, foram realizadas as diluições seriadas retirando-se uma alíquota de 100 μL do
conteúdo de cada poço e transferindo para os poços subsequentes da linha, obtendo as
seguintes concentrações decrescentes: 2000 μg/mL, 1000 μg/mL, 500 μg/mL, 250 μg/mL, 125
μg/mL, 62,5 μg/mL, 31,25 μg/mL e 15,62 μg/mL. Na sequência, foram adicionados 10μL do
inóculo em cada poço, exceto nos denominados "branco" que continham 100 μL de meio de
cultura, enquanto os controles negativos apresentavam 100μL de meio e 10 μL inóculo, os
controles positivos possuíam Gentamicina ou Anfotericina B e, por último, havia os poços
com os controles do diluente utilizado no preparo dos extratos fúngicos, o DMSO em
concentrações de 1% e 2%.
Figura 8: Esquema do ensaio de avaliação da concentração inibitória mínima dos extratos
fúngicos em microplaca de 96 poços, nas concentrações de 2000 μg/mL a 15,62 μg/mL.

Fonte: do autor
As microplacas foram incubadas a 35,0 ºC por 22 horas, seguido da adição de 20 μL
da solução de TTC (cloreto de 2,3,5 trifeniltetrazólio) a 0,125% em cada poço, e as
microplacas foram novamente incubadas por mais duas horas e realizada leitura visual e em
espectrofotômetro a 540 nm.
Na etapa subsequente os extratos foram fracionados, em processo de particionamento,
em frações de acetato de etila, clorofórmica e hexânica e suas concentrações variaram de
acordo com o rendimento de cada partição. Então, foi realizado o ensaio para determinar a
CIM do extrato 3UVLFC1 em suas frações. As concentrações avaliadas foram: 2000 μg/mL,

1000 μg/mL, 500 μg/mL, 250 μg/mL, 125 μg/mL, 62,5 μg/mL, 31,25 μg/mL e 15,62 μg/mL.
Todas as frações foram testadas em triplicata (Figura 9).
Figura 9: Esquema de ensaio de microdiluição em microplaca de 96 poços, do extrato
3UVLFC1 em frações de acetato de etila, clorofórmica e hexânica, em concentrações de 2000
μg/mL a 15,62 μg/mL.

Fonte: do autor

4.7.
4.7.1.

Atividade antioxidante dos metabólitos secundários fúngicos
Atividade antioxidante pelo método DPPH

Ao aplicar o método DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazil), foi utilizada
uma microplaca de 96 poços, na qual foram adicionados 280 µL da solução de DPPH, sendo
3,2 mg de DPPH dissolvidos em 100 mL de metanol em 93 poços, enquanto nos três poços
restantes foi adicionado o branco apenas com DMSO e metanol. Ademais, foi preparado o
controle que consistiu em: 280 µL da solução de DPPH e 20 μL de DMSO 10%. Em seguida,
20 µL de cada amostra com diferentes diluições foram aplicadas nos poços (Pires et al.,
2017).
Soluções de Ácido ascórbico (500 μg/mL), BHT - hidroxitolueno butilado (1000
μg/mL), ácido gálico (1000 μg/mL) foram utilizadas para o preparo das curvas padrão, a
reação foi incubada durante 30 minutos a 37,0ºC e a absorbância foi lida a 517 nm. Todos os
ensaios foram realizados em triplicata. A atividade antioxidante pelo método de DPPH foi
avaliada através da % de descoloração do reagente DPPH, o qual possui coloração roxa e
descolore à medida que é reduzido por algum agente antioxidante, como descrito na equação
1. Foi ainda calculado o EC50, o qual representa a concentração de extrato fúngico efetiva que
induz metade (50%) do efeito máximo da atividade antioxidante.

Eq. 1.

4.7.2.

Atividade antioxidante pelo método FRAP
Foi utilizado também o método Ferric Reducing Antioxidant Power

(FRAP), o qual utiliza o reagente 2,4,6-tripiridil-s-triazina (TPTZ) como substrato e que se
respalda na redução de ferro férrico (Fe3+) a ferro ferroso (Fe2+) na presença de antioxidante.
A solução de FRAP é composta por 50 mL de tampão de acetato de sódio, 5 mL da solução
TPTZ e 5 mL da solução cloreto férrico. Em microplaca de 96 poços a solução FRAP foi
inoculada em todos os poços, em seguida foi adicionado o branco (15μL de água estéril, 20
μL de DMSO 10% e 265 μL de solução FRAP). Nos poços seguintes foram adicionadas as
amostras. Foram utilizadas três placas, a primeira com a concentração de 2000 e a segunda
com 500 µg/mL e a terceira para a curva padrão, com o ácido ascórbico (500 μg/mL), BHT
(1000 μg/mL) e o ácido gálico (1000 μg/mL). A reação foi incubada durante 30 minutos a
37,0 °C e a absorbância foi lida a 595 nm em leitor de microplacas. A expressão dos
resultados foi realizada conforme Urrea-Victoria et al. (2016).

4.8.

Fracionamento dos extratos fúngicos e análise de infravermelho das frações
As análises foram realizadas no Laboratório de Química da Central Analítica do

Núcleo de Ciências Exatas, local em que as amostras foram fracionadas em solventes de
acetato de etila, clorofórmio e hexano, viabilizando novos ensaios para determinar a(s)
possível(is) fração(ões) com maior bioatividade. Seguindo uma ordem de polaridade, do
menos polar para o mais polar dos solventes, inicialmente, em um recipiente contendo o
extrato seco foram adicionados uma parte do hexano (2-2,5 mL) e levado para um banho
ultrassônico, no qual permaneceu sob sonicação por 30 segundos. Em seguida, o sobrenadante
foi filtrado, com papel de filtro, e o procedimento de extração foi repetido mais duas vezes. O
mesmo método foi executado com os demais solventes, procedendo com a extração com
clorofórmio no mesmo recipiente contendo o extrato residual obtido da extração com hexano,
adicionando o solvente e filtrando o sobrenadante após ser condicionado no banho
ultrassônico. Por fim, seguiu-se com a extração usando acetato de etila. As frações foram
transferidas para um dessecador, no qual os solventes foram removidos sob pressão reduzida.
As informações moleculares dos extratos foram obtidas através de análise por
espectroscopia de infravermelho (Cary 660). Tais informações correspondem às propriedades
estruturais dos metabólitos componentes dos extratos preparados dos microrganismos, como
ligações e funcionalidades químicas (grupos químicos) presentes em suas moléculas. Esta
avaliação consistiu na análise de espectros de infravermelho cuja aquisição se deu pela técnica
de Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR), a fim de
identificar os tipos de ligações dos compostos presentes nas frações analisadas
As ligações químicas e grupos funcionais são identificados no espectro por meio do
padrão espectral característico de cada grupo, definido pela frequência da radiação
infravermelha que é absorvida e por meio da feição ou perfil dos picos gerados no espectro.
Uma vez que a energia da radiação absorvida é quantizada, ou seja, possui valores fixos e
definidos para cada grupo absorvente, é possível prever com apreciável precisão a presença de
um grupo químico ou ligação em uma molécula a partir do seu espectro de infravermelho, o
que torna esta técnica uma ferramenta analítica útil para analisar aspectos químicos de
compostos e misturas. No presente caso, ela foi aplicada para determinar a natureza química
dos metabólitos presentes nos extratos em termos dos grupos funcionais identificados.

4.9. Avaliação da citotoxicidade dos extratos fúngicos
Com o objetivo de avaliar a citotoxicidade dos extratos fúngicos que apresentaram
atividade antibacteriana contra S. aureus (ATCC 6538) foi realizado o bioensaio de
seletividade para células mononucleares de sangue periférico (PBMC). A partir da amostra de
sangue periférico humano de um doador voluntário (pesquisa aprovada em Comitê de Ética
em Pesquisa sob CAAE: 67813823.8.0000.5013), as células mononucleares (linfócitos) foram
isoladas por meio do método padrão de centrifugação por gradiente de densidade com
Histopaque®. Após a separação, as células foram lavadas por duas vezes, com solução salina
tamponada (PBS) e contadas em Câmara de Neubauer. As células foram plaqueadas, 50 μL,
em microplaca de 96 poços (105 células/poço), tratadas com os extratos fúngicos, 50 μL, em
concentrações que variaram de 2000 a 15,6 μg/mL e a microplaca foi incubada em estufa
bacteriológica a 37,0 ºC. Após 48 horas, foram adicionados 20 μL, em cada poço, do sal
brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-tetrazólio (MTT), a microplaca foi
incubada por 4 horas a 37 ºC. Em seguida, foi adicionado DMSO, 200 μL, em todos os poços,
incubada por 20 minutos e a absorbância foi lida em espectrofotômetro de microplacas a 550
nm.
Todas as amostras foram plaqueadas em triplicatas e para o controle foram preparados
poços com o meio de cultura Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640)
suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino, 1% (v/v) de L-glutamina, 1% (v/v) de
piruvato e 1% (v/v) de aminoácido, substituindo os extratos fúngicos e DMSO 10 e 20%, para
comparação e verificação de inatividade desse solvente.

PRODUTO

1.

Perfil antimicrobiano e antioxidante de metabólitos de fungos filamentosos
isolados de liquens da Caatinga (submetido, segundo as normas da Anais da
Academia Brasileira de Ciências. Qualis A2 e Fator de Impacto 1.811 em 2021).

5.1 PRODUTO 1
Perfil antimicrobiano e antioxidante de extratos de fungos filamentosos isolados de
liquens da Caatinga
Vannêssa Rodrigues Teles Maia1,2 (https://orcid.org/0009-0009-7521-5253), Emanuelly
Beatriz Tenório Sampaio1 (https://orcid.org/0000-0002-2174-5197), Mayanne Karla da Silva1
(https://orcid.org/0000-0002-0292-3648), Magna Suzana Alexandre Moreira3
(https://orcid.org/0000-0002-9979-1994), Cledna Kaline dos Santos Duarte1
(https://orcid.org/0000-0002-4455-9047), Maria Nicolle Pereira da Silva1
(https://orcid.org/0000-0003-3573-9369), Marcela Eugenia da Silva Cárceres4
(https://orcid.org/0000-0002-5612-1309), Janice Gomes Cavalcanti4 ,
(https://orcid.org/0000-0003-1931-7174, Aline Cavalcanti de Queiroz1
(https://orcid.org/0000-0002-6362-2726), Adeildo Júnior de Oliveira5
(https://orcid.org/0000-0002-8312-6471), Alysson Wagner Fernandes Duarte1,2
(https://orcid.org/0000-0001-9626-7524)

1

Complexo de Ciências Médicas e Enfermagem, Universidade Federal de Alagoas, Campus

Arapiraca. Avenida Manoel Severino Barbosa Bom Sucesso, Arapiraca, AL, Brazil, CEP
57309-005.
2

Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas – PPGCM

3

Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Federal de Alagoas, Maceió, AL,

Brazil; CEP:57072-900
4

Departamento de Biociências – Universidade Federal de Sergipe. Campus Itabaiana; Av. Ver.

Olímpio Grande - Sítio Porto, Itabaiana, SE, Brazil, CEP 49500-000.
5

Central Analítica – NCEx. Universidade Federal de Alagoas, Campus Arapiraca, Avenida

Manoel Severino Barbosa Bom Sucesso, Arapiraca, AL, CEP:57309-005.
Running title: Antioxidant and antimicrobial activity by Caatinga fungi
Academy Section AABC: Biological sciences
*Corresponding author: Tel.: +55 82 99672-1116. alysson.duarte@arapiraca.ufal.br

RESUMO
O objetivo da pesquisa foi avaliar o potencial antimicrobiano e antioxidante de metabólitos
secundários produzidos por fungos filamentosos isolados de liquens do bioma Caatinga. Os
isolados foram cultivados em meio sólido Ágar Czapeck e realizada a extração de metabólitos
secundários intra e extracelulares com acetato de etila. A determinação da atividade
antimicrobiana foi pelo método de difusão em disco e microdiluição em caldo Sabouraud e o
potencial de inibição antioxidante foi avaliado utilizando os métodos empregando o radical
DPPH e o poder de redução do ferro (FRAP). De 35 fungos avaliados, quatro (11%)
apresentaram atividade antimicrobiana e seis (17%) com perfil antioxidante. O extrato de
Penicillium sp. 2UVC8, seguido do Fusarium sp. 3UVLFC1, demonstraram as melhores
atividades contra Staphylococcus aureus, com concentração inibitória mínima (CIM) de 125
μg/mL e 250 μg/mL, respectivamente. As frações do extrato de Fusarium sp. 3UVLFC1 de
acetato de etila, clorofórmica e hexânica, exibiram potencial promissor contra S. aureus. Na
avaliação da atividade antifúngica, o extrato de Fusarium sp. 4UVLFC2 exibiu CIM = 31,2
μg/mL, frente à C. albicans. Contudo, para as cepas de bactérias Gram-negativas E. coli e P.
aeruginosa nenhum extrato exibiu efeito inibitório. Na determinação antioxidante, o extrato
de Fusarium sp. 4LCEM2 obteve resultado promissor, com CE = 180 μg/mL. Destarte, os
resultados evidenciaram atividade antimicrobiana promissora para S. aureus, como também
potencial antioxidante. Tais resultados exaltam a riqueza da biodiversidade da Caatinga e a
prospecção de seus micro-organismos, que são fontes de metabólitos com alto potencial
biotecnológico.
50

PALAVRAS-CHAVE: Atividade antioxidante. Atividade antimicrobiana. Prospecção.
Semiárido.

INTRODUÇÃO
Com

o aumento da resistência antimicrobiana nos últimos anos, muitos

micro-organismos estão envolvidos com um crescente número de infecções com desfecho
fatal, principalmente em casos de Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde (IRAS), aqui
destacam-se Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa (WHO, 2017; GOMEZ et al,
2022). Outrossim, há bactérias como a Escherichia coli e fungos como Candida albicans, que
são potentes agentes patogênicos para o homem e para os animais (KAPER, 2004). Ademais
todos esses micro-organismos são comensais, habitam a microbiota humana, mas quando há
desequilíbrio da imunidade tornam-se patógenos perigosos aos indivíduos (VILA et al.,
2020).
A Organização das Nações Unidas (ONU) publicou em 2017 uma lista apresentando
12 famílias de bactérias ameaçadoras à saúde humana, assim essa organização
intergovernamental alertou que a pesquisa e o desenvolvimento de novas fontes de compostos
com atividade antimicrobiana são urgentes (WHO, 2017). Comprovadamente, a resistência

antimicrobiana (RAM) tornou-se um problema mundial de saúde pública e atinge diversas
áreas, como a saúde, agricultura e meio ambiente (CDC, 2022). Essa problemática acontece
quando bactérias e fungos sofrem pressões seletivas e modificam-se com o passar do tempo e,
com isso, não respondem mais a antimicrobianos aos quais anteriormente eram susceptíveis
(WHO, 2021). Fato bastante preocupante, pois possibilitou o crescimento de infecções
causadas por bactérias multirresistentes, levando a um aumento também no número de mortes
no mundo, com uma previsão assustadora de dez milhões de mortes no ano de 2050
(PATERSON, 2020). Problema agravado pela grande diminuição na descoberta de novas
drogas (LEWIS, 2020).
Há várias causas para a RAM, dentre elas destacam-se: modificação genética dos
organismos, uso irracional de fármacos antimicrobianos na medicina, veterinária, avicultura e
agricultura, automedicação (ZHAO et al, 2022), como também indivíduos que não seguem as
recomendações médicas adequadas e, assim, não cumprem todo o tratamento (LEWIS, 2020;
RAHMAN, 2020). Nessa conjuntura, a utilização de fontes naturais para a busca de novos
antimicrobianos é de suma importância. A aplicação de substâncias naturais com o objetivo
de combater doenças vem sendo aplicada desde a antiguidade, contudo produtos naturais
advindos de fungos da Caatinga ainda é uma fonte pouco explorada, diante da diversidade e
riqueza dos fungos desse bioma (RAHMAN, 2020; SILVA et al, 2020).
Por outro lado, metabólitos fúngicos têm sido reportados com atividade antioxidante, a
qual é caracterizada pela capacidade de reduzir radicais livres e impedir que eles danifiquem
moléculas importantes do organismo humano, como o DNA (ROMÃO et al, 2022). Os
radicais livres são moléculas instáveis produzidas por reações comuns do organismo,
conhecidas como espécies reativas de oxigênio (ERO) e espécies reativas de nitrogênio
(ERN) (UJAM et al., 2021).
As EROs desempenham papéis fisiológicos como regulação do crescimento celular,
fagocitose, ação no sistema imune, sinalização intracelular, produção de energia e também
atuação na formação de substâncias biológicas (HADIDI et al., 2022). Contudo, quando a
geração de EROs torna-se maior do que a capacidade antioxidante celular, acontece uma
condição designada estresse oxidativo, sendo bastante prejudicial às células do organismo
(MUNTEANU, 2021), uma vez que causam danos oxidativos em biomoléculas importantes
como ácidos nucléicos e lipídeos, participação em processos celulares como a apoptose,
provocando processos patológicos e degenerativos no organismo (UJAM et al., 2021).
E nessa perspectiva, antioxidantes provenientes de fontes naturais possuem diversas
vantagens, a iniciar pela sua forma de produção, sendo mais sustentável ao meio ambiente,

além disso como os micro-organismos apresentam características diferentes e metabolismos
específicos, o desenvolvimento de resistência aos seus fármacos são mais difíceis de
acontecer, como também há maior probabilidade de ação sinérgica dos produtos naturais,
aumentando assim os efeitos antimicrobianos (ZHAO et al, 2022) e antioxidantes (GARÁDI
et al, 2021).
Assim, fungos que habitam ambientes pouco explorados e com aspectos limitantes
como a Caatinga, podem apresentar capacidade metabólica adaptativa diferenciada e serem
interessantes na busca por novas biomoléculas. O bioma Caatinga é caracterizado por seu
clima semiárido, altas temperaturas e baixa pluviosidade, contudo é um local de grande
riqueza biológica e pouco explorado cientificamente, mas que já rendeu estudos com
resultados promissores sobre organismos produtores de compostos naturais com atividades
antimicrobianas a partir de extratos de plantas (DANTAS-MEDEIROS, 2020), óleos
essenciais vegetais (PEREIRA; TEIXEIRA; MEDEIROS, 2021), e metabólitos microbianos
(MOURA et al., 2021). Porém, estudos de perfil antioxidante e antimicrobiano de extratos
fúngicos de organismos isolados desse ambiente ainda é pouco reportado na literatura.
Visando essa riqueza natural proveniente da Caatinga, o objetivo deste estudo foi prospectar
atividade antimicrobiana e antioxidante de extratos de fungos filamentosos isolados de
liquens.
MATERIAIS E MÉTODOS
Origem dos fungos filamentosos
Em 2019 foram coletadas amostras de liquens da Caatinga, sendo retirados de uma
região preservada, a Reserva da Tocaia e outra de impacto antrópico, a Serra do Gugi, ambas
do município de Santana do Ipanema, região do semiárido alagoano. As amostras foram
utilizadas no isolamento de fungos filamentosos em meios de cultura: extrato de malte, ágar
malte levedura e ágar Sabouraud, todos suplementados com antibiótico cloranfenicol.
Os isolados de fungos filamentosos pertencem ao Laboratório de Microbiologia,
Imunologia e Parasitologia - LABMIP da Universidade Federal de Alagoas - UFAL, local
onde estavam criopreservados em glicerol 20%, armazenados em ultrafreezer a -80 °C. Desta
forma, foram reativados em placas de Petri (60x15mm) com meio de cultura Ágar Sabouraud
Dextrose e incubados em estufa bacteriológica a 30°C, por 7 dias para análise da pureza e
transferência dos isolados para os ensaios de produção de metabólitos secundários.

Em atendimento ao previsto na Lei nº 13.123/2015 e seus regulamentos, a atividade de
acesso ao Patrimônio Genético/CTA foi cadastrada (A286015) no SisGen.
Produção e extração dos metabólitos secundários
Os fungos foram cultivados em meio de cultura Ágar Czapek acrescido com 2% de
glicose em placas de Petri (90x15mm), conforme Oliveira, (2013), com modificação. Cada
placa de Petri foi padronizada com volume de 20 mL do meio de cultura, possibilitando as
mesmas condições de crescimento e uniformização na produção dos extratos. As placas foram
incubadas em estufa bacteriológica a 30,0°C por 14 dias, visando a indução da produção de
metabólitos por aumento do tempo de incubação. Em seguida, a biomassa total (fungo
acrescido do meio) foi transferida e acondicionada em Erlenmeyer e embebida em acetato de
etila PA (C4H8O2) e incubada em geladeira (8ºC), durante sete dias para extração dos
metabólitos intracelulares e extracelulares e a biomassa de 6 placas de Petri foi embebida em
100 mL de acetato de etila PA.
Após essa etapa, foi realizada a filtração do sobrenadante com papel de filtro
Whatman e os extratos de acetato de etila foram concentrados em evaporador rotativo, em
temperatura ambiente, para a remoção da fração do solvente. Em seguida, as amostras foram
levadas ao dessecador, visando a secagem dos extratos. Logo após, as amostras foram
ressuspendidas em dimetilsulfóxido (DMSO) 10%, padronizando-se a concentração final de
100 mg/mL ou 25 mg/mL a depender do rendimento, seguido de filtração em membrana de
filtração de 0,22 µM e, assim, os extratos foram submetidos às análises.
Atividade antimicrobiana dos metabólitos secundários fúngicos
Micro-organismos
Foram utilizadas cepas padrão de bactérias Escherichia coli (ATCC 11775),
Staphylococcus aureus (ATCC 6538), isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa e cepas
padrão da levedura Candida albicans (ATCC 10231). Sendo os inóculos padronizados em
espectrofotômetro (0,9 a 1,0 de absorbância a 620 nm de leitura).
As cepas padrão foram gentilmente cedidas pelo Centro Pluridisciplinar de Pesquisas
Químicas, Biológicas e Agrícolas, divisão de microbiologia da Universidade Estadual de
Campinas – UNICAMP.

Avaliação da Atividade Antimicrobiana

Inicialmente foi realizado um screening com os 35 extratos para avaliação qualitativa
do perfil antimicrobiano, por meio do método de Disco Difusão (DD). Os extratos foram
submetidos a ensaios em meio caldo Mueller Hinton, para as bactérias, e caldo Sabouraud
para C. albicans e 2 concentrações foram avaliadas (1.000 e 500 μg/mL). Aqueles extratos
que tiveram ação antimicrobiana foram submetidos ao ensaio de Concentração Inibitória
Mínima (CIM).
Concentração Inibitória Mínima (CIM)
Concentração Inibitória Mínima (CIM) é a menor concentração de antibiótico, na qual
não há crescimento visível de micro-organismos (YANG et al., 2020). Assim, foi aplicado o
método de microdiluição em caldo, desenvolvido por Eloff (1998) e normatizado pelo
Instituto de Padrões Clínicos e Laboratoriais (do inglês CLSI Clinical and Laboratory
Standards Institute), o mais utilizado internacionalmente (AMPARO et al, 2018).
Para a realização desta etapa foi preparado um tubo eppendorf para cada extrato
fúngico, contendo 980 μL de meio de cultura adequado e 20 μL do extrato, obtendo-se uma
concentração de 2000 μg/mL, sendo 200 μL dessa solução acondicionada em cada poço da
linha "A" da microplaca.
A partir da linha "B" até a linha "H" foram adicionados 100 μL de meio de cultura, em
seguida, com o auxílio de uma pipeta multicanal, foram realizadas as diluições seriadas
retirando-se uma alíquota de 100 μL do conteúdo de cada poço e transferindo para os poços
das linhas subsequentes, obtendo as seguintes concentrações decrescentes: 2000 μg/mL, 1000
μg/mL, 500 μg/mL, 250 μg/mL, 125 μg/mL, 62,5 μg/mL, 31,25 μg/mL e 15,625 μg/mL. Na
sequência, foram adicionados 10 μL do inóculo em cada poço, exceto nos denominados
"branco" que continham 100 μL de meio de cultura, enquanto os controles negativos
apresentavam 100 μL de meio de cultura e 20 μL inóculo, os controles positivos possuíam
Gentamicina para o ensaio com bactéria ou Anfotericina B para o ensaio com levedura e, por
último, havia os poços com os controles do diluente utilizado no preparo dos extratos
fúngicos, o DMSO em concentrações de 1% e 2%.
As microplacas foram incubadas a 35,0 ºC por 22 horas, seguido da adição de 20 μL
da solução de TTC (cloreto de 2,3,5 trifeniltetrazólio) a 1 % em cada poço, e as microplacas
foram novamente incubadas por duas horas. Após, foram realizadas as leituras visual e
espectrofotômetro a 540 nm.

Os extratos fúngicos com melhores perfis de atividade antimicrobiana foram
submetidos ao processo de fracionamento, viabilizando a continuidade dos experimentos, foi
a amostra 3UVLFC1, em frações de acetato de etila (25 mg/mL), clorofórmica (25 mg/mL) e
hexânica (100 mg/mL). Desse modo foi executado o bioensaio da CIM com o intuito de
observar a atividade antimicrobiana em cada fração separadamente, seguindo a mesma
metodologia descrita.
Ensaio de seletividade para células mononucleares de sangue periférico (PBMC)
A partir de uma amostra de sangue periférico humano (pesquisa aprovada em Comitê
de Ética em Pesquisa sob CAAE: 67813823.8.0000.5013), as células foram isoladas por meio
do método padrão de centrifugação por gradiente de densidade com Histopaque®. Após a
separação, as células foram lavadas por duas vezes, com solução salina tamponada (PBS) e
contadas em Câmara de Neubauer. As células foram plaqueadas, 50 μL, em microplaca de 96
poços (105 células/poço), tratadas com os extratos fúngicos, 50 μL, em concentrações que
variaram de 2000 a 15,6 μg/mL e a microplaca foi incubada em estufa bacteriológica a 37 ºC.
Após 48 horas, foram adicionados 20 μL, em cada poço, do sal brometo de
3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-tetrazólio (MTT), a microplaca foi incubada por 4
horas a 37 ºC. Em seguida, foi adicionado DMSO, 200 μL, em todos os poços, incubada por
20 minutos e a absorbância foi lida em espectrofotômetro de microplacas a 550 nm.
Todas as amostras foram plaqueadas em triplicatas e para o controle foram preparados
poços com o meio de cultura Roswell Park Memorial Institute (RPMI) substituindo os
extratos fúngicos e DMSO 10 e 20%, para comparação e verificação de inatividade desse
solvente.
Atividade Antioxidante
Inicialmente foi realizado um screening com os 35 extratos para avaliação qualitativa
do perfil antioxidante. Os extratos foram submetidos a ensaios por meio dos métodos DPPH
(2,2-difenil-1-picril-hidrazil) e FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) e 2 concentrações
foram avaliadas (2.000 e 500 μg/mL). Aqueles extratos que tiveram ação antioxidante foram
submetidos a novos ensaios em concentrações menores.
Método FRAP
O ensaio antioxidante de determinação do poder redutor do íon ferro foi realizado de
acordo com a metodologia de Urrea-Victoria et al (2016) com adaptações. Para iniciar, foram

preparados oito tubos eppendorf para cada um dos extratos fúngicos selecionados, com a
finalidade de obter soluções com as seguintes concentrações: 1000 μg/mL, 500 μg/mL, 250
μg/mL, 125 μg/mL, 62,5 μg/mL, 31,25 μg/mL, 15,61 μg/mL e 7,8 μg/mL. Para a inoculação
das microplacas de 96 poços foram adicionados, em cada poço, os seguintes volumes de
substâncias: 15 μL de água destilada mais 265 μL de solução FRAP e 20 μL de amostra teste,
totalizando 300 μL de volume em cada poço. Ressalta-se que os poços utilizados para o
branco continham 20 μL de DMSO 10% em substituição ao volume de amostra. Destaca-se,
ainda, que todas as amostras e suas diluições foram feitas em triplicata. Utilizou-se como
padrões o ácido gálico (1000 μg/mL) e ácido ascórbico (1000 μg/mL).
Método DPPH
Em relação ao ensaio de DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazil), foi utilizada uma
microplaca de 96 poços, na qual foi adicionado 280 µL da solução de DPPH (3,2 mg de
DPPH; 100 mL de metanol) em 93 poços, enquanto nos três poços restantes foi preparado o
branco com DMSO 10% e metanol (Pires et al., 2017). Ademais, foi preparado o controle que
consistiu em: 280 µL da solução de DPPH e 20 µL de DMSO 10%. Em seguida, 20 µL de
cada amostra em diferentes diluições foram adicionadas aos poços, com exceção aos poços
referentes ao branco e controle. Soluções de ácido ascórbico, BHT - hidroxitolueno butilado e
ácido gálico foram utilizadas para o preparo das curvas padrão, a seguir a reação foi incubada
durante 30 minutos a 37ºC e a absorbância foi lida a 517 nm. Todos os ensaios foram
realizados em triplicata.
Os resultados das atividades antimicrobiana e antioxidante foram analisados por meio
da média das absorbâncias obtidas através da leitura espectrofotométrica e desvio padrão.
Enquanto a análise estatística descritiva e de ajuste sigmoide da capacidade antioxidante em
relação ao logaritmo das concentrações dos extratos (CHEN et al, 2013) para obtenção do
cálculo da concentração efetiva 50% (CE50), foi obtida utilizando o software Prism GraphPad
5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA).
Fracionamento dos extratos com perfil antioxidante
Os extratos fúngicos foram fracionados em solventes de acetato de etila, clorofórmio e
hexano, viabilizando novos ensaios para determinar a(s) possível(is) fração(ões) com maior
bioatividade. Seguindo uma ordem de polaridade, do menos polar para o mais polar dos
solventes, inicialmente, em um recipiente contendo o extrato seco foram adicionados uma
parte do hexano (2-2,5 mL) e levado para um banho ultrassônico, no qual permaneceu sob

sonicação por 30 segundos. Em seguida, o sobrenadante foi filtrado, com papel de filtro, e o
procedimento de extração foi repetido mais duas vezes. O mesmo método foi executado com
os demais solventes, procedendo com a extração com clorofórmio no mesmo recipiente
contendo o extrato residual obtido da extração com hexano, adicionando o solvente e filtrando
o sobrenadante após ser condicionado no banho ultrassônico. Por fim, seguiu-se com a
extração usando acetato de etila. As frações foram transferidas para um dessecador, no qual os
solventes foram removidos sob pressão reduzida.
Identificação dos isolados de interesse
As culturas das amostras que apresentaram atividade biológica foram
observadas em suas características macromorfológicas: aspecto da borda, coloração da
colônia e textura da superfície. Ademais, os fungos filamentosos foram submetidos à técnica
de microcultivo, o que permitiu a visualização microscópica das estruturas reprodutivas.
Com uma alça de inoculação foi possível remover uma alíquota de cada colônia e
transferir para as extremidades de um quadrado (1x1 cm) de meio de cultura Agar Sabouraud
Dextrose, depositado sobre uma lâmina e, logo em seguida, foi posicionada uma lamínula
sobre o meio de cultura. Todo esse conjunto situava-se dentro de uma placa de Petri e sobre
um papel filtro previamente umedecido com solução salina, a fim de fornecer um ambiente
úmido adequado ao crescimento fúngico. Em seguida, foram incubados a 25°C e visualizados
no sétimo dia de crescimento.
Análise da composição química dos extratos fúngicos por Espectroscopia de
infravermelho por transformada de Fourier (FTIR)
Com o objetivo de obter os espectros dos extratos fúngicos, foram realizadas medidas
em Espectrômetro de Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR), modelo Cary 660
(Agilent, California), acoplado ao acessório de reflectância total atenuada (ATR), equipado
com cristal de seleneto de zinco (ZnSe). Os extratos foram depositados sobre o cristal do
acessório do ATR, prensadas e, assim, foi realizada a aquisição dos espectros com 48
varreduras por amostra, utilizando a faixa de 650 a 4000 cm-1, aplicando resolução de 4 cm-1.
O registro dos espectros foi realizado com o Software Resolutions Pro.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Produção e rendimentos dos extratos e identificação dos fungos

A produção dos metabólitos secundários fúngicos resultou em 35 extratos de
diferentes fungos filamentosos da Caatinga, com rendimento variando de 45 mg a 236,22 mg
(Tabela 1). O aspecto visual dos extratos fúngicos variou de amarelo (51,6%) a transparente
(3,2%), conforme representado na figura 1.
Nos ensaios foram utilizados os fungos provenientes das amostras de liquens: LC1;
LC2; LC3; LC4; LC5; LC6; LC7; LC8 e LC10, a maioria deles foi identificada em relação à
espécie, com exceção ao LC1, sendo todos caracterizados por serem cosmopolitas de regiões
tropicais (LIU, 2019). As espécies dos liquens são: Xanthoparmelia plittii (LC2, LC3 e LC7);
Peltula clavata (LC4); Dirinaria applanata (LC5) presente em regiões tropicais; Ramboldia
sp. (LC6); Peltula euploca (LC8) e Ramalina peruviana (LC10).
Tabela 1. Rendimento de produção e caracterização dos extratos de fungos isolados de
liquens da Caatinga: liquen de isolamento, identificação fúngica, código do isolado, coloração
e rendimento de produção de extrato.
Liquen
Espécie (código)
**N.I. (LC1)

Xanthoparmelia plittii (Gyeln.) Hale
(LC2)

Xanthoparmelia plittii (Gyeln.) Hale
LC3

Peltula clavata (Kremp.) Wetmore
(LC4)

Identificação do
fungo
(microscopia)
Fusarium sp.

Código do
isolado

Coloração do
extrato

Rendimento
(mg)

3UVLFC1

amarelo claro

152,00

-*

1UVC1

amarelo claro

113,00

-*

5UVLFC1

bege

51,00

-*

4UVLFBC1

espectro bege

55,00

Penicillium sp.

2LCEM1

amarelo claro

77,00

Penicillium sp.

2LCL1

marrom claro

236,00

Cladosporium sp.

3LCL1

amarelo claro

92,00

-*

ALC2

amarelo claro

83,00

-*

2UVLFC2

lilás claro

57,00

-*

4UVLFC2

marrom escuro

132,00

Aspergillus sp.

7UVLFC2

amarelo escuro

77,10

-*

1UVLFC2

laranja

79,00

Fusarium sp.

4LCEM2

amarelo escuro

236,22

-*

3UVLF2

laranja

86,00

-*

5UVFLC2

amarelo claro

84,00

-*

JLC2

bege

87,00

-*

1UVCLFC3

marrom escuro

70,00

Penicillium sp.

3UVLFC3

amarelo

145,00

-*

2UVLFC3

transparente

71,00

Fusarium sp.

ALC3

laranja

140,00

Penicillium sp.

4UVLFC3

bege rosê

85,00

-*

1UVLFC4

amarelo escuro

109,00

-*

5UVLFC4

vermelho

64,00

-*

2UVLFC4

vermelho claro

46,00

-*

GLC5

verde musgo

78,00

-*

1UVLFC5

amarelo

45,00

Penicillium sp.

11LCL5

amarelo

113,00

Ramboldia sp. (LC6)

-*

PLC6

amarelo

89,00

Xanthoparmelia plittii (Gyeln.) Hale
(LC7)

Alternaria sp.

3UVLFC7

laranja

108,00

Alternaria sp.

4UVLFC7

marrom escuro

205,00

-*

1UVLFC7

laranja escuro

55,00

-*

5UVLFBC7

amarelo claro

95,00

Peltula euploca (Ach.) Poelt (LC8)

Penicillium sp.

2UVC8

laranja claro

207,00

Ramalina peruviana Ach. (LC10)

-*

1UVLFC10

91,00

Penicillium sp.

3UVLFC10

amarelo muito
claro
espectro amarelo

Dirinaria applanata (Fée) D.D.
Awasthi (LC5)

69,00

(*) - : gênero não identificado; (**)N.I: não identificado.
Fonte: a autora (2023).

Figura 1. Coloração dos extratos de fungos isolados da Caatinga dos extratos fúngicos
produzidos em meio de cultura Ágar Czapek e extraídos em acetato de etila. A) Quantitativo.
B) Aspecto visual.
A)

B)

Fonte: do autor.

A tabela 1 evidencia que houve predominância dos gêneros Penicillium e Fusarium,
pois, dentre os fungos identificados, foram encontrados 7 Penicillium, 5 Fusarium, 2

Alternaria, 1 Cladosporium e 1 Aspergillus. Enquanto Clementino et al (2015), identificaram
a prevalência do gênero Aspergillus, ao coletarem fungos filamentosos da Caatinga, na
microrregião do Cariri paraibano. Ao passo que Oliveira et al (2013), relataram que
Aspergillus e Penicillium foram os gêneros mais numerosos, em sua coleta na Caatinga, no
estado de Pernambuco.
A fermentação dos fungos para a produção dos metabólitos foi realizada em meio
Czapek, a escolha pelo meio de cultura sólido baseia-se na tentativa de mimetizar as
características ambientais dos fungos isolados, como também de diminuir a suscetibilidade de
contaminação bacteriana e prover maior possibilidade de concentração final de biomassa
(SOCCOL et al, 2017; SANTOS et al, 2018; MOLELEKOA et al, 2021). Outrossim,
VASSILEVA et al. (2021) apontam que os fungos requerem uma atividade de água baixa, por
isso a fermentação em estado sólido é mais adequada ao seu cultivo, o contrário ocorre com
bactérias, que seu requisito de atividade de água é maior e crescem mais em meio de cultura
líquido.
Além da escolha do tipo de fermentação, o tempo foi outro critério avaliado para a
produção dos extratos fúngicos, pois é um fator que influencia a produção de biomassa. Em
situações de estresse, os fungos ativam seu sistema de defesa e iniciam a produção de
compostos bioativos como forma de adaptação e sobrevivência (HAMEED et al, 2017; ZOU
et al., 2020; JIANG et al., 2021). De acordo com EMRI et al. (2015) a maior produção de
metabólitos secundários associa-se a um fenômeno de proteção denominado “Resposta ao
stress ambiental” e está ligado a um grupo de genes que foi encontrado em diferentes espécies
de fungos filamentosos como Aspergillus fumigatus, Fusarium graminearu e Claviceps
purpurea.
Ademais, o solvente utilizado para a extração dos metabólitos intra e extracelulares foi
o acetato de etila (C4H8O2), pois sua polaridade viabiliza a captação de uma maior quantidade
de compostos orgânicos, reportado em estudos anteriores, incluindo flavonoides, alcaloides,
fenóis, terpenos e glicosídeos (CHAKRABORTY et al., 2021; SHARMA et al., 2016;
SATARI et al., 2018).
Identificação macroscópica e microscópica de fungos filamentosos
A identificação dos fungos filamentosos da Caatinga foi baseada na combinação das
características macro e micromorfológicas das culturas analisadas, considerando os caracteres
taxonômicos de Alexopoulos et al. (1996), assim os nove isolados que apresentaram atividade
biológica foram observados macroscopicamente e foi registrada uma variação na coloração

incluindo branco, marrom, branco com lilás, branco com marrom e cinza. Outrossim, foi
notório que, durante a produção dos extratos fúngicos, após o procedimento de concentração
das amostras houve intensificação da coloração das mesmas devido à remoção do solvente.
No que se refere à textura dos micro-organismos, 22,2% foram classificados como
algodonosos, 33,3% como pulverulento e 44,4% como aveludado. Em relação à topografia,
33,3% possuíam bordas circulares, enquanto 66,6% tinham bordas irregulares.

Figura 2: Fotografia exibindo aspectos morfológicos macroscópicos e fotomicrografias
(objetiva de 40x) dos fungos filamentosos isolados da Caatinga em meio de cultura Agar
Sabouraud Dextrose, após 7 dias a 30 ºC. A/A1) 3UVLFC1, B/B1) 2UVC8, C/C1)
4UVLFC2, D/D1) 3UVLFC7, E/E1)4UVLFC7, F/F1) 7UVLFC2, G/G1) 2LCL1, H/H1)
11LCL5 e I/I1) 4LCEM2.
Fonte: a autora (2023).

Atividade antimicrobiana dos extratos fúngicos
A partir do screening com os 35 extratos fúngicos em 2 concentrações (2000 e 500
μg/mL) em DD (Figura 3) e em microdiluição em caldo (1000 e 500 μg/mL), realizou-se a
seleção das amostras que foram para o ensaio de microdiluição em caldo em concentrações
decrescentes (2000 μg/mL até 15,62 μg/mL), então foi possível constatar que os extratos
fúngicos dos isolados Penicillium sp. 2UVC8, Fusarium sp. 3UVLFC1 e Penicillium sp.
11LCL5 demonstraram atividade antimicrobiana contra S. aureus (ATCC 6538), enquanto o
extrato fúngico 4UVLFC2 (N.I), exibiu atividade contra C. albicans (ATCC 10231),
evidenciando a potencialidade dos metabólitos secundários produzidos pelos fungos
filamentosos da Caatinga (Tabela 2).

O extrato de Fusarium sp. 3UVLFC1 apresentou potencial inibitório frente à S.
aureus, pois seu halo de inibição foi de 22 mm enquanto o halo exibido pelo controle positivo
cloranfenicol foi 24 mm, evidenciando uma proximidade de ação do extrato fúngico testado
em comparação ao antimicrobiano de ação já comprovada. Já em relação ao potencial
antifúngico, a nistatina foi utilizada como controle positivo com halo de inibição de 12,6 mm
assim, destacaram-se os extratos 4UVLFC2 (N.I), que exibiu halo de 10 mm, bem próximo ao
controle e o extrato de Fusarium sp. 4LCEM2, que expressou halo de 14 mm superando o
halo de inibição apresentado pela nistatina.
Tabela 2. Halo de inibição (mm) por método de difusão em disco dos extratos de fungos da
Caatinga em Ágar Czapek a 37,0ºC durante 15 dias e extraídos com acetato de etila.
Líquen

N.I.**

Fungos
(códigos)

2LCL1

Halo de inibição (mm)
E. coli
ATCC
11775
0,0

S. aureus P. aeruginosa C. albicans
ATCC
(isolado
ATCC
6538
clínico)
10231
0,0
0,0
7,0

3UVLCL1

0,0

22,0

0,0

0,0

4LCEM2

0,0

0,0

0,0

14,0

4UVLFC2

0,0

0,0

0,0

10,0

Ampicilina (AMP)
10mcg
Gentamicina (GEN)
10mcg
Cefepime (CPM)
30mcg
Azitromicina (AZI)
15mcg
Penicilina (PEN) 10U.I

0,0

-*

-*

*-

18,0

-*

*-

-*

9,0

-*

-*

-*

-*

0,0

-*

-*

-*

0,0

-*

-*

Cloranfenicol (CLO)
-*
30mcg
Piperacilina (PPT)
-*
Controle positivo
110mcg
Ceftazidima (CAZ)
-*
30mcg
Amicacina (AMI)
-*
30mcg
Nistatina (NI) 100.000
-*
U.I
(*) - : gênero não identificado; (**)N.I: não identificado.

24,0

-*

-*

-*

25,4

-*

-*

22,4

-*

-*

24

-*

-*

-*

12,6

Xanthoparmelia plittii
(Gyeln.) Hale (LC2)

Fonte: a autora (2023).

Figura 3: Screening dos Extratos fúngicos da Caatinga, que demonstraram ação contra S.
aureus (ATCC 6538) e C. albicans (ATCC 10231) em concentrações de 2000 e 500 μg/mL.
(A) Placa de S. aureus (ATCC 6538) com halo de inibição na amostra de Fusarium sp.
3UVLFC1. (B) Placa de C. albicans (ATCC 10231) com halo de inibição nas amostras de
Penicillium sp. 2LCL1, Fusarium sp. 4LCEM2 e 4UVLFC2 (N.I).

Fonte: a autora (2023).

Na avaliação qualitativa por meio do método de microdiluição em caldo, é possível
observar que dos 35 extratos fúngicos produzidos, 28,5% deles apresentou atividade
antimicrobiana em altas concentrações, destacando-se a amostra 4UVLFC2 (N.I) por
demonstrar atividade biológica tanto contra bactéria, quanto contra fungo. Os resultados
diferiram de acordo com os métodos de Difusão em Disco (DD) e Microdiluição em Caldo.
Foi possível registrar (Tabela 3) que extratos que exibiram atividade no ensaio de
microdiluição, não apresentaram inibição antimicrobiana no método de DD, corroborando
com BONA et al. (2014), então é lícito sugerir que a difusão foi incompleta. Tal fato pode
acontecer em compostos que possuem menor polaridade, pois isso torna a difusão mais lenta
no meio de cultura sólido (MORENO et al, 2006; BONA et al., 2014), o que não quer dizer,
necessariamente, que o composto não possui atividade.
Tabela 3: Comparação dos resultados obtidos na avaliação qualitativa por meio dos métodos
de Disco Difusão e Microdiluição em Caldo, ambos realizados em concentrações de 1000
μg/mL e 500 μg/mL.
Extratos fúngicos que exibiram atividade antimicrobiana
em concentrações de 1000 e 500 μg/mL
Micro-organismo
Disco Difusão
Microdiluição em Caldo
Fusarium sp. 3UVLCL1
Fusarium sp. 3UVLFC1
Penicillium sp. 2LCL1
S. aureus
4UVLFC2 (N.I)
ATCC 6538
2UVLFC3 (N.I)
Penicillium sp. 4UVLFC3
Penicillium sp. 2UVC8
Penicillium sp. 11LCL5
E. coli
1UVLFC3 (N.I)
ATCC 11775

-

P. aeruginosa
(isolado clínico)
C. albicans
ATCC 10231

5UVLFC2 (N.I)
Fusarium sp. ALC3
4UVLFC2 (N.I)

4UVLFC2 (N.I)
Penicillium sp. 2LCL1
Fusarium sp. 4LCEM2

Fonte: a autora (2023).

A tabela 4, expõe os resultados obtidos na avaliação da atividade antimicrobiana, com
a determinação da concentração inibitória mínima (CIM) dos extratos fúngicos Fusarium sp.
3UVLFC1, 4UVLFC2 (N.I), Penicillium sp. 11LCL5 e Penicillium sp. 2UVC8. A CIM para
atividade antibacteriana frente à S. aureus (ATCC 6538) variou de 125,0 a 500,0 μg/mL, para
os extratos em que até a máxima concentração empregada (2000,0 μg/mL) não foi obtida
inibição do crescimento para estabelecimento da CIM, eles não foram expostos na tabela.
Observou-se que 11,42% (n=4) dos extratos fúngicos apresentam atividade antimicrobiana.
Outrossim, o isolado Penicillium sp. 2UVC8 exibiu a melhor atividade biológica (125 μg/mL)
quando comparado aos demais que demonstraram atividade inibitória contra S. aureus (ATCC
6538), sendo assim o mais efetivo, seguido dos extratos Fusarium sp. 3UVLFC1 (250 μg/mL)
e Penicillium sp. 11LCL5 (500 μg/mL). No tocante à atividade antifúngica, o isolado
4UVLFC2 (N.I) apresentou resultado promissor, pois foi efetivo em concentração de 31,2
μg/mL contra C. albicans (ATCC 10231).

Tabela 4: Concentração Inibitória Mínima através do método de microdiluição em caldo
Mueller Hinton dos extratos fúngicos (2000 μg/mL a 15,62 μg/mL).
Líquen

Fungos
(códigos)

N.I.**

Fusarium sp.
3UVLFC1
(N.I)
4UVLFC2
Penicillium sp.
11LCL5
Penicillium sp.
2UVC8

Xanthoparmelia plittii (Gyeln.) Hale
(LC2)
Dirinaria applanata (Fée) D.D.
Awasthi (LC5)
Peltula euploca (Ach.) Poelt (LC8)

(*) - : gênero não identificado; (**)N.I: não identificado.
Fonte: a autora (2023).

Concentração Inibitória Mínima
(μg/mL)
E. coli S. aureus P. aeruginosa C. albicans
ATCC
ATCC
(isolado
ATCC
11775
6538
clínico)
10231
-*
250,0
-*
-*
-*

-*

-*

31,2

-*

500,0

-*

-*

-*

125,0

-*

-*

Alguns estudos evidenciam que espécies fúngicas de Penicillium originaram
antibióticos importantes como as penicilinas (CHANDRA & KUMAR, 2017; XIAN et al,
2020), tendo destaque a Penicilina G, que é um metabólito secundário da espécie Penicillium
chrysogenum, renomeado para P. rubens, e única penicilina natural clinicamente utilizada
(FIERRO et al., 2022; SANTIAGO et al., 2022). Tais pesquisas demonstram atividade
antimicrobiana desse gênero, corroborando com os resultados encontrados neste estudo.
O gênero Fusarium spp. produz uma abrangente variedade de metabólitos secundários
com atividades farmacológicas, sendo uma das atividades notáveis a antimicrobiana (LI et al.,
2019; PERINCHERRY et al., 2021; SINGH et al., 2021; AHMED et al., 2022). No grupo dos
compostos produzidos por Fusarium sp. estão: alcalóides, terpenos, esteróis, policetídeos,
peptídeos e outros (LI et al., 2019; AHMED et al., 2022). Assim como este estudo
demonstrou atividade antimicrobiana por esse gênero, há outras pesquisas indicando essa
propriedade, conforme reportaram SINGH et al. (2021), que registraram atividade desse
gênero contra S. aureus.
Observou-se que o extrato de Penicillium sp. 2UVC8 demonstrou potencial
antibacteriano diante das cepas de S. aureus (ATCC 6538), com CIM= 125 μg/mL. Por outro
lado, esse mesmo extrato não exibiu inibição frente às cepas de E. coli (ATCC 11775), P.
aeruginosa (isolado clínico) e C. albicans (ATCC 10231). Ainda, os demais extratos fúngicos
avaliados também não exibiram ação antibacteriana frente às cepas Gram negativas (E. coli e
P. aeruginosa).
Os resultados da microdiluição em caldo frente à S. aureus (ATCC 6538), após o
fracionamento do extrato fúngico de Fusarium sp. 3UVLFC1 demonstram que suas frações
de acetato de etila e hexânica apresentaram potencial antibacteriano moderado (CIM= 125,0
μg/mL), enquanto a fração clorofórmica exibiu potencial promissor (CIM= 62,5 μg/mL). O
cálculo da CIM por meio do log das concentrações aplicadas é observado na figura 4. Os
fungos filamentosos apresentam um rico repertório no que concerne às propriedades
físico-químicas e biológicas, justificando o crescente interesse das indústrias biotecnológicas
(URQUHART et al. 2019; HYDE et al. 2019; BABY & THOMAS 2021), seus compostos,
extratos e frações têm sido pesquisados por evidenciarem propriedades significativas, dentre
elas a antimicrobiana (YAZICI et al. 2022; ABOUAMAMA et al., 2023).
Figura 4: Atividade antimicrobiana das frações de acetato de etila (A), clorofórmica (B) e
hexânica (C) do extrato fúngico de Fusarium sp. 3UVLFC1, no ensaio de CIM em
microdiluição em caldo frente à S. aureus (ATCC 6538).

Fonte: a autora (2023).

A pesquisa por compostos naturais com atividade antimicrobiana é de suma relevância
devido ao aumento da resistência bacteriana ao longo do tempo, que está associada a
diferentes ambientes e pode atingir indivíduos com comorbidades, imunocomprometidos e
saudáveis (Lewis 2020; Liu et al. 2021b; Loftus et al. 2022). Desse modo, os resultados
encontrados para S. aureus recebem destaque, uma vez que essa bactéria tem alto índice de
resistência a vários antibióticos, como os betalactâmicos e meticilina, reduzindo as
possibilidades terapêuticas (Liu et al. 2021b; Ahmad-Mansour et al 2021; Cheung et al.
2021).
Atividade citotóxica em células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC)
A fim de verificar se os extratos fúngicos de Penicillium sp. 2UVC8, Fusarium sp.
3UVLFC1 e Penicillium sp. 11LCL5 teriam efeito citotóxico em linfócitos após 48 horas de
cultura, foi realizado o ensaio de viabilidade celular com o MTT (brometo de
3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio) (Vistica et al. 1991). Nenhum extrato avaliado
reduziu a viabilidade celular nas concentrações de 2000,0 a 15,62 μg/mL, de forma que os
extratos não foram citotóxicos às células mononucleares periféricas humanas (Tabela 5).
Tabela 5: Atividade citotóxica dos extratos fúngicos em PBMC.
Tratamento

*CI50 (μg/mL)

*ECM (%)

Fusarium sp. 3UVLFC1

>2000

Não citotóxico

Penicillium sp. 2UVC8

>2000

Não citotóxico

Penicillium sp. 11LCL5

>2000

Não citotóxico

*CI50: concentração inibitória média; *ECM: efeito citotóxico máximo.

Fonte: a autora (2023).

A avaliação da citotoxicidade é bastante relevante, pois alguns fungos filamentosos
podem produzir micotoxinas, metabólitos que prejudicam o organismo humano pelos efeitos
tóxicos (Morales et al. 2018; Silva et al, 202; Gasser et al, 2023). Sabe-se que o sistema
imune possui células específicas capazes de proteger o organismo de diferentes tipos de
contaminação e, enquanto os macrófagos compõem a imunidade inata, os linfócitos são

células que também fazem parte desse arsenal e desencadeiam a imunidade adaptativa
(Kumar et al, 2020).
Santos et al. (2023, dados não publicados) utilizaram uma alíquota dos extratos
fúngicos de Fusarium sp. 4LCEM2, 4UVLFC2 (N.I) e Penicillium sp. 2LCL1 para realizar
ensaio de citotoxicidade em macrófagos da cepa J774.A1 e de viabilidade de promastigotas de
duas formas de Leishmania, L (L). amazonensis e L (L). chagasi. Em seus resultados os
autores relatam que os três extratos exibiram toxicidade com CI50 abaixo de 50 µg/mL, por
outro lado os extratos foram bem-sucedidos em eliminar as duas formas promastigotas e
ainda, os extratos fúngicos de Penicillium sp. 2LCL1 e 4LCEM2 (N.I) apresentaram maior
seletividade para L (L). amazonensis, quando comparados aos macrófagos, uma vez que
obtiveram índice de seletividade maior que 10. Com isso, tais extratos demonstram
viabilidade ao desenvolvimento de novos fármacos.
Há pesquisas que testam a citotoxicidade de extratos fúngicos em células tumorais,
uma delas selecionou extratos de fungos filamentosos de diferentes gêneros, dentre eles:
Penicillium e Aspergillus e analisou o efeito desses extratos no crescimento de células
tumorais. Os autores revelaram que os extratos de Aspergillus apresentaram IC50 de 95,21
µg/mL contra células de câncer de mama humano e os extratos de Penicillium demonstraram
a menor porcentagem de toxicidade contra PBMCs, com IC50 de 409,8 µg/mL. Dentre os
demais resultados apresentados, eles concluem que os extratos de fungos filamentosos
demonstraram inibição significativa das células tumorais testadas e baixa inibição para as
PBMCs (Ramírez-Villalobos et al. 2021).
Perfil antioxidante dos extratos fúngicos
Os 35 extratos fúngicos foram avaliados através dos métodos do radical
livre DPPH e FRAP em concentrações de 2000 e 500 μg/mL, a partir disso constatou-se que
17% (n= 6) desses extratos apresentaram atividade antioxidante em ambos os métodos, são
eles: 4UVLFC2 (N.I), Fusarium sp. 4LCEM2, Penicillium sp. 2LCL1, Aspergillus sp.
7UVLFC2, Alternaria sp. 4UVLFC7 e Alternaria sp. 3UVLFC7 (Figura 5). Para expor o
potencial antioxidante dos extratos foi demonstrada a atividade de eliminação do radical
DPPH por porcentagem, já pelo método FRAP a atividade antioxidante foi expressa por
miliequivalentes de BHT, ácido gálico e também pelo aumento da absorbância (595 nm).
Diferentes pesquisadores afirmam que os fungos filamentosos são
importantes produtores de compostos potencialmente antioxidantes e isso ocorre pela

presença de compostos fenólicos, taninos não hidrolisáveis e flavonoides (HAMEED et al,
2017; SUGIHARTO, 2019; CHAKRABORTY et al., 2021).
Figura 5: Atividade antioxidante através dos métodos DPPH (A) e FRAP (B), ambos em
concentração de 2000 μg/mL.

Fonte: a autora (2023).

O DPPH é um radical livre de coloração violeta em metanol ou etanol e perante
moléculas de antioxidantes ele passa a ser reduzido para a forma DPPH-H, com isso sua cor
se altera para amarelo, uma vez que a substância redutora atua doando átomo de hidrogênio.
A capacidade de redução do radical livre pela amostra analisada é monitorada pela alteração
da absorbância por meio do espectrofotômetro. Assim, quanto menor a absorbância, maior
será o potencial antioxidante da amostra avaliada (Pires et al. 2017; Munteanu & Apetrei
2021). O extrato fúngico 4UVLFC2 (N.I) foi particionado em frações de acetato de etila,
clorofórmica e hexânica, para análise comparativa do potencial antioxidante de cada uma
delas através do método de redução do radical DPPH. Os resultados revelaram que a fração
hexânica não teve capacidade de redução, enquanto as demais frações foram eficazes e
apresentaram potencial antioxidante por esse método, com concentração efetiva (EC50%) da
fração clorofórmica (EC50=125,8) sendo mais efetiva quando comparada à fração de acetato
de etila (EC50=213,1).

Figura 6: Atividade antioxidante dos extratos fúngicos de Fusarium sp. 4LCEM2 (A), Alternaria sp. 4UVLFC7 (B), Alternaria sp. 3UVLFC7
(C), Aspergillus sp. 7UVLFC2 (D) e Penicillium sp. 2LCL1 (E) no ensaio FRAP em diferentes concentrações.

Fonte: a autora (2023).

Os ensaios aplicando o método FRAP seguiram em concentrações de 1000 μg/mL a
62,5 μg/mL, evidenciando o isolado de Fusarium sp. 4LCEM2, que exibiu o melhor
resultado, seguido dos extratos fúngicos de Alternaria sp. 4UVLFC7 e Alternaria sp.
3UVLFC7. LIU et al. (2021) relataram que fungos endofíticos do gênero Alternaria spp.
produzem piranonas, metabólitos secundários com atividade sequestradora do radical DPPH.
Assim como as pesquisas de MIAO et al. (2017) e TIAN et al. (2017), que apontaram ação
antioxidante significativa a partir de metabólitos secundários de Alternaria spp. caracterizados
como piranonas e metabólitos nitrogenados. Ao avaliar, individualmente, o desempenho do
extrato fúngico de Fusarium sp. 4LCEM2 no ensaio antioxidante FRAP, é nítido que há
aumento da absorbância concomitante ao acréscimo da concentração, indicando a gradação da
atividade antioxidante, o mesmo acontece com as amostras de Alternaria sp. 4UVLFC7 e
Alternaria sp. 3UVLFC7 (Figura 6).
Os extratos fúngicos de Alternaria sp. 3UVLFC7 e Alternaria sp. 4UVLFC7 passaram
por processo de particionamento e suas frações de acetato de etila, clorofórmica e hexânica
foram avaliadas quanto ao potencial de redução de íons ferro, FRAP, como pode ser visto pela
exposição dos dados na Figura 7.
Os dados apontam que as frações de acetato de etila e clorofórmica de ambos os
extratos demonstraram as melhores atividades, enquanto a mesma confrontação indica que as
frações hexânicas não inibiram os radicais livres no ensaio realizado.

Figura 7: Gráficos expressando a atividade antioxidante pelo método FRAP das frações de
acetato de etila, clorofórmio e hexano dos extratos de Alternaria sp. 3UVLFC7 (A) e
4UVLFC7 (B).

Fonte: a autora (2023).

Análise espectral FTIR
Nas figuras 8 e 9 seguem apresentados os espectros de infravermelho (FTIR) obtidos
das análises dos extratos fúngicos fracionados com os solventes hexano, clorofórmio (CHCl3)
e acetato de etila (EtOAc). O padrão espectral de cada fração foi determinado pela
composição metabólica dos extratos, que reflete a natureza química dos compostos
constituintes.
Figura 8. Espectros de infravermelho (FTIR) dos extratos de fungos com atividade
antimicrobiana e fracionados em diferentes solventes: acetato de etila (linha azul),

clorofórmio (linha vermelha) e hexano (linha preta). A) Extrato 2: 11LCL5; B) Extrato 3:
2UVC8; C) Extrato 4: 3UVLFC1.

A)

B)

C)
*Os espectros foram gerados empregando a faixa espectral de 650 a 4000 cm-1.

Fonte: do autor.

Figura 9. Espectros de infravermelho (FTIR) dos extratos de fungos com atividade
antioxidante e fracionados em diferentes solventes: acetato de etila (linha azul), clorofórmio
(linha vermelha) e hexano (linha preta). A) Extrato 1: 3UVLFC7; B) extrato 5: 4UVLFC7; C)
extrato 6: 4UVLFC2; D) extrato 7: 7UVLFC2.

A)

B)

C)

D)

*Os espectros foram gerados empregando a faixa espectral de 650 a 4000 cm-1.

Fonte: do autor.

Entre as amostras analisadas, algumas mostraram nítidas diferenças em seus perfis
espectrais, já outras apresentaram relativa semelhança entre si. Diferenças e semelhanças
espectrais podem sugerir aproximação ou distanciamento em termos de composição das
frações. Separando os espectros em dois blocos baseando-se no perfil espectral, um grupo
com os extratos produzidos por 3UVLFC7, 4UVLFC7 e 4UVLFC2 (Figura 9) apresentaram
certa semelhança, com muitos picos indicando absorção de grupos comuns entre eles e esses
extratos possuem atividade antioxidante comum. Bandas largas de hidroxilas, sugestivas de
ácidos carboxílicos, aparecem com considerável proeminência nestes extratos (CHCl3 e
EtOAc), acompanhadas de fortes absorções de carbonilas em 1708-1712 cm-1. Além disso,

estão presentes outras absorções indicativas de compostos carbonílicos, como ésteres
(1738-1745 cm-1).
Conforme também apresenta a Tabela 6, vários sinais que se relacionam com a ligação
C-O aparecem com elevada intensidade e confirmam a participação dessas classes de
compostos nos mencionados extratos, além de também sugerir a presença de C-O de álcoois e
éteres. Este aspecto pode indicar maior participação de compostos ácidos e outros
carbonilados nestes extratos com relação aos demais. Sinais característicos de grupos amida e
compostos insaturados (dupla ligação), como alcenos e compostos aromáticos, também estão
presentes nos espectros. É importante ressaltar que, embora haja semelhança espectral entre
eles, suas composições podem apresentar significativas diferenças, uma vez que dentro de
uma mesma classe de compostos orgânicos é comum existir compostos com propriedades
físico-químicas acentuadamente diferentes, além da ausência de sinais espectrais de
metabólitos que podem estar presentes em baixa concentração e também daqueles que foram
sobrepostos por picos de maior intensidade.
Tabela 6: Dados espectrais obtidos das análises dos extratos por espectroscopia de
infravermelho (FTIR).
DADOS ESPECTRAIS
Extrato

1
(3UVLFC7
)

2
(11LCL5)

Hexano

CHCl3

EtOAc

Ligação / Grupo Funcional

3007
2954

2956

2956

=C-H
CH3

2921, 2853
1743
1708
1650
1506
1463

2923, 2853
1710
1649, 1643
1607
1506, 1485
1457

2923, 2853
1710
1643
1607
1506, 1485
1457

CH2
C=O (Est)
C=O (-COOH)
C=O (amida)
C-N (amida, amina)
C=C (aromático, alceno)
CH2

1378

1375

1373

CH3

1412

-

-

C-H (O-CH3), C=C (aromático)

1283, 1165

1236, 1210,
1165, 1004

1236, 1210,
1165, 1043,
1004

C-O (-COOH, -COOR, C-O-C,
C-OH)

946, 933

841, 832, 823

841, 832

=C-H (aromático, alceno)

723

-

-

CH2

2956

2958

2956

CH3

2922, 2853

2924, 2853

2922, 2853

CH2

1742
1709
1463

1736
1724, 1709
1632
1590
1454

1742
1709
1590
1454

C=O (-COOR)
C=O (-COOH)
C=O (amida)
C=C (aromático, alceno)
CH2

1413

1407

1407

C-H (O-CH3), C=C (aromático)

1377

1374

1377

CH3

-

1280, 1242,
1044
841, 760

-

C-O (-COOH, -COOR, C-O-C,
C-OH)
=C-H (aromático, alceno)

726, 720

-

726

CH2

2955

2956

2955

CH3

2923, 2853
1741
1725, 1711
1463, 1456

2923, 2853
1727, 1711
1651, 1641
1599
1571
1456

2923, 2853
1725, 1711
1651, 1641
1602
1573
1463

CH2
C=O (-COOR)
C=O (-COOH)
C=O (amida)
C-N (amida, amina)
C=C (aromático, alceno)
CH2

1410

1406

1410

C-H (O-CH3), C=C (aromático)

1375

1380

1380

CH3

1280, 1242

3
(2UVC8)

722

1241, 1210,
1042
912, 859
-

704
3008
2955
2922, 2852
1744
1711
-

912
-

C-O (-COOH, -COOR, C-O-C,
C-OH)
=C-H (aromático, alceno)
CH2

704
3011
2955

704
3008
2955

=C-H, C=C
=C-H
CH3

2922, 2852
1744
1659
1575, 1495,
1464

2922, 2852
1744
1711
1575, 1495,
1464, 1456

CH2
C=O (-COOR)
C=O (-COOH)
C=O (amida)

1456

1454

-

CH2

1376

1376

1376

CH3

1260, 1209,
1162, 1094,
1044

1260, 1241,
1211, 1171,
1094, 1044

1260, 1209,
1171, 1162,
1094, 1044

C-O (-COOH, -COOR, C-O-C,
C-OH)

-

976, 923

976

=C-H (aromático, alceno)

1042

4
(3UVLFC1
)

1280

1495, 1464

1241, 1210

C=C (aromático, alceno)

722

-

-

CH2

705
3008

705
2980, 2969,
2870

705
-

=C-H, C=C
=C-H

2980, 2870

CH3

2952, 2870

5
(4UVLFC7
)

6
(4UVLFC2
)

7

2923, 2852
1744
1708
1456

2925, 2854
1712
1643
1609
1485
1456

2925, 2854
1712
1643
1609
1456

CH2
C=O (-COOR)
C=O (-COOH)
C=O (amida)
C-N (amida, amina)
C=C (aromático, alceno)
CH2

1416

1416

1416

C-H (O-CH3), C=C (aromático)

1377

1374

1374

CH3

-

1234, 1164,
1117, 1059,
1007

1234, 1164,
1044, 1007

C-O (-COOH, -COOR, C-O-C,
C-OH)

-

991, 885,
991, 885,
845, 830, 776 845, 831, 776

=C-H (aromático, alceno)

725

-

-

CH2

660
3008

659
-

=C-H, C=C
=C-H

2953, 2870

2978, 2870

659
2978, 2970,
2870

2922, 2852

2922, 2854

1745
1712
1465
1455

CH3

1738
1712
1645
1623
1485, 1465
1455, 1445

2923, 2858,
2854
1712
1645
1623
1485, 1465
1455, 1445

C=O (-COOR)
C=O (-COOH)
C=O (amida)
C-N (amida, amina)
C=C (aromático, alceno)
CH2

1375

1375

1375

CH3

1162

1238, 1227,
1174, 1045,
1003

1253, 1238,
1227, 1174,
1045, 1003

C-O (-COOH, -COOR, C-O-C,
C-OH)

-

863, 845,
829, 791

863, 845,
829, 791

=C-H (aromático, alceno)

722

-

-

CH2

660
3008

686, 660
-

686, 660
-

=C-H, C=C
=C-H

CH2

(7UVLFC2
)

2954

2954

2954

CH3

2922, 2853
1744
1709
1511, 1465
1455

2922, 2853
1744
1709
1667
1600
1511, 1465
1455

2922, 2853
1744
1709
1667
1600
1464
1455

CH2
C=O (-COOR)
C=O (-COOH)
C=O (amida)
C-N (amida, amina)
C=C (aromático, alceno)
CH2

1416

-

-

-

1158

-

724

-

-

C-H (O-CH3), C=C (aromático)
C-O (-COOH, -COOR, C-O-C,
C-OH)
CH2

Fonte: do autor.

Em outro grupo, pôde-se destacar semelhanças nos perfis espectrais dos extratos 2, 3,
4 e 7. Com espectros menos complexos que os dos demais extratos, com menos sinais e
absorções mais fracas, podem sugerir que as correspondentes frações sejam mais simples em
termos de composição. Absorções características de ácidos carboxílicos, como banda larga de
OH de ácido, absorções de C=O em 1709-1724 cm-1 e de C-O em 1044-1280 cm-1, também
estão presentes nesses extratos, embora sejam menos intensas. Outros grupamentos químicos
com sinais característicos aparecendo nos espectros seguem mostrados na Tabela 6, podendo
também ser observado as diferenças de sinais espectrais entre esses extratos.
Picos gerados a partir de absorções de estiramento da ligação C-H de grupos metilas e
metilenos (CH3 e CH2, respectivamente) aparecem com valores definidos de números de onda
em todos os espectros (2954-2956 cm-1, CH3; 2921-2925 cm-1, 2852-2854 cm-1, CH2; Tabela
6). Outras absorções desses grupos, as de dobramento, também aparecem com valores
definidos em todos os extratos (1454-1463 cm-1, CH2; 1373-1380 cm-1, CH3; Tabela 6).
No tocante às frações obtidas com os solventes hexano, CHCl3 e EtOAc, para todos os
extratos, os espectros obtidos com a mistura extraída com hexano foram mais simples, com
menor número de picos de média e alta intensidade. Alguns sinais comuns às frações com os
três solventes, como o estiramento de C=O de ácidos e ésteres, aparecem com menor
intensidade relativa nas frações com hexano, além da banda de OH de ácidos, que não
aparecem nestas frações. Este aspecto é resultante de baixas concentrações dos metabólitos
presentes nestas frações, o que aponta para maior solubilidade da maior parte dos metabólitos

nos solventes CHCl3 e EtOAc. Além disso, este fato também sugere haver menor número de
componentes nas frações preparadas com hexano.
O pico que aparece em 722-726 cm-1 é proveniente de grupos metileno (CH2),
produzido por vibração de dobramento característico de cadeias carbônicas com número de
CH2≥ 4. Este aspecto indica a presença de espécies químicas dotadas de pequenas e/ou
grandes frações hidrocarbônicas nos extratos, incluindo como alguns dos prováveis
candidatos, ácidos graxos e seus derivados.
Há poucos estudos que associam a espectroscopia FTIR à caracterização e
identificação de extratos fúngicos. Lecellier et al. (2014) avaliaram o desempenho dessa
técnica para identificar fungos filamentosos com base em uma construção de banco de dados
das informações moleculares de cada amostra utilizada. Os seus achados corroboraram com
os resultados desta pesquisa, uma vez que indicaram informações bioquímicas semelhantes
em frequências espectrais similares.
Conclusões
O bioma Caatinga oferece uma rica diversidade de micro-organismos, que pela
necessidade de sobrevivência em um ambiente de condições ambientais extremas,
desenvolvem mecanismos de adaptação e proteção por meio da síntese de compostos com
benefícios para si próprios e para os humanos. Nessa conjuntura, destacam-se os metabólitos
secundários secretados por fungos filamentosos, que apresentaram potencial biotecnológico
com possíveis aplicações em indústrias farmacêuticas, nutracêuticas e cosmética.
Evidencia-se que, dos 35 extratos fúngicos produzidos, 11,42% (n=4) exibiu atividade
antimicrobiana. Sendo o extrato fúngico de Penicillium sp. 2UVC8 o responsável pela melhor
ação inibitória contra S. aureus (ATCC 6538), apresentando uma CIM = 125 μg/mL.
Outrossim, a descoberta de compostos antioxidantes tem grande relevância como
fonte de novas terapêuticas, uma vez que podem ter aplicação promissora em medicamentos
nutracêuticos e biocosméticos. Esse trabalho demonstrou a eficiência do extrato fúngico de
Fusarium sp. 4LCEM2, através da aplicação do método FRAP.
O presente estudo ressalta a relevância do bioma Caatinga como fonte de compostos
naturais com efetividade biotecnológica, assim é relevante destacar a importância da sua
preservação. Como também vale lembrar que os compostos naturais apresentam menor
possibilidade de causar toxicidade quando comprado aos compostos sintéticos.
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How to cite

​ AIA VRT, SILVA JKS, SAMPAIO EBT, SILVA MK, MOREIRA MAS, DUARTE
M
CKS, SILVA MNP, CÁRCERES MES, CAVALCANTI JG, QUEIROZ AC,
OLIVEIRA AJ & DUARTE AWF. 2023. Antimicrobial and antioxidant profile of
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Manuscript received on , 2023;
accepted for publication on November ,
Correspondence to: Alysson Wagner Fernandes Duarte E-mail:
alysson.duarte@arapiraca.ufal.br

6 CONCLUSÕES
Com o passar do tempo as doenças infecciosas têm se estabelecido como algo comum.
A literatura reporta o crescente número de casos, assim como a gravidade dessas. No presente,

o uso de fármacos sintéticos é bastante indicado na terapêutica medicamentosa, mas, os
efeitos adversos são bastante prejudiciais ao organismo humano, sobretudo se houver a
necessidade de uso prolongado e de dosagem alta.
Fungos filamentosos que habitam locais extremos, como a Caatinga, possuem
capacidade de ativar mecanismos bioquímicos e genéticos para a produção de metabólitos
secundários, os quais funcionam como forma de adaptação e proteção. Ademais, esses
compostos têm uma enorme variabilidade estrutural, o que viabiliza seu amplo espectro de
atividades e funções.
Os bioensaios realizados e apresentados nesta dissertação com o intuito de investigar a
potencialidade biotecnológica dos fungos filamentosos do bioma Caatinga, evidenciaram a
atividade antimicrobiana contra S. aureus e antioxidante dos extratos fúngicos.
Os resultados propiciam o aprofundamento dos estudos farmacológicos do potencial
ativo biológico dos extratos fúngicos, uma vez que inúmeros medicamentos antimicrobianos
vêm perdendo a eficácia diante da resistência microbiana. Como também, dos ativos
antioxidantes, pois possuem uma ampla aplicabilidade biotecnológica. Assim, é notória a
relevância dos compostos bioativos oriundos dos fungos filamentosos da Caatinga e seus
futuros benefícios ao organismo humano.

7 LIMITAÇÕES E PERSPECTIVAS
É importante destacar, que mesmo diante de dificuldades, a equipe de pesquisa sempre
buscou alternativas, soluções colaborativas e parcerias possíveis para o desenvolvimento das
metodologias, o que viabilizou o desenvolvimento não só desta pesquisa, mas de diversas
outras.
Outrossim, a obtenção de dados secundários relevantes para a pesquisa foi
desafiadora, pois os fungos filamentosos do bioma Caatinga ainda são pouco estudados. Por
outro lado, esse também é um item que faz parte das perspectivas, pois trata-se de uma fonte
imensa de recursos a serem pesquisados e seus resultados já começam a fazer parte de um
novo banco de dados.
Em pesquisas futuras recomenda-se a identificação molecular dos fungos filamentosos
isolados para esta dissertação e o aprofundamento da caracterização de seus compostos
bioativos. Bem como a avaliação da sua atividade diante de biofilmes de bactérias e fungos.

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