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                    UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS
FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS

SÉRGIO LOPES DA SILVA

Influência das células de Schwann na progressão do câncer de próstata

MACEIÓ
2022

2

SÉRGIO LOPES DA SILVA

Influência das células de Schwann na progressão do câncer de próstata

Dissertação apresentada ao Programa de Pósgraduação em Ciências Médicas da Universidade
Federal de Alagoas-UFAL, como parte das
exigências para a obtenção do título de Mestre em
Ciências Médicas.
Orientadora: Prof. Dr. Carlos Alberto de Carvalho
Fraga

MACEIÓ
2022

3

4

GRADECIMENTO

Aos meus pais (Anália e Expedito) por todo incentivo, apoio, dedicação e por acompanhar
de perto mais uma etapa da minha formação acadêmica;
Ao meu Padrinho (Valmir) por sempre incentivar a buscar o melhor, me encorajando,
apoiando e incentivando em todas as etapas do mestrado;
Ao meu orientador Professor Dr. Carlos Fraga, pela oportunidade em realizar o mestrado
sobre sua orientação, a quem tenho profunda admiração pelo profissional e ser humano
que é, e a quem agradeço por sua amizade e ensinamentos;
A Genilda, Helem e Rodger, por toda paciência em ensinar a manusear os programas de
bioinformática e tirar as dúvidas durante a utilização;
Aos alunos de iniciação científica do laboratório que contribuíram direta e
indiretamente com a elaboração desta dissertação de mestrado.

5

“Feliz aquele que transfere o que sabe e aprende o que ensina”
(Cora Coralina)

6

Folha de Aprovação

Sérgio Lopes Da Silva
Influência das células de Schwann na progressão do câncer de próstata

Dissertação submetida ao corpo docente
do Programa de Pós-Graduação em
Ciências Médicas da Universidade
Federal de Alagoas e aprovada em
31/03/2022.

________________________________________________

Prof Dr. Carlos Alberto de carvalho Fraga
Universidade Federal de Alagoas- Campus Arapiraca / Complexo de Ciências Médicas
Orientador(a)
Banca Examinadora:
_______________________________________________
Profa. Dra. Carolinne de Sales Marques
Universidade Federal de Alagoas- Campus Arapiraca /Complexo de Ciências Médicas
________________________________________________
Profa. Dra. Amanda Karine Barros Ferreira Rodrigues
Universidade Federal de Alagoas- Campus Arapiraca / Complexo de Ciências Médicas
________________________________________________
Profa. Dra. Jussara Almeida de Oliveira Baggio
Universidade Federal de Alagoas- Campus Arapiraca / Complexo de Ciências Médicas

7

RESUMO

O fenômeno da carcinogênese é um processo complexo que ocorre por
meio de múltiplos eventos genéticos que alteram as funções normais dos
oncogenes e genes supressores de tumor. Estudos mostraram que as
células de Schwann participam do microambiente tumoral, produzindo
vários fatores que beneficiam as células cancerígenas. Durante esse
processo, as células de Schwann são desdiferenciadas e auxiliam o
processo de proliferação das células cancerígenas. Essas células então
migram para a região próxima ao tecido tumoral e auxiliam o
desenvolvimento da célula neoplásica. Nesse contexto, o objetivo do
presente estudo foi avaliar a influência das células de Schwann sobre o
câncer de próstata. Realizamos uma análise de bioinformática e
observamos que a "interação neuroativo ligante-receptor" foi regulada
positivamente no câncer de próstata. A "via de sinalização do p53"
apresenta-se ativa, uma vez que o CCNE1, CDKN2A e PERP
apresentam-se aumentados. miRNAs específicos inativam a via de
"orientação dos axônios", visando os genes ROBO2 e SLIT2. Ambos os
genes também estão associados à inibição da migração das células de
Schwann. Além disso, o GFAP e o GAP43 são superexpressos, levando
à desdiferenciação das células de Schwann. Tanto Schwann quanto as
células neoplásicas são estimuladas via cascata de fosforilação para
proliferar e migrar. Os resultados demonstram que a desdiferenciação e
proliferação de células de Schwann são induzidas pelo tecido neoplásico;
consequentemente, as células de Schwann produzem diferentes fatores
que participarão de vários processos de progressão tumoral. Esses
processos também podem estar envolvidos na invasão do tumor no tecido
perineural na neoplasia prostática.
Palavras-chave: Carcinogênese, Câncer de próstata; Metástase; Células de Schwann

8
ABSTRACT

The phenomenon of carcinogenesis is a complex process that occurs
through multiple genetic events that alter the normal functions of
oncogenes and tumor suppressor genes. Studies have shown that
Schwann cells participate in the tumor microenvironment, producing
several factors that benefit cancer cells. During this process, Schwann
cells are dedifferentiated and help the cancer cell . During this process,
Schwann cells are dedifferentiated and help the cancer cell to proliferate.
These cells then migrate to the region close to the tumor tissue and aid
the development of the neoplastic cell. In this context, the aim of the
present study was to evaluate the influence of Schwann cells on prostate
cancer. We performed a bioinformatics view and observed that the
"neuroactive ligand-receptor interaction" was up-regulated in prostate
cancer. The "p53 signaling pathway" is active, since CCNE1, CDKN2A
and PERP are increased. Specific miRNAs inactivate the "axon
guidance" pathway, targeting the ROBO2 and SLIT2 genes. Both genes
are also associated with inhibition of Schwann cell migration.
Furthermore, GFAP and GAP43 are overexpressed, leading to
dedifferentiation of Schwann cells. Both Schwann and neoplastic cells
are stimulated via a phosphorylation cascade to proliferate and migrate.
The results demonstrate that dedifferentiation and proliferation of
Schwann cells are induced by neoplastic tissue; consequently, Schwann
cells produce different factors that will participate in various tumor
progression processes. These processes may also be involved in tumor
invasion of the perineural tissue in prostate cancer.
Keywords: Carcinogenesis, Prostate cancer; Metastasis; Schwann cells

9

Sumário
1.

INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 10

1.1. Câncer de Próstata ............................................................................................................ 10

2.

1.1.1.

Epidemiologia ........................................................................................................ 10

1.1.2.

Fatores de risco ...................................................................................................... 11

1.1.3.

Diagnóstico ............................................................................................................. 11

1.1.3.1.

Diagnóstico histológico ...................................................................................... 13

1.1.4.

Estadiamento clínico ............................................................................................. 15

1.1.5.

Invasão perineural, Metástase e células de schwann ......................................... 16

OBJETIVOS ...................................................................................................................... 20
2.1.

Objetivo geral ............................................................................................................ 20

2.2.

Objetivos específicos ................................................................................................. 20

3.

METODOLOGIA ............................................................................................................. 21

4.

PRODUTOS....................................................................................................................... 22

5.

4.1.

Produto 1 .................................................................................................................... 22

4.2.

Produto 2 .................................................................................................................... 75

REFERENCIAS: ............................................................................................................. 118

10

1. INTRODUÇÃO
1.1. Câncer de Próstata
1.1.1. Epidemiologia
O câncer de próstata é a neoplasia mais comum no sexo masculino, com alta taxa
de incidência, excetuando-se os tumores de pele não-melanoma (WIWANITKIT, 2004).
É considerado um problema de saúde pública devido ao crescente aumento da incidência
e da mortalidade entre os homens, por apresentar um crescimento lento com poucos sinais
e sintomas em seu estágio inicial e associada ao envelhecimento do indivíduo
(CRAWFORD, 2003).
Há uma tendência para um aumento nas taxas de incidência e mortalidade, com
um impacto desfavorável na sobrevida e qualidade de vida dos indivíduos acometidos
pela doença. Segundo o Instituto Nacional de Câncer (INCA) as estimativas, para o
Brasil, são de 65.840 casos novos de câncer de próstata para cada ano do triênio 20202021 (INCA, 2019).
Figura 1 – Distribuíçao proporcional dos dez dos dez tipos de câncer mais incidentes (exceto de pele não
melanoma) estimados para 2020 por sexo no Brasil.

Fonte: Instituto Nacional do Câncer José Alencar Gomes da Silva. Estimativa 2020: Incidência de Câncer no Brasil. Rio de Janeiro. Inca 2020

Na região nordeste há uma estimativa de 20.750 novos casos dessa patologia com
risco estimado de 72,35/100 mil homens. Na projeção de dados para o estado de Alagoas
890 casos/100 mil homens e na capital, Maceió, 300/100 mil homens. (INCA, 2019).

11
Figura 2 – Distribuíçao proporcional dos dez dos dez tipos de câncer mais incidentes (exceto de pele não
melanoma) estimados para 2020 por sexo - região Nordeste.

Fonte: Instituto Nacional do Câncer José Alencar Gomes da Silva. Estimativa 2020: Incidência de Câncer no Brasil. Rio de Janeiro. Inca 2020

A etiologia do Câncer de próstata é multifatorial e, embora ainda não totalmente
compreendida, as variações geográficas e étnicas sugerem que os fatores genéticos têm
um papel fundamental, bem como os fatores ambientais e de estilo de vida. Até agora, os
fatores de risco mais bem estabelecidos são idade, história familiar e etnia(BENAFIF;
KOTE-JARAI; EELES, 2018).
1.1.2. Fatores de risco
É sabido que o câncer de próstata acomete principalmente os homens mais
velhos. Cerca de 6 em cada 10 casos são diagnosticados em homens com mais de 65 anos,
sendo raro antes dos 40 anos. A média de idade no momento do diagnóstico é de 66 anos.
Foi demonstrado que além da idade avançada, outros fatores como: etnia, história
familiar, alterações hormonais e doenças especificas, são fatores associado a neoplasia de
próstata (TOURINHO-BARBOSA; POMPEO; GLINA, 2016, POURESMAEILI et al..
2014 ).
Histórico familiar positivo para câncer de próstata, pai ou irmão, antes dos 60 anos
de idade é fator relevante que pode aumentar o risco de 3 a 10 vezes em relação à
população em geral e refletir o comportamento genético ou fatores sócios ambientais
compartilhados (INCA, 2002).
Na revisão publicado por KHEIRANDISH; CHINEGWUNDOH, 2011;
comparando a incidência de Câncer de próstata entre homens negros e brancos foi
observado que homens negros têm 2,4 vezes mais probabilidade de morrer de câncer de
próstata do que homens brancos da mesma idade.
1.1.3. Diagnóstico
Um fator importante para o aumento do diagnóstico do câncer de próstata foi a
descoberta da molécula do antígeno prostático especifico (PSA), uma glicoproteína de 34

12

kDa produzida pelas células epiteliais prostáticas colunares e ductais com a finalidade de
liquefação do sêmen. É usado como biomarcador no diagnóstico, estadiamento e
monitoramento de pacientes com câncer de próstata, por ser uma molécula produzida
exclusivamente pela próstata(KHEIRANDISH; CHINEGWUNDOH, 2011).
No rastreamento do câncer de próstata o exame digito prostático e a dosagem do
PSA, apresentam limitações relacionadas à sensibilidade e especificidade e ao baixo valor
preditivo positivo. Em função disso, os benefícios e os riscos do rastreamento para este
câncer têm sido amplamente debatidos na literatura e não há consenso em relação às
diretrizes para sua utilização em nível populacional.(ABRAHAMSSON et al., 2009;
BRYANT; HAMDY, 2008; CRAWFORD, 2003; GREENE et al., 2009)
O rastreio do câncer de próstata baseado em PSA é controverso e não tem uma
padronização mundial. O rastreamento baseado na dosagem dessa proteína apontou uma
redução na taxa de morte por câncer de próstata em 20%, porém foi associado ao aumento
do sobrediagnóstico (SCHRÖDER et al., 2009). A Sociedade Brasileira de Urologia
(SBU) recomenda que homens a partir de 50 anos devem procurar avaliação
individualizada. E aqueles com fatores de risco como: raça negra, parentes de primeiro
grau com câncer de próstata devem começar aos 45 anos. O rastreamento deve ser
realizado após análise dos potenciais riscos.
Na prática, o que tem sido observado em diferentes países é a realização dos
exames de rastreamento por uma elevada proporção de indivíduos, com repercussões
significativas na saúde pública, como super diagnóstico e super tratamento(BOYLE;
BRAWLEY, 2009; SMITH et al., 2013). O PSA é uma proteína específica da próstata,
mas não é específico do câncer de próstata, pois encontra-se elevações no nível de PSA
em outras condições, como grande hiperplasia benigna da próstata, prostatite,
manipulações da próstata e ejaculação recente em 24 horas (LOJANAPIWAT et al.,
2014)
O exame dígito prostático, associado ao PSA é importante na propedêutica
urológica, influenciado por fatores culturais entre diferentes populações. A triagem é uma
ação secundária de prevenção para a detecção da doença em fases anteriores. De modo
geral, é preconizado que os médicos discutam a realização do rastreamento e suas
possibilidades diagnósticas e terapêuticas com os pacientes de 50 anos ou mais, para que

13

seja tomada, individualmente, uma decisão informada (ABRAHAMSSON et al., 2009;
SMITH et al., 2013; TOURINHO-BARBOSA; POMPEO; GLINA, 2016).
Quando há discordância entre o valor do PSA e o exame digito-prostático, a
biópsia transretal de próstata guiada por ultrassonografia, tem um valor fundamental na
confirmação diagnóstica do câncer de próstata, pois permite coletar fragmentos de áreas
suspeitas. No entanto, as biópsias com retirada de seis fragmentos, correspondem
aproximadamente cerca de 1% do volume da glândula, e carregava o risco de perder
pequenos tumores em glândulas de grande volume e aqueles na zona periférica
anterolateral, zona de transição anterior e ápice. A zona periférica representa até 75% dos
cânceres e a biópsia padrão com retirada de 6 fragmentos perde até 30% das neoplasias
clinicamente significativas, razão pela qual o número de fragmentos foi posteriormente
aumentado para 8, 12 e 14 com melhora resultante na detecção de câncer (CHING et al.,
2009; DAS et al., 2019(BONEKAMP et al., 2011; CHING et al., 2009; DAS et al., 2019)
1.1.3.1.

Diagnóstico histológico

A obtenção de fragmentos de todas as zonas prostáticas, com inclusão das zonas
suspeitas é de fundamental importância na realização do estudo histológico da doença e
correlação com a classificação de Gleason (WELCH et al., 2007). Tradicionalmente, um
PSA sérico de 4 ng/ml tem sido usado como o corte para a realização da biópsia da
próstata; no entanto, com o decorrer do tempo, o valor de corte para biópsia diminuiu
para 2,5 ng/ml, o que causou um aumento do número de biópsias resultando em
morbidade adicional por incluir infecção, hematúria, hematospermia, dor, disfunção
erétil, infecções do trato urinário, maior detecção de câncer clinicamente insignificante e
ansiedade (MERRICK et al., 2020). No entanto, os níveis de PSA aumentam com o
avançar da idade e com aumento do volume prostático, mesmo na ausência de
malignidade. Para homens na faixa dos 40 anos, 0 a 2,5 ng/mL; dos 50 anos, 0 a 4,0
ng/mL, faixa dos 60 anos, 0 a 4,5 ng/mL e para homens na faixa dos 70 anos, 0 a 5,5
ng/mL (ARMY et al., 1996; DAS et al., 2019; WELCH; SCHWARTZ; WOLOSHIN,
2005).
O sistema de classificação Gleason baseia-se inteiramente no padrão histológico
do arranjo celular no tecido prostático corados com hematoxilina e eosina com
magnificação baixa (x10-40) pela extensão da diferenciação glandular e pelo padrão de
crescimento do tumor no estroma prostático (EPSTEIN, 2010; HUMPHREY, 2004,

14

2017). No sistema Gleason, os padrões histológicos são categorizados em cinco padrões
de grau básico pela extensão da diferenciação glandular e pelo padrão de crescimento do
tumor no estroma prostático (figura 3). Estes cinco padrões de grau básico são usados
para gerar uma pontuação histológica, que pode variar de 2 a 10, adicionando os padrões
de grau primário e o padrão de grau secundário. O padrão primário é o que é predominante
na área em inspeção visual simples. O padrão secundário é o segundo padrão mais
comum. Esses dois padrões são somados par obter o escore de Gleason. Se apenas um
grau estiver presente na amostra de tecido, então esse grau é multiplicado por dois para
se obter o escore (HUMPHREY, 2017; ICZKOWSKI; VAN LEENDERS; VAN DER
KWAST, 2021).
Atualmente a escala da ISUP (International Society of Urological Pathology), A
escala ISUP varia de 1 a 5. Os tumores ISUP 1 (escore de Gleason 6 – 3+3) são tumores
de crescimento bastante lento, e muitas vezes não requerem nenhum tratamento, somente
a observação. Os tumores ISUP 2(escore de Gleason 7- 3+4) e 3 escore de Gleason 7 –
4+3) têm crescimento intermediário, ao passo que os tumores ISUP 4 (escore de Gleason
8 – 4+4) e 5 (escore de Gleason 9 ou 10) são de crescimento e progressão mais rápidas e
com maior possibilidade de doença avançada (MONTIRONI et al., 2016).

Figura 3 – Comparação entre as escalar de Gleason e escala de Gleason modificada. Observa a presença
de glandular cribformes estão presentes nos padrões 4 e 5. in EPSTEIN, 2010

15

1.1.4. Estadiamento clínico

A graduação histológica do adenocarcinoma da próstata, incluindo o uso dos graus
ISUP, é um dos indicadores de prognóstico mais relevantes para câncer de próstata
clinicamente localizado, e é um dos fatores mais críticos na determinação do manejo
desses pacientes. Na prática clínica, quando a doença é suspeita, a biópsia é planejada e
se confirmada a suspeita clínica, a neoplasia é classificada em baixo, intermediário ou
alto risco de recidiva após tratamento radical (método cirúrgico ou radioterapia externa),
considerando o nível sérico de PSA, o padrão histológico e o estágio clínico TNM de
acordo com a classificação de risco D'Amico (TAFURI et al., 2020).
O sistema TNM, preconizado pela União Internacional para o Controle do Câncer
(UICC), de Classificação dos Tumores Malignos. Baseia-se no comprometimento local,
levando em conta as características do tumor primário (T), as cadeias de drenagem
linfática do órgão em que o tumor se localiza (N), e a presença ou ausência de metástases
a distância (M). Estes parâmetros recebem graduações, geralmente de T0 a T4, de N0 a
N3 e de M0 a M1, respectivamente. No câncer de próstata esse sistema é baseado nas
condições clínicas, exame digito prostático , biópsia da próstata e quaisquer exames de
imagem realizados conforme representado no quadro abaixo (quadro 1) (HUMPHREY,
2004; ICZKOWSKI; VAN LEENDERS; VAN DER KWAST, 2021; MOTTET N;
CORNFORD P; VAN DEN BERGH RCN, 2021).
Com o estadiamento e a localização precisa do câncer de próstata, as terapias
minimamente invasivas podem fornecer resultados oncológicos precisos e com
comorbidades. As opções de tratamento para pacientes com câncer de próstata incluem
prostatectomia (para doença T1 e T2 confinada ao órgão) e ablação hormonal e
radioterapia (para doença T3 e T4 extraprostática avançada). As opções de terapia local
e minimamente invasiva para câncer de próstata confinado ao órgão incluem crioablação,
ablação por radiofrequência, braquiterapia, terapia fotodinâmica e ultrassonografia
focalizada de alta intensidade (HIFU); no entanto, essas terapias requerem a localização
exata do câncer, por meio da ressonância magnética da pelve. Em certas situações, a
conduta expectante é uma escolha legítima para pacientes com doença de baixo volume,
baixo grau e baixo risco.(BONEKAMP et al., 2011).

16
Quadro 1: Classificação TNM Câncer de Próstata
T - Tumor primário (estágio baseado no exame retal digital [DRE] apenas)
TX

O tumor primário não pode ser avaliado

T0

Sem evidência de tumor primário

T1

Tumor clinicamente inaparente que não é palpável

T2

T3

T4

T1a

Achado histológico incidental de tumor em 5% ou menos do tecido ressecado

T1b

Achado histológico incidental de tumor em mais de 5% do tecido ressecado

T1c

Tumor identificado por biópsia de agulha (por exemplo, devido ao elevado antígeno
específico da próstata [PSA])

Tumor que é palpável e confinado na próstata
T2a

O tumor envolve metade de um lóbulo ou menos

T2b

O tumor envolve mais da metade de um lóbulo, mas não os dois lóbulos

T2c

O tumor envolve ambos os lobos

O tumor se estende através da cápsula prostática
T3a

Extensão extracapsular (unilateral ou bilateral)

T3b

O tumor invade as vesículas seminais

O tumor está fixo ou invade estruturas adjacentes que não sejam as vesículas seminais: esfíncter
externo, reto, músculos elevadores e / ou parede pélvica

N - Linfonodos Regionais (pélvicos)
NX

Linfonodos regionais não podem ser avaliados

N0

Sem metástase de linfonodo regional

N1

Metástase de linfonodo regional

M - Metástase à distância
M0

Sem metástase distante

M1

Metástase distante
M1a Linfonodo (s) não regionais
M1b Osso (s)
M1c Outro (s) sitios (s)

Fonte: MOTTET N; CORNFORD P; VAN DEN BERGH RCN. EAU-ESTRO-ESURSIOG guide- lines on prostate cancer. European Association of
Urology 2021 (Update 2021)., 2021.

1.1.5. Invasão perineural, Metástase e células de schwann
A invasão perineural, é um processo complexo de invasão de células tumorais ao
longo dos nervos, é uma entidade patológica distinta que pode ser observada na ausência
de invasão linfática ou vascular. É um importante mecanismo para a propagação à
distância do câncer de próstata. As células tumorais migram e invadem ao longo de todos

17

os componentes estruturais dos nervos prostáticos (perineuro, epineuro e bainha
endoneuro). Clinicamente a invasão perineural é um indicador prognóstico independente
e significativo para a presença de extensão celular tumoral além da próstata.(AYALA et
al., 2004; LIEBIG et al., 2009; SROKA et al., 2010).
O câncer de próstata confinado ao órgão pode ser efetivamente controlado, a
doença metastática, originária da extensão extracapsular é inevitavelmente incurável. Um
determinante importante do comportamento tumoral é a capacidade de alcançar as
membranas basal e se espalhar além dos limites do órgão de origem. A neoplasia de
próstata tem a propriedade de invadir e crescer ao longo dos nervos prostáticos, dessa
forma o microambiente do espaço perineural, é utilizado para promover o crescimento
e propagação das células tumorais (ZAREBA et al., 2017)
A invasão perineural é relatada em 85% dos pacientes com câncer de próstata,
pelo menos 50% dos casos envolvendo extensão extracapsular ocorreram pela
disseminação do câncer dentro dos espaços perineurais, implicando que a motilidade e a
invasividade das células tumorais ao longo dos nervos não é um processo de células
tumorais autônomas, mas uma relação recíproca entre nervos e células tumorais (AYALA
et al., 2004; LIEBIG et al., 2009; SROKA et al., 2010; ZHANG et al., 2018).
A mortalidade em pacientes com câncer de próstata é geralmente atribuída à
propagação extracapsular, o que muitas vezes resulta em falha no tratamento e é associada
com prognóstico ruim e pode ser um fator para a recidiva bioquímica do câncer de
próstata. (ZHANG et al., 2018)
O fenômeno da carcinogênese é um processo complexo que ocorre através de
múltiplos eventos genéticos que alteram as funções normais dos oncogenes e dos genes
supressores de tumor. Dependendo das características do tumor primário, do estroma e da
capacidade intrínseca de células tumorais metastáticas a se adaptarem em um novo local,
as células malignas usam mecanismos distintos na proliferação, sobrevida e disseminação
(NAJI et al., 2019. DU; CHENG; SU, 2019).
Essas células frequentemente reativam a expressão de genes que são empregados
por

células

normais

durante

o

processo

de

embriogênese

(THOMAS;

RADHAKRISHNAN, 2019; LO; ZHANG, 2018; NOGUTI et al., 2012). Para deixar o
tumor primário e disseminar em órgãos distantes, as células metastáticas perdem a
habilidade de aderência às células adjacentes, potencializando a capacidade migratória e
invasiva. Esse mecanismo é acompanhado por várias modificações na expressão de

18

genes, como por exemplo, perda da expressão de receptores epiteliais e aumento da
expressão de marcadores mesenquimais, fenômeno também conhecido como transição
epitélio-mesenquimal (AIELLO et al., 2018; LARNE et al., 2015).
A matriz extracelular desempenha um papel crítico no microambiente tumoral.
Durante a formação tumoral, as células neoplásicas se ligam a moléculas presentes na
matriz extracelular, o que facilita a comunicação com outras células, tais como
neutrófilos, fibroblastos, macrófagos e linfócitos (MCCUBREY et al., 2007). A matriz
extracelular é especialmente importante na formação e invasão tumoral à medida que as
células respondem e se adaptam ao microambiente local. Isto envolve tanto a proliferação
desregulada de células tumorais como a modificação do ambiente imediato para favorecer
a sobrevivência celular, a angiogênese e o crescimento tumoral (KOGURE; KOSAKA;
OCHIYA, 2019).
Estudos têm demonstrado que as células de Schwann atuam em vários processos
durante a cancerização (FURLANA; ADAMEYKO, 2018; BUNIMOVICH et al., 2016).
As células neoplásicas parecem produzir fatores que mimetizam o processo de resposta
dos axônios periféricos à lesão. Dessa forma, as células de Schwann podem se
desdiferenciar, migrando para a região próxima às células neoplásicas e, estas sendo
carreadas para a região perineural, já nos estágios iniciais da carcinogênese (AIELLO et
al., 2018; LO; ZHANG, 2018; PASTUSHENKO et al., 2018).
As células de Schwann expressam metaloproteinases da matriz tipo 2 e 9 (MMP2
e MMP9), que são gelatinases fundamentais no processo de degradação da matriz, além
de expressarem moléculas de adesão celular neural 1 (NCAM1), indicando uma possível
direta contribuição na invasão tumoral (DEBORDE et al., 2016; GOKEY et al., 2012;
NAPOLI et al., 2012; WEBBER et al., 2011). Levando em consideração que células
imunes podem infiltrar um nicho tumoral e modular a invasão neoplásica, vale ressaltar
que diante do estímulo de lesão nervosa, as células de Schwann também recrutam
macrófagos (ROSS; PAWLINA, 2016; JESSEN; MIRSKY; LLOYD, 2015).
A invasão neoplásica é um evento que envolve ação de células presentes no
microambiente tumoral, que promovem a progressão tumoral através da biointeração com
as células neoplásicas circundantes (AZAM; PECOT, 2016; NAPOLI et al., 2012).
Quando se trata de uma invasão neoplásica num tecido nervoso, as células nervosas
constituem o microambiente tumoral inteiro (WANG et al., 2017). Células cancerosas e

19

células nervosas se misturam e, em alguns casos, há uma perda completa dos elementos
neurais (BOCKMAN; BÜCHLER; BEGER, 1994). No contexto de uma progressão
tumoral, apesar de vários tipos celulares nervosos poderem contribuir para sua evolução,
estudos recentes indicam que as células de Schwann estão profundamente associadas com
a interação das células cancerígenas nos nichos tumorais em que há presença de tecido
nervoso periférico (DEBORDE; WONG, 2017; BUNIMOVICH et al., 2016).

20

2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
•

Identificar marcadores moleculares associados às células de Schwann e amostras
de Câncer de Próstata.

2.2. Objetivos específicos
•

Analisar, através da bioinformática, a expressão diferencial de genes em
amostras de células de Schwann tratadas com fatores de crescimento produzidos
por células neoplásicas;

•

Comparar a expressão dos genes em células de Schwann e amostras de câncer de
próstata;

•

Identificar as vias moleculares dos genes com expressão diferenciadas;

•

Compreender o mecanismo pela qual as células de Schwann auxiliam na
proliferação, motilidade, apoptose e viabilidade da célula neoplásica.

21

3. METODOLOGIA
• Este trabalho foi descrito sob a forma de artigo científico, cuja metodologia e discussão
encontram-se descritas, em sua totalidade, no texto do artigo a ser submetido à
publicação em periódico indexado.
•

Perineural invasion on prostate cancer is associated with Schwann cells and circadian
rhythm-related genes disruption: a bioinformatic approach

•

Solicitação de pedido de patente de Painel genético no prognóstico e predição de
neoplasia de próstata. Conforme normas do INSTITUTO NACIONAL DA
PROPRIEDADE INDUSTRIAL

O artigo foi estruturado com base nas normas de publicação do periódico. Após a
apresentação dos dois produtos, seguir-se-ão as considerações finais, bem como as
referências relacionadas à dissertação em geral.

22

4. PRODUTOS

4.1. Produto 1

Perineural invasion on prostate cancer is associated with Schwann cells and circadian
rhythm-related genes disruption: a bioinformatic approach

Sérgio Lopes Silva1, Hellem Cristina dos Santos Lima1, Genilda Castro de Omena Neta1,
Rodger Marcel Lima Rocha1, Ana Kelly Fernandes Duarte1, Alexandre Wendell Araujo
Moura1, Carlos Alberto de Carvalho Fraga1*

1

Federal University of Alagoas, Campus Arapiraca. Av. Manoel Severino Barbosa, Bom Sucesso,

Arapiraca, AL 57309-005, Brazil.
*Corresponding author: Carlos Alberto de Carvalho Fraga. Federal University of Alagoas,
Campus Arapiraca, Av. Manoel Severino Barbosa, Bom Sucesso, Arapiraca, AL 57309-005,
Brazil Tel. +55 82 991931405; E-mail: carlos.fraga@arapiraca.ufal.br

23

Abstract
Studies

have

shown

that

Schwann

cells

participate

in

the

tumor

microenvironment, producing several factors that benefit cancer cells. During this
process, Schwann cells are dedifferentiated and help the process of cancer cellular
proliferation. These cells then migrate to the region close to the tumor tissue and assist
the development of the neoplastic cell. In this context, the aim of the present study was
to evaluate the influence of Schwann cells over prostate cancers. We investigated the
association between Schwann cells and prostate cancer often associated with perineural
invasion. Initially, we used the GEO DataSets platform from the GEO repository to
identify a database reporting gene expression in Schwann cells in a neoplastic context.
Briefly, the database contains the expression results from experiments in which two
factors produced by tumor cells were added into cell cultures. Comparisons were made
between samples from the first and third passages. We then used these data to perform
differential gene expression analysis and crossed data from upregulated genes with
differential expression data from negative and positive perineural invasion prostate
cancers. We observed that the “axon guidance” pathway was upregulated in negative
perineural invasion prostate cancers. Meanwhile, upregulated mRNAs activate the “axon
guidance” and, together with ROBO1 and MPZ upregulation, inhibits perineural invasion
pathways. Both genes are also associated with Schwann cells migration inhibition. PER3,
NR3C1, PPARGC1A, TIMP3, ID2, PDE6B and CAVIN1 were upregulated in negative
perineural tumors, while SLC25A10 was upregulated. We also observed upregulated
genes in positive perineural invasion: PPARGC1A, TIMP3, S100A8, ID2, DEFB1, AQP3,
ASS1, PDE6B, NEFH and CAVIN1. AQP3 and NEFH were upregulated only in positive
perineural invasion tumors and PER3 and NR3C1 were upregulated only in negative
perineural invasion samples. We believe that Circadian rhythm and/or melatonin
disruption could be associated with Schwann cells dedifferentiation; consequently,
Schwann cells produce different factors that will participate in various processes of tumor
progression. These processes may also be involved in tumor invasion into the perineural
tissue in prostate cancer.

Keywords: bioinformatic; prostate adenocarcinoma; clock-related genes; Schwann

24

Introduction
The phenomenon of carcinogenesis is a complex process that occurs through
multiple genetic and epigenetic events altering the normal functions of oncogenes and
tumor suppressor genes [1]⁠. Such changes may result in an increased production of
growth factors or transcription factors, or an increased number of cell surface receptors
and intracellular flags [2]⁠. The loss of tumor suppressor activity leads to a cellular
phenotype capable of increasing cell proliferation and loss of cell adhesion, enabling such
mutated cells to infiltrate local tissues and to spread to distant sites. Metastasis is the cause
of 90% of cancer deaths and results in a diverse set of clinical manifestations [3]⁠.
Metastases occur when malignant neoplastic cells leave the primary site and travel via
blood and lymph vessels to new sites in the body where they disseminate new colonies.
Cancer cells then employ various strategies to aid adaptation and subsequent expansion
and progression in new sites. Formation and progression of cancer is a multisystemic
process, involving the immune system, vascularization, and dissemination [4]⁠. Metastatic
training is characterized by tumor growth, invasion of the basement membrane into
submucosal tissues, vascular and lymphatic formation, perineural and systemic tissue
invasion, and subsequent progression [5,6]⁠.
The extracellular matrix plays a critical role in tumor microenvironment. During
tumor formation, neoplastic cells bind to molecules present in the extracellular matrix,
which facilitates communication with other cells, such as neutrophils, fibroblasts,
macrophages, lymphocytes, and peripheral nervous system cells [7–9]⁠. The extracellular
matrix is especially important in tumor formation and invasion as cells respond and adapt
to the local microenvironment. This involves both the unregulated proliferation of tumor
cells and the modification of the immediate environment to favor cell survival,
angiogenesis, and tumor growth. Factors that can degrade the extracellular matrix also
facilitate tumor formation and invasion [10]⁠. For example, matrix metalloproteinases
(MMPs) have been associated with the degradation of basement membranes and
extracellular matrix, facilitating the invasion and metastasis of tumor cells, as well as
promoting cell proliferation, metastasis, and angiogenesis [8,11,12]⁠. In addition to the
degradation of the matrix, another important aspect in the formation and invasion of the
tumor is the process called epithelial-mesenchymal transition. The epithelialmesenchymal transition allows the tumors’ epithelial cells to produce factors generally
found in the extracellular matrix [13]⁠.

25

Studies have shown that circadian entertainment disruption is associated with Schwann
cells dedifferentiation [14,15]⁠. We suppose that clock genes deregulation [16]⁠ and could
participate in the tumor microenvironment together with Schwann cells [17]⁠, controlling
several factors that benefit cancer cells. During this process, Schwann cells are
dedifferentiated and help the process of cancer cellular proliferation [10,18,19]⁠. These
cells then migrate to the region close to the tumor tissue and assist the development of the
neoplastic cell [18]⁠. In this context, the aim of the present study was to evaluate the
perineural invasion in prostate cancers, associating with Schwann cells-related genes.

26

Methods
Gene list collection
We performed gene list collection by using Entrez Gene from NCBI
(www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) and GeneCards (https://www.genecards.org/), which
were used as the identifiers for perineural invasion-related genes. The gene list and
downregulated/ upregulated DEGs of the gene expression profiles were combined and
identified

with

a

Venn

Diagram

2.1.0

(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html) [15,20]⁠.

RNA-seq and clinical information data from The Cancer Genome Atlas (TCGA)
We

used

TCGAbiolinks,

an

R/Bioconductor

(http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/TCGAbiolinks.html)

software
and

the

interphase TCGAbiolinksGUI to download genomic and clinical data of both normal
and solid tumor tissues for two different types of cancer from TCGA. Selected cancer
type was Prostate Adenorcarcinoma (PRAD). We retrieved level data for raw count
mRNA and miRNA expression (Illumina HiSeq 2000). Co-expressed upregulated and
downregulated DEGs from the gene expression profiles were combined and identified
with a Venn Diagram 2.1.0 (http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html). An adj.
P < 0.05 and a logFC ≥ 1 were set as the cut-off criteria [21,22]⁠.
Collection and inclusion criteria of studies

We previously searched the GEO database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)
for publicly available gene expression profiling studies associating Schwann cells and
cancer. After a systematic review, only one gene expression profiles (GSE4030) was
downloaded from the GEO database. GEO2R was applied to compare gene expression
profiles in passage 1 and passage 3 human Schwann cells exposed to the growth factors
heregulin and forskolin. Because both groups in this comparison have been exposed to
mitogens, differences in gene expression profiles will be interpreted as indicative of
changes caused by prolonged versus short term exposure to mitogens. GEO2R
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/) is an interactive web tool for comparing two
groups of data that can analyze any GEO series. The adjusted p-values using Benjamini
and Hochberg false discovery rate method by default were applied to correct the

27

occurrence of false positive results. An adj. P < 0.05 and a logFC ≥ 1 were set as the cutoff criteria [23]⁠.
The Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) is an integrated
database resource for biological interpretation of genome sequences and other highthroughput data . KEGG analyses were available at the DAVID database
(https://david.ncifcrf.gov/), a data resource composed of an integrated biology knowledge
base and analysis tools to extract meaningful biological information from large quantities
of genes and protein collections. A p-value < 0.05 was set as the cut-off criterion [24]⁠.
Prostate cancer expression analyses
Several other web resources were used as source of information while some more
were used as analysis tools for prostate cancer expression studies: Immunohistochemistry
image-based protein data for both normal and cancer samples are available at the Human
Protein Atlas (https://www.proteinatlas.org/). NA methylation analyses were performed
using MEXPRESS dataset (https://mexpress.be/?ref=labworm). The cancer dataset,
consisting of DNA methylation data (Illumina Infinium Human Methylation 450 K Bead
array, Illumina, USA) and the β value, was considered as significantly hypermethylated
only if the value was found in more than 5% of the tumors. Copy number alteration
analysis was performed using the cBio Cancer Genomics Portal (http://cbioportal.org).
Survival analysis of the TCGA data was performed using the Survival module of the
Tumor Immune Estimation Resource (TIMER). Kaplan–Meier plots were drawn using
TIMER to explore the association between clinical outcome and gene expression, and to
visualize survival differences [25]⁠.

28

Results
Identification of differentially expressed genes (DEGs), gene ontology enrichment,
and functional classification
We obtained gene expression data belonging to specimens across prostate
adenocarcinoma from TCGA; these data were preprocessed using standard methods. We
performed a differentially expressed gene analysis in perineural invasion positive and
negative patients. According to DAVID analysis, Cell adhesion molecules (CAMs),
Pathways in cancer, Melanogenesis, Gap junction, Circadian entrainment, Fc gamma Rmediated phagocytosis, Gastric acid secretion, Axon guidance, Histidine metabolism,
Viral myocarditis, Serotonergic synapse, Small cell lung cancer, Long-term depression,
Glutamatergic synapse and Leukocyte transendothelial migration were upregulated
pathways only in perineural invasion negative tumors. Chemical carcinogenesis, Calcium
signaling pathway, Oxytocin signaling pathway, TGF-beta signaling pathway,
Tryptophan metabolism, Amoebiasis and Cardiac muscle contraction migration were
upregulated only in perineural invasion positive tumors (Supplementary Tables 1-4).
We previously selected dataset from the GEO database containing gene
expression profile of both early and late passage human Schwann cells exposed to cancer
growth factors heregulin and forskolin. These expression profiles were used to identify
DEGs with the aid of the online tool GEO2R. GEO2R was applied to compare gene
expression profiles in passage 1 and passage 3 human Schwann cells exposed to the
growth factors heregulin and forskolin. Because both groups in this comparison have been
exposed to mitogens, differences in gene expression profiles will be interpreted as
indicative of changes caused by prolonged versus short term exposure to
mitogens.Upregulated

DEG

enrichment

included

Neuroactive

ligand-receptor

interaction, Maturity onset diabetes of the young and Tyrosine metabolism, while
Pathways in cancer, Focal adhesion, Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy
(ARVC), Adherens junction, Basal cell carcinoma, p53 signaling pathway, Colorectal
cancer, Progesterone-mediated oocyte maturation, Oocyte meiosis, Hedgehog signaling
pathway, ECM-receptor interaction, Melanogenesis, Calcium signaling pathway, Dilated
cardiomyopathy, Cell cycle and Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) were enriched for
downregulated DEGs.
Overview of the cancer transcriptomic analysis

29

We conducted a systematic and integrative analysis to explore cancer typespecific and Schwann cell specific DEGs, to construct a cancer network. We first
determined DEGs by comparing gene expression levels between tumor and normal
samples. A Venn diagram was then constructed to visualize the overlap between DEG
genes, both upregulated and downregulated, from both cancer and Schwann cells. Among
upregulated genes from negative and positive perineural invasion samples, we identified
166 and 142 co-expressed DEGs with Schwann cells, respectively.
We also performed a KEGG analysis to investigate pathways with major
expression changes in schwann cell lines and negative/positive perineural invasion
tumors, based on previously identified upregulated DEGs. The analysis revealed that
MicroRNAs in cancer, Complement and coagulation cascades, Hippo signaling pathway
and Transcriptional misregulation in cancer were actived pathways only in intersected
Schwann cells and negative perineural samples commom DEGs, while regulation of actin
cytoskeleton was actived only in upregulated intersected Schwann cells and positive
perineural samples commom DEGs (Supplementary Table 5-6).
Hallmarks of cancer analysis
In order to understand the mechanism by which Schwann cells aid in neoplastic
development, we analyzed the behavior of genes associated with cell differentiation
processes (GATA3, CDH1, and CDH2), apoptosis (CASP3, CASP9, BAX, and BCL2),
motility (CXCR2, CXCL5, MMP9, and CCL12), and cell proliferation (MKI67). In
perineural negative tumors, GATA3, BCL2 and CXCR2 were upregulated, while GATA3
was upregulated, and MMP9 was downregulated in positive perineural invasion samples
(Figure 1 A-B).
Analysis of genes involved in dedifferentiation of Schwann cells
Schwann cells produce cell differentiation maintenance proteins (SOX10, S100,
EGR2, MBP, ROBO1, ROBO2, SLIT2 and MPZ) that, after nerve damage, diminish their
expression, provoking cellular dedifferentiation. Immediately after injury, the cell body
initiates a series of metabolic responses, cytoplasmic reorganization and specific changes
in gene expression (upregulation of SOX10, GAP43, S100, NCAM1, NGFR1, and GFAP),
known as neuronal reaction [18,26,27]⁠. We observed increased expression of NCAM1
and NGFR genes in both negative and positive perineural invasion cancers, whereas

30

ROBO1 and MPZ was upregulated only in negative perineural tumors (Figure 1 A-B).
Analysis of clock-related genes
Since circadian entertainment is an upregulated pathway in positive perineural
prostate tumors, we associated DEGs to clock-related gene list. PER3, NR3C1,
PPARGC1A, TIMP3, ID2, PDE6B, SLC25A10 and CAVIN1 were upregulated in negative
perineural tumors. We also observed upregulated genes in positive perineural invasion:
PPARGC1A, TIMP3, S100A8, ID2, DEFB1, AQP3, ASS1, PDE6B, NEFH and CAVIN1.
AQP3 and NEFH were upregulated only in positive perineural invasion tumors and PER3
and NR3C1 were upregulated only in negative perineural invasion samples (Figure 1 CD). The DEG analyses are supported by immunohistochemistry analysis (Figure 2).
Methylation and copy number alteration
Methylation analysis of the GATA3, BCL2, CXCR2, MMP9, NCAM1, NGFR,
ROBO1, AQP3, NEFH and PER3 genes from tumor samples demonstrated that all of
them were methylated in their promoter regions unlike those from normal tissues (data
not shown). However, there was a positive correlation between methylation and MPZ and
NR3C1 gene expression (Figures 3-4, respectively). Copy number alteration data
demonstrated that CDH1, CDH2, GFAP, PERP, and ROBO2 had a higher mRNA
expression than normal tissues; increased expression was associated with gain or
amplification alterations in PRAD samples (Figure 5).

31

Figure 1-Representative immunohistochemical staining characteristics of ARNTL2 expressions in
normal and cancer patients. Data are extracted from The Human Protein Atlas
(https://www.proteinatlas.org/).

32

Figure 2- Representative immunohistochemical staining characteristics of GATA3,
BCL2, CXCR2, MMP9, NCAM1, NGFR, ROBO1, MPZ, AQP3, NEFH, PER3 and NR3C1
expressions in normal and cancer patients. Data are extracted from The Human Protein
Atlas (https://www.proteinatlas.org/)

33

Figure 3-Methylation analysis of MPZ gene in prostate adenocarcinoma. The
highlighted probes are promoter gene region.

34

Figure 4- Methylation analysis of NR3C1 gene in prostate. The highlighted probes are promoter gene region.

35

Figure 5- Copy number alteration and mRNA expression analysis of GATA3 (A), BCL2
(B), CXCR2 (C), MMP9 (D), NCAM1 (E), NGFR (F), ROBO1 (G), MPZ (H), AQP3 (I),
NEFH (J), PER3 (K) and NR3C1 (L) genes in prostate adenocarcinoma.

36

Correlation and Prognostic analyses
In order to analyze the pathway by which Schwann cells induce neoplastic and
their own cell proliferation and migration, we evaluated the expression of AKT
(PRAS40_pT246, AKT_pT308 and AKT_pS473) and MAPK (MAPK_pT202Y204)
proteins. We observed a positive correlation between AKT and MAPK protein
phosphorylation (data not shown). TIMER gene module analysis was performed to select
and visualize the correlation of gene expression levels. We observed correlation between
ROBO1 and MPZ, and NCAM1 and NGFR levels with AQP3, NEFH, PER3 and NR3C1
gene expressions. We observed a positive correlation between all gene expression levels
analysis (Supplementary Figure 1-16). Survival analyses showed that Chemical
carcinogenesis, Calcium signaling, Oxytocin signaling, Circadian entrainment, Fc
gamma R-mediated phagocytosis, Gastric acid secretion and Axon guidance-related
genes, GATA3, BCL2, CXCR2, MMP9, NCAM1, NGFR, ROBO1, MPZ, AQP3, NEFH,
PER3 and NR3C1 were not associated with tumor outcomes (Supplementary Figure 1728).

37

Discussion
Cells surrounding a tumor form a molecular microenvironment known as stroma.
Stroma formation is influenced by tumor cells and, in turn, it influences tumor growth,
migration, and invasion [28–31]⁠. Depending on the characteristics of the primary tumor,
the stroma, and the intrinsic ability of metastatic tumor cells to adapt to a new location,
malignant cells use distinct mechanisms for proliferation, survival, and dissemination.
These cells often reactivate the expression of genes employed during embryogenesis [30]⁠.
In order to leave the primary tumor and disseminate to distant organs, metastatic cells
lose the ability to adhere to adjacent cells, enhancing their migratory and invasive
capacity. This mechanism is accompanied by several modifications in the expression of
genes, such as loss of epithelial receptor expression and increased expression of
mesenchymal markers, a phenomenon also known as epithelial-mesenchymal transition
[32]⁠.
We investigated the association between clock-related genes, Schwann cells and
prostate cancer with perineural invasion. Initially, we used the GEO DataSets platform
from the GEO repository to identify a database reporting gene expression in Schwann
cells in a neoplastic context [23]⁠. Briefly, the database contains the expression results
from experiments in which two factors produced by tumor cells were added into cell
cultures. Comparisons were made between samples from the first and third passages. We
then used these data to perform differential gene expression analysis and crossed data
from upregulated genes with differential expression data from negative and positive
perineural invasion prostate cancers. After identifying the genes in common, we ran
several analysis tools to identify molecular pathways associated to these genes.
Interestingly, we noted that the “axon guidance” pathway was active in negative
perineural invasion prostate samples. Studies have demonstrated the association between
axon guidance in the control of Schwann cell differentiation as well as in neoplastic cell
proliferation. Besides, MPZ gene is associated with differentiated Schwann cells
maintenance and was observed to be upregulated in negative perineural invasion samples.
In these context, it has also been demonstrated that axon guidance pathway is
inactived during Wallerian degeneration of peripheral nerves. Together with
macrophages, Schwann cells remove axon and myelin debris, and clear a path for
subsequent axonal regrowth and nerve regeneration [26]⁠. Tumor cells benefit from nerve

38

regeneration machinery to promote cell proliferation, migration, and invasion. It has been
reported that Schwann cells are induced to migrate to the region close to the tumor at the
beginning of the carcinogenic process. It was also suggested that Schwann cells promote
neoplastic invasion by direct contact with cancer cells, since paracrine signaling and
matrix remodeling are not yet sufficient to induce the migration process . Cell-cell contact
between Schwann cells and tumor tissue is necessary to potentiate the ability of neoplastic
cells to penetrate into the underlying tissue [9,33,34]⁠. After contact, the degradation of
the extracellular matrix by Schwann cells provokes the formation of tunnels or bands
coated with laminin, due to Schwann cells’ capacity to express matrix metalloproteins,
especially MMP2 and MMP9. The mechanism of extracellular matrix degradation that
promotes neoplastic migration also depends on the production of NCAM1 and Ncadherin (CDH2) by Schwann cells [31]⁠.
In the present study, we analyzed the expression of genes associated with the
hallmark of cancer. The importance of analyzing these genes derives from the hypothesis
that there may be a correlation between the presence of Schwann cells and the
aggressiveness of the neoplastic cell. Decreased E-cadherin protein expression after
contact of Schwann cells with the tumor resembles the mechanism followed by cells
during axonal repair process. The loss of E-cadherin during the epithelial-mesenchymal
transition in cancer is associated with a positive regulation of NCAM1 and CDH2 [31,35–
37]⁠. When E-cadherin is suppressed, NCAM1 and CDH2 are upregulated; they associate
with the p59fyn protein, whose subsequent activation leads to inhibition of focal adhesion
and an increase in cell migration. A study using oncogenic K-RAS pancreatic cancer cell
lines identified increased levels of polysialylated NCAM1 expression, which interacts
with E-cadherin to create steric hindrance of homophilic binding and decrease cell
adhesion . In our study, we observed upregulation of NCAM1 in both negative and
positive perineural invasion cancers [38,39]⁠.
Differentiation of myelinating Schwann cells may undergo interference from
inhibitory pathways that negatively control the expression of genes responsible for myelin
sheath formation. NOTCH1 and JUN stand out among the negative regulators of the
myelination program, in the same way as SOX-2 and PAX-3 [9,18,34]⁠. The myelinating
phenotype also involves the inactivation of a number of genes linked to the production of
immature Schwann cell markers. Some transcription factors are responsible for ensuring
proper maturation in Schwann cells. SOX-10 acts synergistically with a second factor,

39

OCT-6, resulting in the expression of KROX-20. In turn, KROX-20 is a key inducer of
expression of myelin genes, such as MBP, MPZ and PRX proteins. The maintenance of
the myelinating phenotype therefore requires the continuous expression of KROX-20 and
SOX-10, considering that inactivation of both proteins results in dedifferentiation of
Schwann cells [17,18,40,41]⁠.
Previous studies have shown that Schwann cells induce cellular aggressiveness in
prostate cancer. During dedifferentiation, Schwann cells express proteins initially lost
during the myelination process. Among these proteins are GAP43, NCAM1, P75ntr
(NGFR), GFAP and SOX-2 [10,19]⁠. Data from our study showed that Ngfr1 gene
expression is increased in both negative and positive perineural invasion prostate cancers.
It is likely that Schwann cells in these tissues are dedifferentiated, aiding tumors in their
mechanisms of cell proliferation, migration, and tissue invasion.
During the process of carcinogenesis, there is an inactivation of the SLIT2,
ROBO1 and Robo2 genes, being therefore considered as tumor suppressor genes [42,43]⁠.
Both genes are extremely important during the process of nerve formation and repair.
Both SLIT2, ROBO1 and ROBO2 proteins have been reported to inhibit migration of
Schwann cells [44–46]⁠. In the present study, we observed that ROBO1 mRNAs are
increased in perineural invasion negative prostate cancer samples when compared to
normal tissue.
Since circadian entertainment is an upregulated pathway in positive perineural
prostate tumors, we associated DEGs to clock-related gene list. PER3, NR3C1,
PPARGC1A, TIMP3, ID2, PDE6B, SLC25A10 and CAVIN1 were upregulated in negative
perineural tumors. We also observed upregulated genes in positive perineural invasion:
PPARGC1A, TIMP3, S100A8, ID2, DEFB1, AQP3, ASS1, PDE6B, NEFH and CAVIN1.
AQP3 and NEFH (oncogenic clock-related genes) were upregulated only in positive
perineural invasion tumors and PER3, SLC25A10 and NR3C1 (tumor suppressor clockrelated genes) were upregulated only in negative perineural invasion samples. Previous
studies has observed circadian rhythm [47]⁠ and melatonin [48]⁠ are associated with nerve
regeneration. Previous studies has observed that melatonin, an important mediator of
circadian rhythm, is involved in the dedifferentiation and increase proliferation of
Schwann cells. Although, the mechanism is not fully understood, it has been
demonstrated that Ras/Raf/ERK, MAPK and GDNF/PKC pathways can be activated

40

through MIT1/MIT2 receptors. Whereas the melatonin increases Schwann cell
proliferation, the interaction of these cells with cancer cells will contribute to perineural
invasion and worse prognosis for prostate cancer 36. We also observed correlation
between AKT and MAPK phosphorylation in PRAD cancer. Based on these findings, we
believe that Circadian rhythm and/or melatonin disruption could be associated with
Schwann cells dedifferentiation, leading to a perineural invasion in prostate cancer.
In summary, we observed that the “axon guidance” pathway was upregulated in
negative perineural invasion prostate cancers. Meanwhile, upregulated mRNAs activate
the “axon guidance” and, together with ROBO1 and MPZ upregulation, inhibits
perineural invasion pathways. Both genes are also associated with Schwann cells
migration inhibition. Besides, clock-related genes were deregulated in perineural invasion
patients with prostate cancer. We believe that Schwann cells’ dedifferentiation and
proliferation are induced by circadian entertainment disruption; consequently, Schwann
cells produce different factors that will participate in several processes of tumor
progression. These processes may also be involved in tumor invasion into the perineural
tissue in prostate cancer.

Competing interests
The authors declare that they have no competing interests.

Ethics approval and consent to participate
Not applicable.

41

Supplementary Figure 1- Correlation between ROBO1 and AQP3 in Prostate
adenocarcinoma (PRAD). Data are extracted from TIMER web server.

42

Supplementary Figure 2- Correlation between ROBO1 and NGFR in Prostate
adenocarcinoma (PRAD). Data are extracted from TIMER web server.

43

Supplementary Figure 3- Correlation between ROBO1 and NR3C1 in Prostate
adenocarcinoma (PRAD). Data are extracted from TIMER web server.

44

Supplementary Figure 4- Correlation between ROBO1 and PER3 in Prostate
adenocarcinoma (PRAD). Data are extracted from TIMER web server.

45

Supplementary Figure 5- Correlation between MPZ and AQP3 in Prostate adenocarcinoma
(PRAD). Data are extracted from TIMER web server.

46

Supplementary Figure 6- Correlation between MPZ and NGFR in Prostate
adenocarcinoma (PRAD). Data are extracted from TIMER web server.

47

Supplementary Figure 7- Correlation between MPZ and NR3C1 in Prostate
adenocarcinoma (PRAD). Data are extracted from TIMER web server.

48

Supplementary Figure 8- Correlation between MPZ and PER3 in Prostate
adenocarcinoma (PRAD). Data are extracted from TIMER web server.

49

Supplementary Figure 9- Correlation between NCAM1 and AQP3 in Prostate
adenocarcinoma (PRAD). Data are extracted from TIMER web server.

50

Supplementary Figure 10 - Correlation between NCAM1 and NGFR in Prostate
adenocarcinoma (PRAD). Data are extracted from TIMER web server.

51

Supplementary Figure 11- Correlation between NCAM1 and NR3C1 in Prostate
adenocarcinoma (PRAD). Data are extracted from TIMER web server.

52

Supplementary Figure 12- Correlation between NCAM1 and PER3 in Prostate
adenocarcinoma (PRAD). Data are extracted from TIMER web server.

53

Supplementary Figure 13- Correlation between NGFR and AQP3 in Prostate
adenocarcinoma (PRAD). Data are extracted from TIMER web server.

54

Supplementary Figure 14- Correlation between NGFR and NGFR in Prostate
adenocarcinoma (PRAD). Data are extracted from TIMER web server.

55

Supplementary Figure 15- Correlation between NGFR and NR3C1 in Prostate
adenocarcinoma (PRAD). Data are extracted from TIMER web server.

56

Supplementary Figure 16- Correlation between NGFR and PER3 in Prostate
adenocarcinoma (PRAD). Data are extracted from TIMER web server

57

Supplementary Figure 17-TIMER Survival analyses in Prostate adenocarcinoma for AQP3
gene

58

Supplementary Figure 18-TIMER Survival analyses in Prostate adenocarcinoma for
BCL2 gene.

59

Supplementary Figure 19 -TIMER Survival analyses in Prostate adenocarcinoma for
CXCR2 gene

60

Supplementary Figure 20-TIMER Survival analyses in Prostate adenocarcinoma for
GATA3 gene.

61

Supplementary Figure 21-TIMER Survival analyses in Prostate adenocarcinoma for
MMP9 gene.

62

Supplementary Figure 22-TIMER Survival analyses in Prostate adenocarcinoma for MPZ
gene

63

Supplementary Figure 23-TIMER Survival analyses in Prostate adenocarcinoma for
NCAM1 gene.

64

Supplementary Figure 24-TIMER Survival analyses in Prostate adenocarcinoma for
NEFH gene.

65

Supplementary Figure 25-TIMER Survival analyses in Prostate adenocarcinoma for
NGFR gene.

66

Supplementary Figure 26-TIMER Survival analyses in Prostate adenocarcinoma for
NGFR gene.

67

Supplementary Figure 27-TIMER Survival analyses in Prostate adenocarcinoma for
PER3 gene.

68

Supplementary Figure 28-TIMER Survival analyses in Prostate adenocarcinoma for
ROBO1 gene.

69

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74

75

4.2. Produto 2
870200161353

24/12/2020

10:35

29409161927414597

Pedido nacional de Invenção, Modelo de Utilidade, Certificado de
Adição de Invenção e entrada na fase nacional do PCT
Número do Processo: BR 10 2020 026684 5
Dados do Depositante (71)

Depositante 1 de 1
Nome ou Razão Social: UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS
Tipo de Pessoa: Pessoa Jurídica
CPF/CNPJ: 24464109000148
Nacionalidade: Brasileira
Qualificação Jurídica: Instituição de Ensino e Pesquisa
Endereço: Av. Lourival Melo Mota, s/n, Tabuleiro do Martins
Cidade: Maceió
Estado: AL
CEP: 57072-970
País: Brasil
Telefone: 82-3214-1064
Fax: 82-3214-1035
Email: nit@propep.ufal.br

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76

Dados do Pedido

Natureza Patente: 10 - Patente de Invenção (PI)
Título da Invenção ou Modelo de Painel genético no prognóstico e predição de neoplasia de
próstata
Utilidade (54):
Resumo: A invenção busca descrever um painel para o câncer de próstata que, a partir da
identificação de biomarcadores e a expressão gênica diferencialmente aumentada, se
correlacionam com sobrevida, diagnóstico, prognóstico, recidiva, progressão e possibilidade de
metástase da neoplasia. O painel utiliza para as análises dados de RNAseq do TCGA; expressão
diferencial pelo TCGAbiolinks no software R; identificação dos genes que impactavam
negativamente na sobrevida pelo TNMplot; por fim, na identificação de vias metabólicas no
NetworkAnalyst.
Figura a publicar: 1

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Petição 870200161353, de 24/12/2020, pág. 76/122

77

Dados do Inventor (72)
Inventor 1 de 18
Nome: PAULYANA FERNANDES BARBOSA
CPF: 06171905429
Nacionalidade: Brasileira
Qualificação Física: Professor do ensino superior
Endereço: Rua Elvira Barbosa Lopes, 600
Cidade: Arapiraca Estado: AL CEP:
País: BRASIL
Telefone: (82) 996 560041
Fax:
Email: paulyanafbarbosa@gmail.com
Inventor 2 de 18
Nome: ANA PAULA FERNANDES BARBOSA
CPF: 60467789487
Nacionalidade: Brasileira
Qualificação Física: Professor do ensino superior
Endereço: Rua Elvira Barbosa Lopes, 600
Cidade: Arapiraca
Estado: AL
CEP:
País: BRASIL
Telefone: (82) 999 851040 Fax:
Email: npdc@uol.com.br

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78

Inventor 3 de 18
Nome: Carlos Alberto de Carvalho Fraga
CPF: 07464340655
Nacionalidade: Brasileira
Qualificação Física: Professor do ensino superior
Endereço: Rua Amelia Nunes Correia, 1092, H11, condomínio Pedro
Tertuliano
Cidade: Arapiraca
Estado: AL
CEP: 57309-610
País: BRASIL
Telefone: (82) 991 931405
Fax:
Email: carlos.fraga@arapiraca.ufal.br

Inventor 4 de 18
Nome: KAROL FIREMAN DE FARIAS
CPF: 95960112434
Nacionalidade: Brasileira
Qualificação Física: Professor do ensino superior
Endereço: RUA JOSÉ NUNES DA SILVA, 424, SENADOR ARNON DE
MELO, CONDOMÍNIO ALTO JARDIM, QUADRA i, LOTE 10
Cidade: ARAPIRACA
Estado: AL
CEP: 57315-784
País: BRASIL
Telefone: (82) 996 206444

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79

Fax:
Email: karol.farias@arapiraca.ufal.br
Inventor 5 de 18
Nome: ROBERTA KAROLLINE DE SOUZA LIMA
CPF: 07925461489
Nacionalidade: Brasileira
Qualificação física: Outras ocupações não especificadas anteriormente
Endereço: Avenida Antônio Custódio Porto, 140, Centro, São Sebastião
Cidade: ARAPIRACA
Estado: AL
CEP: 57275-000
País: BRASIL
Telefone: (82) 991 101597
Fax:
Email: roberta.lima@famed.ufal.br
Inventor 6 de 18
Nome: BRUNA DEL VECHIO KOIKE
CPF: 27215337898
Nacionalidade: Brasileira
Qualificação Física: Outras ocupações não especificadas anteriormente
Endereço: Rua Miguel Santos 172, ap 201
Cidade:
Petrolina
Estado: PE
CEP:
País: BRASIL

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80

Telefone: (87) 210 16865
Fax:
Email: bruna.dvkoike@univasf.edu.br
Inventor 7 de 18
Nome: HELLEM CRISTINA DOS SANTOS LIMA
CPF: 08766624401
Nacionalidade: Brasileira
Qualificação Física: Outras ocupações não especificadas anteriormente
Endereço: LOT AROEIRAS, 19 - QD:07 - BOM SUCESSO
Cidade: ARAPIRACA
Estado: AL
CEP: 57275-000
País: BRASIL
Telefone: (82) 982 354622
Fax:
Email: hellem.lima@arapiraca.ufal.br
Inventor 8 de 18
Nome: NOAN ROCHA DE ALMEIDA
CPF: 15472464722
Nacionalidade: Brasileira
Qualificação Física: Outras ocupações não especificadas anteriormente
Endereço: Rua Quinze de Agosto, 15 - CENTRO
Cidade: ARAPIRACA
Estado: AL
CEP: 57300-540
País: BRASIL
Telefone: (21) 980 561200

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81

Fax:
Email: noan.almeida@arapiraca.ufal.br
Inventor 9 de 18
Nome: GIOVANNA BARROS ROLIM
CPF: 10487853431
Nacionalidade: Brasileira
Qualificação física: Outras ocupações não especificadas anteriormente
Endereço: Rua José Matheus do Nascimento, 123
Cidade: Arapiraca
Estado: AL
CEP: 57312-690
País: BRASIL
Telefone: (82) 999 580505
Fax:
Email: giovanna.rolim@famed.ufal.br
Inventor 10 de 18
Nome: LUCIANA XAVIER PEREIRA
CPF: 08934131608
Nacionalidade: Brasileira
Qualificação Física: Professor do ensino superior
Endereço: Rua Estelita de Macedo, 326, apto 801, bloco B
Cidade: Arapiraca
Estado: AL
CEP: 57312-105
País: BRASIL
Telefone: (37) 988 042328
Fax:

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82

Email: luciana.pereira@arapiraca.ufal.br
Inventor 11 de 18
Nome: MIGUEL FERREIRA LUSTOSA NETO
CPF:12043872494
Nacionalidade: Brasileira
Qualificação Física: Outras ocupações não especificadas anteriormente
Endereço: Rua Cícero Romão Batista, 169
Cidade: Arapiraca
Estado: AL
CEP: 57307-070
País: BRASIL
Telefone: (82) 998 254618
Fax:
Email: miguel.neto@arapiraca.ufal.br
Inventor 12 de 18
Nome: ÉRIKA DE FÁTIMA MACHADO SOARES
CPF: 11070942405
Nacionalidade: Brasileira
Qualificação Física: Outras ocupações não especificadas anteriormente
Endereço: Rua Maria Francisca da Silva, 172
Cidade: Santana do Ipanema
Estado: AL
CEP: 57500-000
País: BRASIL
Telefone: (82) 999 279005
Fax:
Email: erika.soares@arapiraca.ufal.br

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83

Inventor 13 de 18
Nome: TATIANA FARIAS DE OLIVEIRA
CPF: 07713613439
Nacionalidade: Brasileira
Qualificação Física: Outras ocupações não especificadas anteriormente
Endereço: Rua Dione Nunes Ferreira, 08
Cidade: Arapiraca
Estado: AL
CEP: 57303-260
País: BRASIL
Telefone: (82) 999 491827
Fax:
Email: tatiana.oliveira@arapiraca.ufal.br
Inventor 14 de 18
Nome: THAYSA KELLY BARBOSA VIEIRA TOMÉ
CPF: 01401304460
Nacionalidade: Brasileira
Qualificação Física: Professor do ensino superior
Endereço: Rua Jose Fernandes Lopes, numero 09, quadra A. Canafístula
Cidade: Arapiraca
Estado: AL
CEP: 57302-010
País: BRASIL
Telefone: (82) 996 10022
Fax:
Email: thaysa.vieira@arapiraca.ufal.br

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Petição 870200161353, de 24/12/2020, pág. 83/122

84

Inventor 15 de 18
Nome: WALLISON JUSTINO DA SILVA
CPF: 09226293406
Nacionalidade: Brasileira
Qualificação Física: Outras ocupações não especificadas anteriormente
Endereço: Rua Cícero Barbosa e Silva, 25
Cidade: Arapiraca
Estado: AL
CEP: 57308-110
País: BRASIL
Telefone: (82) 998 099929
Fax:
Email: wallison.silva@arapiraca.ufal.br
Inventor 16 de 18
Nome: GENILDA CASTRO DE OMENA NETA
CPF: 05928447493
Nacionalidade: Brasileira
Qualificação Física: Outras ocupações não especificadas anteriormente
Endereço: Rua Pedro Manoel Mendes, Nº58, Quadra-15, Conj. José
Maria de Melo
Cidade: Maceió
Estado: AL
CEP: 57081-125
País: BRASIL
Telefone: (82) 981 177321
Fax:
Email: genilda.castro@ifal.edu.br

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Petição 870200161353, de 24/12/2020, pág. 84/122

85

Inventor 17 de 18
Nome: RODGER MARCEL LIMA ROCHA
CPF: 03820611444
Nacionalidade: Brasileira
Qualificação Física: Outras ocupações não especificadas anteriormente
Endereço: Rua Monsenhor Cícero Teixeira de Vasconcelos, 250
Cidade: Maceió
Estado: AL
CEP: 57042-215
País: BRASIL
Telefone: (82) 999 355588
Fax:
Email: rodger.rocha@iqb.ufal.br

Inventor 18 de 18
Nome: LÍVIA ANDRESSA SILVA DO CARMO
CPF: 07408888462
Nacionalidade: Brasileira
Qualificação Física: Professor do ensino superior
Endereço: Rua Leonídio Cincinato, 59
Cidade: Murici
Estado: AL
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Acesso ao Patrimônio Genético
Declaração Negativa de Acesso - Declaro que o objeto do presente pedido de patente de
invenção não foi obtido em decorrência de acesso à amostra de componente do Patrimônio
Genético Brasileiro, o acesso foi realizado antes de 30 de junho de 2000, ou não se aplica.

Declaração de veracidade
Declaro, sob as penas da lei, que todas as informações acima prestadas são completas e
verdadeiras.

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “Painel genético no prognóstico e
predição de neoplasia de próstata”

[001] A presente invenção descreve um painel para prognóstico de câncer de próstata
que utiliza o perfil de expressão obtidos pelas análises de RNAseq, fornecendo
informações acerca da natureza desses tumores e estratifica os resultados da sobrevida
dos pacientes afetados pela doença.

PROBLEMA QUE A INVENÇÃO SE PROPÕE A RESOLVER
[002] O câncer de próstata é o câncer não cutâneo mais comum em homens em todo o
mundo, com uma estimativa de 1.600.000 casos e 366.000 mortes anualmente (Torre LA,
Bray F, Siegel RL, Ferlay J, Lortet-Tieulent J, Jemal A. Global cancer statistics, 2012.
CA Cancer J Clin. 2015 Mar;65(2):87–108). Suas taxas de incidência tendem a ser mais
altas em regiões mais desenvolvidas do mundo (por exemplo, América do Norte, Europa
Ocidental e do Norte e Austrália), em parte refletindo o acesso a cuidados médicos,
incluindo rastreamento e detecção precoce (Rebbeck TR. Prostate Cancer Genetics:
Variation by Race, Ethnicity, and Geography. Semin Radiat Oncol. 2017 Jan;27(1):3–
10).
[003] Quanto aos principais fatores de risco para câncer de próstata são idade e história
familiar, e homens negros têm um risco maior de incidência e morte em comparação com
homens de origem branca ou asiática (Merriel SWD, Funston G, Hamilton W. Prostate
Cancer in Primary Care. Adv Ther. 2018 Sep 10;35(9):1285–
94.).
[004] O câncer de próstata exibe a maior herdabilidade relatada de qualquer câncer
importante (Lichtenstein P, Holm N V., Verkasalo PK, Iliadou A, Kaprio J, Koskenvuo
M, et al. Environmental and Heritable Factors in the Causation of Cancer — Analyses of
Cohorts of Twins from Sweden, Denmark, and Finland. N Engl J Med. 2000 Jul
13;343(2):78–85). Vários estudos, particularmente estudos epidemiológicos, estudos de
gêmeos e estudos de associação do genoma em larga escala (GWASs), demonstraram
um componente genético para a etiologia do câncer de próstata (Eeles R, Goh C, Castro
E, Bancroft E, Guy M, Olama AA Al, et al. The genetic epidemiology 2/12

of prostate cancer and its clinical implications. Nat Rev Urol. 2014 Jan 3;11(1):18– 31.).
Especificamente, estudos epidemiológicos estabeleceram que uma história familiar de
câncer de próstata aumenta significativamente o risco (Wang G, Zhao D, Spring DJ,
DePinho RA. Genetics and biology of prostate cancer. Genes Dev. 2018 Sep 1;32(17–
18):1105–40); estudos com gêmeos indicaram que o câncer de próstata está entre os
cânceres mais hereditários (Lichtenstein P, Holm N V., Verkasalo PK, Iliadou A, Kaprio
J, Koskenvuo M, et al. Environmental and Heritable Factors in the Causation of Cancer
— Analyses of Cohorts of Twins from Sweden, Denmark, and Finland. N Engl J Med.
2000 Jul 13;343(2):78–85.).
[005] Catalogar os impulsionadores genéticos do câncer de próstata tem sido
fundamental para definir os subtipos de doenças e estratégias terapêuticas associadas
(Wang G, Zhao D, Spring DJ, DePinho RA. Genetics and biology of prostate cancer.
Genes Dev. 2018 Sep 1;32(17–18):1105–40). Espera-se que o desenvolvimento de
algoritmos orientados por inteligência artificial acelere o desenvolvimento de
biomarcadores precisos e algoritmos de gerenciamento para prever a sobrevida do
paciente, respostas ao tratamento, resistência aos medicamentos e doença residual
mínima (Wang G, Zhao D, Spring DJ, DePinho RA. Genetics and biology of prostate
cancer. Genes Dev. 2018 Sep 1;32(17–18):1105– 40).
[006] Sendo assim, por meio de avaliação de expressão gênica em dados disponíveis no
The Cancer Genome Atlas Progam (TCGA), UALCAN e TNMplot, a invenção propõe
a disponibilização de um painel genético que englobe dados de diagnóstico, prognóstico,
sobrevida e recidiva. Isso foi pensado pois ao longo do amadurecimento da patente, se
estendendo na pesquisa de dados e análises, percebeu-se que os bancos de dados atuais
como INIP, Latipat, Espacenet e Patentscope não apresentam um painel genético que
possa fazer associação entre dados de prognóstico, sobrevida e recidiva do câncer de
próstata.

ESTADO DA TÉCNICA
[007] Existem algumas patentes relacionadas a avaliação de marcadores moleculares no
câncer.
[008] A patente PI 0518741-9 A2, intitulada “USO DE UMA COMBINAÇÃO DE
UMA
DROGA DIRETAMENTE METABOLIZADA POR UGT1A1 OU UM SEU SAL
FARMACEUTICAMENTE ACEITÁVEL E ATAZANAVIR OU UM SEU SAL

FARMACEUTICAMENTE

ACEITÁVEL,

E,

COMBINAÇÃO

FARMACÊUTICA PARA
ADMINISTRAÇÃO ORAL A UM MAMÍFERO” e publicada em 02/12/2008, referese a um método para melhorar a farmacocinética de uma droga administrada oralmente,
que é diretamente metabolizado por UGT1A1, compreende administrar oralmente, a um
mamífero em necessidade de tratamento, a droga, uma combinação da droga ou um sal
farmaceuticamente aceitável do mesmo e atazanavir ou um sal farmaceuticamente
aceitável do mesmo.
[009] A patente BR 11 2018 076089 7 A2, intitulada “PROCESSO DE
PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-AMH E USOS DOS MESMOS” e
publicada em 26/03/2019, refere-se a um processo de preparação de anticorpos antiAMH de mamífero. A presente invenção também se refere aos anticorpos e fragmentos
de anticorpo e ao uso dos mesmos para avaliar o AMH, em particular em fertilidade.
[010] Nenhuma das patentes supracitadas possui semelhança com método proposto de
um painel genético para o prognóstico associado à sobrevida e recidiva. As patentes
relacionadas com prognóstico também apresentam formas diferentes da proposta nesta
invenção. Ademais, a maioria dos genes não apresentaram patentes relacionadas, e
aqueles que possuíam patentes não apresentavam a mesma finalidade de um painel
genético associado ao prognóstico dos pacientes. Dessa forma, o objetivo da presente
invenção é disponibilizar a identificação dos genes relacionados ao prognóstico do
Câncer de Próstata, no que diz respeito a sobrevida, recidiva e resistência a
quimioterápicos, sendo uma forma de orientação ao melhor tratamento.
[011] A presente invenção descreve o método baseado em painel genético para a
identificação de marcadores moleculares relacionados a predição do prognóstico do
desenvolvimento de Câncer de Próstata, com ênfase na sobrevida e estadiamento. O
método pode ser aplicado a pacientes susceptíveis e com histórico familiar, e outros casos
que se façam pertinentes.
[012] Na presente invenção, a avaliação da expressão gênica é realizada por dados
experimentais disponíveis no The Cancer Genome Atlas Program (TCGA). A grande
vantagem da invenção é a capacidade de esclarecer o risco individual de recidiva e
sobrevida dos pacientes. Os valores das expressões dos genes supracitados permitem
segregar os pacientes em grupos de alto e baixo risco para metástase e recidiva,
impactando no tempo de sobrevida dos mesmos. Esses marcadores são de extrema
importância para a prática clínica, já que permite estabelecer o prognóstico, fornecendo

informações importantes para as estratégias terapêuticas mais adequadas às
características moleculares individuais das neoplasias. O perfil de expressão dos painéis
genéticos são utilizados para a predição do curso do Câncer de Próstata, indicando o risco
aumentado de metástase dentre os pacientes com esse câncer. A abordagem terapêutica
a ser escolhida levará em consideração o perfil de expressão dos painéis e, como
resultados indiretos, redução no tempo e nos custos do tratamento.
[013] A presente invenção apresenta vantagens como: capacidade de segregar os
pacientes com alto risco de recidiva e metástase no do Câncer de Próstata, permitindo a
escolha correta do tratamento, o que acarretará na maior sobrevida e menor custo de
tratamento dos pacientes.

DESCRIÇÃO DA ABORDAGEM DO PROBLEMA TÉCNICO
[014] O sistema de classificação de Gleason, que foi originalmente definido por Donald
Gleason (Gleason e Mellinger 1974 ) com base nos padrões histológicos do
adenocarcinoma da próstata, foi refinado ao longo dos anos e é o sistema de classificação
mais amplamente usado para definir a agressividade do câncer de próstata (Wang G,
Zhao D, Spring DJ, DePinho RA. Genetics and biology of prostate cancer. Genes Dev.
2018 Sep 1;32(17–18):1105–40). Tal sistema estratifica os cânceres localizados em três
grupos: de baixo, intermediário e alto risco (Rodrigues G, Warde P, Pickles T, Crook J,
Brundage M, Souhami L, et al. Pre-treatment risk stratification of prostate cancer
patients: A critical review. Can Urol Assoc J. 2012 Apr 17;6(2):121–7). O tratamento do
câncer de próstata depende do grau, estágio e idade e varia de vigilância ativa a uma
combinação de cirurgia, quimioterapia, radiação e/ou terapia hormonal (Litwin MS, Tan
H-J. The Diagnosis and Treatment of Prostate Cancer. JAMA. 2017 Jun
27;317(24):2532).
[015] As patentes e métodos existentes não consideram, nas análises de predição,
diagnóstico e prognóstico em câncer de próstata e chances de recidiva dos pacientes. Há
a necessidade de classificar os pacientes com alto risco de recidiva e metástase. Estes
fatores permitirão a escolha do tratamento, o que impacta diretamente na sobrevida dos
pacientes, acarretando em um menor custo para a saúde pública.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[016] Tabela 1. Genes expressos entre grupos e genes individuais de cada grupo de
indivíduos com câncer de próstata
[017] Figura 1. Comparação de lâminas de imuno-histoquímica de tecido de próstata
normal e tecido de câncer de próstata
[018] Figura 2. Comparação de lâminas de imuno-histoquímica de tecido de próstata
normal e tecido de câncer de próstata
[019] Figura 3. Vias metabólicas relacionadas ao câncer de próstata
[020] Figura 4. - Análise de sobrevida no UALCAN do câncer de próstata para a
expressão do gene AMH.
[021] Figura 5. - Análise de sobrevida no UALCAN do câncer de próstata para a
expressão do gene CPLX1.
[022] Figura 6. - Análise de sobrevida no UALCAN do câncer de próstata para a
expressão do gene GAD1.
[023] Figura 7. - Análise de sobrevida no UALCAN do câncer de próstata para a
expressão do gene GPC2.
[024] Figura 8. - Análise de sobrevida no UALCAN do câncer de próstata para a
expressão do gene GPRIN.
[025] Figura 9. - Análise de sobrevida no UALCAN do câncer de próstata para a
expressão do gene LOC100272228.
[026] Figura 10. - Análise de sobrevida no UALCAN do câncer de próstata para a
expressão do gene MAPK8IP2.
[027] Figura 11. - Análise de sobrevida no UALCAN do câncer de próstata para a
expressão do gene PAQR6.
[028] Figura 12. - Análise de sobrevida no UALCAN do câncer de próstata para a
expressão do gene PATE1.
[029] Figura 13. - Análise de sobrevida no UALCAN do câncer de próstata para a
expressão do gene PCBP3.
[030] Figura 14. - Análise de sobrevida no UALCAN do câncer de próstata para a
expressão do gene PIGL.
[031] Figura 15. - Análise de sobrevida no UALCAN do câncer de próstata para a
expressão do gene PVT1.

[032] Figura 16. - Análise de sobrevida no UALCAN do câncer de próstata para a
expressão do gene RPL36A.
[033] Figura 17. - Análise de sobrevida no UALCAN do câncer de próstata para a
expressão do gene SGK494.
[034] Figura 18. - Análise de sobrevida no UALCAN do câncer de próstata para a
expressão do gene SLC25A27.
[035] Figura 19. - Análise de sobrevida no UALCAN do câncer de próstata para a
expressão do gene UGT1A1.
[036] Figura 20. - Análise de sobrevida no UALCAN do câncer de próstata para a
expressão do gene ZNF485.
[037] Figura 21. – Análise de expressão diferencial do gene FASN no câncer de próstata,
comparado com tecido normal, tumoral e metastático.
[038] Figura 22. – Análise de expressão diferencial do gene GAD1 no câncer de próstata,
comparado com tecido normal, tumoral e metastático.
[039] Figura 23. – Análise de expressão diferencial do gene MAPK8IP2 no câncer de
próstata, comparado com tecido normal, tumoral e metastático.
[040] Figura 24. – Análise de expressão diferencial do gene MARCKSL1 no câncer de
próstata, comparado com tecido normal, tumoral e metastático.
[041] Figura 25. – Análise de expressão diferencial do gene MYO6 no câncer de
próstata, comparado com tecido normal, tumoral e metastático.
[042] Figura 26. – Análise de expressão diferencial do gene PAQR6 no câncer de
próstata, comparado com tecido normal, tumoral e metastático.
[043] Figura 27. – Análise de expressão diferencial do gene PIGL no câncer de próstata,
comparado com tecido normal, tumoral e metastático.
[044] Figura 28. – Análise de expressão diferencial do gene PYCR1 no câncer de
próstata, comparado com tecido normal, tumoral e metastático.
[045] Figura 29. Descrição em fluxograma dos métodos utilizados para invenção
DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RNA-seq e dados de informações clínicas do Atlas
do Genoma do Câncer (TCGA)
[046] Para realizarmos a seleção dos genes, inicialmente baixamos os dados clínicos dos
pacientes de câncer de próstata utilizando o pacote TCGA Biolinks disponível para R
(COLAPRICO, Antonio et al. TCGAbiolinks: an R/Bioconductor package for
integrative analysis of TCGA data. Nucleic acids research, v. 44, n. 8, p. e71-e71, 2016.).

Originalmente, a tabela continha um total de 115 pacientes. Realizamos individualmente
análises de expressão diferencial dos genes utilizando, novamente, o pacote para R
TCGA Biolinks, com parâmetros de LogFC > 1 para genes aumentados, LogFC < 1 para
genes diminuídos e p <0.05, nestas análises, a expressão gênica dos pacientes seria
comparada com dados de tecido normal disponíveis no próprio pacote, obtendo dessa
forma uma lista de genes diferencialmente expressos (DEGs).

Análise de sobrevida
[047] Essa lista foi então submetida a uma análise de sobrevida, ainda utilizando o
mesmo pacote, o que nos retornou uma nova lista apenas com os genes significativos
para a sobrevida dos pacientes, contendo 93 genes. Feito isto, submetemos essa lista a
análise no UALCAN (Chandrashekar DS, Bashel B, Balasubramanya SAH, Creighton
CJ, Rodriguez IP, Chakravarthi BVSK and Varambally S. UALCAN: A portal for
facilitating tumor subgroup gene expression and survival analyses. Neoplasia. 2017
Aug;19(8):649-658. doi: 10.1016/j.neo.2017.05.002 [PMID:28732212]) para 8/12

confirmação de nossos dados, além disso, nele obtivemos os plots de sobrevida para cada
gene individualmente. Em nossa análise utilizamos apenas os genes de impacto negativo,
ou seja, cuja maior expressão resultaria numa menor sobrevida para os pacientes. Ao
final, obtivemos uma lista com 21 genes.

Análise de expressão diferencial a nível protéico, recorrência e biomaracadores
[048] Para testarmos a expressão diferencial desses genes no câncer de próstata,
comparado com tecido normal e metastático, utilizamos o TNMplot
(https://www.tnmplot.com), resultando em 8 genes significativos. Para confirmarmos a
expressão de nossos genes a nível proteico, os submetemos ao The Human Protein Atlas
(Towards a knowledge-based Human Protein Atlas. Nat Biotechnol. Berglund L et al,
2008.) no qual encontramos lâminas de imuno-histoquímica com diferença significativa
entre o tecido tumoral e o tecido normal para 5 dos 21 genes de impacto negativo
encontrados no UALCAN, sendo 1 deles já reconhecido como biomarcadores para o
câncer de próstata. Feito isso, comparamos de expressão gênica para recorrência de

adenocarcinoma de próstata armazenado no GEOdatasets (Barrett T, Wilhite SE, Ledoux
P, Evangelista C, Kim IF, Tomashevsky M, Marshall KA, Phillippy KH, Sherman PM,
Holko M, Yefanov A, Lee H, Zhang N, Robertson CL, Serova N, Davis S, Soboleva A.
NCBI GEO: archive for functional genomics data sets--update. Nucleic Acids Res. 2013
Jan;41(Database issue):D9915.), (GSE26022) (Qi Long. et al Protein-coding and
MicroRNA Biomarkers of Recurrence of Prostate Cancer Following Radical
Prostatectomy. The American Journal of Pathology, Vol. 179, No. 1, July 2011.), dos 21
genes iniciais, 4 se demonstraram impactantes na recidiva segundo esta análise.

RESULTADOS OBTIDOS
[049] A lista inicial contendo 2038 genes foi reduzida para uma lista contento 93 a qual
foi refinada a partir das análises subsequentes três subgrupos de genes impactantes na
sobrevida, na recidiva e na metástase contendo 21, 8 e 2 genes. [050] Tabela 1. Genes
expressos entre grupos e genes individuais de cada grupo de indivíduos com câncer de
próstata

Grupos de

Papel dos

Análise

Biomarcador

Total

Elementos

es
Sobrevida pelo

21

CPLX1,

GAD1,

GPC2,

GPRIN1,

LOC100272228, MAPK8IP2, PAQR6, PATE1,

UALCAN
(Prognóstico)

AMH,

PCBP3, PIGL, PVT1, RPL36A, SGK494,

Prognóstico

SLC25A27,

UGT1A1,

ZNF485,

FASN,

Recorrência pelo Prognóstico
TNMplot

8

MARCKSL1, MYO6 e PYCR1
GAD1, MAPK8IP2, PAQR6, PIGL, FASN,

Biomarcadores
pelo THPA

2

MARCKSL1, MYO6 e PYCR1
PAQR6 e PIGL

Diagnóstico

[051] Dos 93 genes encontrados, 5 foram identificados desregulados também a nível
protéico pela análise no The Human Protein Atlas, sendo 2 deles (PIGL e PAQR6) já
identificados como biomarcadores para câncer de próstata.
[052] Figura 1. Comparação de lâminas de imuno-histoquímica de tecido de próstata
normal e tecido de câncer de próstata.

[053] Figura 2. Comparação de lâminas de imuno-histoquímica de tecido de próstata
normal e tecido de câncer de próstata
[054] Figura 3. Vias metabólicas relacionadas ao câncer de próstata [055]
Tabela 02 Via
Total
Vias metabólicas 1430

Hits
5

Valor de P
0.00733

Metabolismo de taurina e hipotaurina

11

1

0.0113

Biossíntese de ácidos graxos

18

1

0,0185

Biossíntese de âncora de

25

1

0,0256

Metabolismo de ascorbato e aldarato
Metabolismo de butanoato

27

1

0.0276

28

1

0.0286

Metabolismo de beta-alanina

31

1

0.0316

Interconversões de pentose e

34

1

0,0346

Metabolismo de porfirina e clorofila

42

1

0.0426

Diabetes mellitus tipo I

43

1

0.0436

glicosilfosfatidilinositol (GPI)

glucuronato

[056] Figura 4. - Análise de sobrevida no UALCAN do câncer de próstata para a
expressão do gene AMH.
[057] Figura 5. - Análise de sobrevida no UALCAN do câncer de próstata para a
expressão do gene CPLX1.
[058] Figura 6. - Análise de sobrevida no UALCAN do câncer de próstata para a
expressão do gene GAD1.
[059] Figura 7. - Análise de sobrevida no UALCAN do câncer de próstata para a
expressão do gene GPC2.
[060] Figura 8. - Análise de sobrevida no UALCAN do câncer de próstata para a
expressão do gene GPRIN.
[061] Figura 9. - Análise de sobrevida no UALCAN do câncer de próstata para a
expressão do gene LOC100272228.
[062] Figura 10. - Análise de sobrevida no UALCAN do câncer de próstata para a
expressão do gene MAPK8IP2.

[063] Figura 11. - Análise de sobrevida no UALCAN do câncer de próstata para a
expressão do gene PAQR6.
[064] Figura 12. - Análise de sobrevida no UALCAN do câncer de próstata para a
expressão do gene PATE1.
[065] Figura 13. - Análise de sobrevida no UALCAN do câncer de próstata para a
expressão do gene PCBP3.
[066] Figura 14. - Análise de sobrevida no UALCAN do câncer de próstata para a
expressão do gene PIGL.
[067] Figura 15. - Análise de sobrevida no UALCAN do câncer de próstata para a
expressão do gene PVT1.
[068] Figura 16. - Análise de sobrevida no UALCAN do câncer de próstata para a
expressão do gene RPL36A.
[069] Figura 17. - Análise de sobrevida no UALCAN do câncer de próstata para a
expressão do gene SGK494.
[070] Figura 18. - Análise de sobrevida no UALCAN do câncer de próstata para a
expressão do gene SLC25A27.
[071] Figura 19. - Análise de sobrevida no UALCAN do câncer de próstata para a
expressão do gene UGT1A1.
[072] Figura 20. - Análise de sobrevida no UALCAN do câncer de próstata para a
expressão do gene ZNF485.
[073] Figura 21. – Análise de expressão diferencial do gene FASN no câncer de próstata,
comparado com tecido normal, tumoral e metastático.
[074] Figura 22. – Análise de expressão diferencial do gene GAD1 no câncer de próstata,
comparado com tecido normal, tumoral e metastático.
[075] Figura 23. – Análise de expressão diferencial do gene MAPK8IP2 no câncer de
próstata, comparado com tecido normal, tumoral e metastático.
[076] Figura 24. – Análise de expressão diferencial do gene MARCKSL1 no câncer de
próstata, comparado com tecido normal, tumoral e metastático.
[077] Figura 25. – Análise de expressão diferencial do gene MYO6 no câncer de
próstata, comparado com tecido normal, tumoral e metastático.
[078] Figura 26. – Análise de expressão diferencial do gene PAQR6 no câncer de
próstata, comparado com tecido normal, tumoral e metastático.

[079] Figura 27. – Análise de expressão diferencial do gene PIGL no câncer de próstata,
comparado com tecido normal, tumoral e metastático.
[080] Figura 28. – Análise de expressão diferencial do gene PYCR1 no câncer de
próstata, comparado com tecido normal, tumoral e metastático.

VANTAGENS DA PATENTE
[081] A definição da abordagem terapêutica individual no tratamento do câncer de
próstata depende de uma identificação inicial e classificação dos genes envolvidos. A
vantagem da invenção está na possibilidade da criação de perfis de painéis genéticos que
possam predizer o curso da neoplasia a partir de dados de sobrevida e recidiva. Ainda,
indicando o risco aumentado de metástase, que acarretará diretamente na escolha correta
do tratamento e consequentemente na redução do custo, bem como no tempo de
sobrevida dos pacientes.
[082] A Figura 29 apresenta a descrição em fluxograma dos métodos utilizados para
invenção.

REIVINDICAÇÕES

1. Painel genético para prever diagnóstico, prognóstico e predição de neoplasias de
próstata, através da detecção da expressão de biomarcadores, caracterizados
pelo grupo de genes AMH, CPLX1, GAD1, GPC2, GPRIN1, LOC100272228,
MAPK8IP2, PAQR6, PATE1, PCBP3, PIGL, PVT1, RPL36A, SGK494,
SLC25A27, UGT1A1, ZNF485, FASN, MARCKSL1, MYO6 e PYCR1 em que
o aumento ou diminuição da expressão gênica de um ou mais biomarcadores, em
comparação com um padrão, indicará recorrência, progressão ou metástase da
doença.
2. Painel genético de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela realização
através da análise de amostras biológicas.
3. Painel genético de acordo com as reivindicações 1 e 2 para diagnóstico de
neoplasias de próstata, caracterizado pelos biomarcadores PAQR6 e PIGL.
4. Painel genético de acordo com as reivindicações 1 e 2 para prognóstico de
neoplasias de próstata, caracterizado pelos biomarcadores GAD1, MAPK8IP2,
PAQR6, PIGL, FASN, MARCKSL1, MYO6 e PYCR1
5. Painel genético de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por prever
alterações nas vias de sinalização dos genes AMH, CPLX1, GAD1, GPC2,
GPRIN1, MAPK8IP2, PAQR6, PATE1, PCBP3, PIGL, PVT1, RPL36A,
SGK494, SLC25A27, UGT1A1, ZNF485, FASN, MARCKSL1, MYO6 e
PYCR1 utilizando técnicas de sequenciamento de nova geração, microarranjo e
PCR em tempo real, não excluindo outras.
6. Painel genético de acordo com as reivindicações 1 e 5, caracterizado por
amostra de tecido de tumor oral fresco ou parafinado e amostras de saliva de
pacientes com câncer oral, não excluindo outros tipos de amostras.

DESENHOS
FIGURA 01

FIGURA 02

FIGURA 03

FIGURA 04

FIGURA 05

FIGURA 06

FIGURA 07

FIGURA 08

FIGURA 09

FIGURA 10

FIGURA 11

FIGURA 12

FIGURA 13

FIGURA 14

FIGURA 15

FIGURA 16

FIGURA 17

FIGURA 18

FIGURA 19

FIGURA 20

FIGURA 21

FIGUA 22

FIGURA 23

FIGURA 24

FIGURA 25

FIGURA 26

FIGURA 27

FIGURA 28

Figura 29

RESUMO

Painel genético no prognóstico e predição de neoplasia de próstata A invenção
busca descrever um painel para o câncer de próstata que, a partir da identificação de
biomarcadores e a expressão gênica diferencialmente aumentada, se correlacionam com
sobrevida, diagnóstico, prognóstico, recidiva, progressão e possibilidade de metástase da
neoplasia. O painel utiliza para as análises dados de RNAseq do TCGA; expressão
diferencial pelo TCGAbiolinks no software R; identificação dos genes que impactavam
negativamente na sobrevida pelo TNMplot; por fim, na identificação de vias metabólicas
no NetworkAnalyst.

5.

REFERENCIAS:

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