Dissertação - Márcio Thomaz.pdf
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS
FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS
Márcio Thomaz dos Santos Varjão
Potencial leishmanicida de produtos microbianos antárticos: avaliação
farmacológica de extratos pigmentados bacterianos e revisão sistemática da
atividade anti-Leishmania de metabólitos fúngicos
Maceió
2021
2
MÁRCIO THOMAZ DOS SANTOS VARJÃO
Potencial leishmanicida de produtos microbianos antárticos: avaliação farmacológica de
extratos pigmentados bacterianos e revisão sistemática da atividade anti-Leishmania de
metabólitos fúngicos
Dissertação de Mestrado apresentado ao Programa de Pósgraduação em Ciências Médicas da Universidade Federal
de Alagoas-UFAL, como parte das exigências para a
obtenção do título de Mestre em Ciências Médicas.
Área de Concentração: Estudos Clínicos e Laboratoriais em
Ciências Médicas.
Orientador: Profa. Dra. Aline Cavalcanti de Queiroz
Coorientador: Prof. Dr. Alysson Wagner Fernandes Duarte e
Profa. Dra. Magna Suzana Alexandre Moreira
Maceió
2021
Catalogação na Fonte
Universidade Federal de Alagoas
Biblioteca Central
Divisão de Tratamento Técnico
Bibliotecário: Marcelino de Carvalho Freitas Neto – CRB-4 – 1767
V313p
Varjão, Márcio Thomaz dos Santos.
Potencial leishmanicida de produtos microbianos antárticos : avaliação
farmacológica de extratos pigmentados bacterianos e revisão sistemática da
atividade anti-Leishmania de metabólitos fúngicos / Márcio Thomaz dos Santos
Varjão. – 2021.
147 f. : il.
Orientadora: Aline Cavalcanti de Queiroz.
Coorientador: Alysson Wagner Fernandes Duarte e Magna Suzana
Alexandre Moreira.
Dissertação (Mestrado em Ciências Médicas) – Universidade Federal de
Alagoas. Faculdade de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Ciências
Médicas. Maceió, 2021.
Inclui produtos educacionais.
Bibliografia: f. 131-147.
1. Bioprospecção. 2. Extremófilos. 3. Produtos biológicos. 4. Leishmaniose.
5. Antiparasitários. I. Título.
CDU: 615.283
4
Folha de Aprovação
Márcio Thomaz dos Santos Varjão
Potencial leishmanicida de produtos microbianos antárticos: avaliação farmacológica de extratos
pigmentados bacterianos e revisão sistemática da atividade anti-Leishmania de metabólitos fúngicos
Dissertação submetida ao Programa de PósGraduação em Ciências Médicas da
Universidade Federal de Alagoas.
________________________________________________
Profa. Dra. Aline Cavalcanti de Queiroz
UFAL / Campus Arapiraca
Orientadora
_______________________________________________
Prof. Dr. Alysson Wagner Fernandes Duarte
UFAL / Campus Arapiraca
Coorientador
_______________________________________________
Profa. Dra. Magna Suzana Alexandre Moreira
UFAL / Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde - ICBS
Coorientadora
Banca Examinadora:
_______________________________________________
Profa. Dra. Carolinne de Sales Marques
UFAL / Campus Arapiraca
Examinador interno
________________________________________________
Profa. Dra. Mariana da Silva Santos
FEJAL / Centro Universitário CESMAC
Examinador externo
________________________________________________
Profa. Dra. Ana Carolina Vieira
UFAL / Escola de Enfermagem - EENF
Examinador externo
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AGRADECIMENTOS
A gradeço aos meus pais, irmão, familiares e amigos pelo apoio, incentivo e torcida para que
eu conseguisse alcançar esse sonho.
À minha orientadora Dra. Aline Cavalcanti de Queiroz, pela confiança depositada, e por todo
conhecimento compartilhado com generosidade e paciência durante esse o processo.
Aos meus coorientadores, Dr. Alysson Wagner Fernandes Duarte e Dra. Magna Suzana
Alexandre Moreira pelas valiosas contribuições para o desenvolvimento dessa dissertação.
Da mesma forma, agradeço a todos os professores do Programa de Ciências Médica da UFAL,
especialmente à coordenadora Dra. Michelle Jacintha Cavalcante Oliveira.
Agradeço, também, aos componentes das bancas de qualificação e defesa, Dra. Carolinne de
Sales Marques, Dra. Mariana da Silva Santos e Dra. Ana Carolina Vieira por terem aceitado o
convite e pelas sugestões e apontamentos para o enriquecimento do trabalho.
Aos meus companheiros de fluxo e amigos do Laboratório de Farmacologia e Imunidade
(UFAL / Campus A.C. Simões), os doutorandos: Amanda, Suellen, Flavio, Kaycke, Joice e
Letícia; os mestrandos: Karoline, Diogo, Thiago, Éder, Lilyana e Hilda; e os ICs: Shakira,
Izabelly e Alisson, que tornaram essa minha jornada muito mais leve e divertida.
Aos queridíssimos amigos, servidores do ICBS-UFAL, Anderson Leite e Ana Raquel que
sempre me socorreram nos perrengues do dia a dia.
À Adriely, Raphaella, Sabrina, Hyandra, Kelly e todos os membros Laboratório de
Microbiologia, Imunologia e Parasitologia (UFAL/Campus Arapiraca), pelo acolhimento e
auxílio.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior (CAPES) pela concessão
da bolsa.
A todos, agradeço profundamente.
6
RESUMO
Doenças como a leishmaniose continuam negligenciadas pela indústria farmacêutica. Como
consequência a isso, o tratamento para essa doença encontra-se defasado, deixando inúmeros
indivíduos afetados desassistidos. Para reverter o impacto desse abandono, é imprescindível a
busca por novos protótipos de fármacos mais seguros para o tratamento da leishmaniose. Diante
disso, a bioprospecção de produtos naturais, especialmente os produtos microbianos, representa
excelente fonte de partida. Sob essa perspectiva, o presente estudo investigou a atividade
leishmanicida de extratos de bactérias isoladas da Antártica, bem como realizou uma revisão
sistemática acerca da atividade leishmanicida de metabólitos fúngicos. No estudo experimental,
oito isolados bacterianos obtidos de amostras de sedimento e liquens antárticos foram
cultivados em caldo nutriente durante sete dias a 15 °C para produção de biomassa. Os
metabólitos pigmentados intracelulares foram extraídos com metanol e posteriormente as
soluções extrativas obtidas foram secas em dessecador sob vácuo. Esses extratos não
apresentaram efeito citotóxico quando testados em macrófagos da linhagem J774.A1 no ensaio
de MTT. Além disso, os extratos demonstraram atividade leishmanicida in vitro contra formas
promastigotas de L. (L.) chagasi, destacando os extratos de 14.AN.P1 (CI50 = 63.04 ± 5.49
µg/mL), 2.ANUV.P4 (CI50 = 91.19 ± 3.69 µg/mL), 14.UVAB.11 (CI50 = 52.65 ± 2.91 µg/mL),
4.UVAB.12 (CI50 = 36.83 ± 2.61 µg/mL) e 7.UVAB.14 (CI50 = 78.10 ± 4.42 µg/mL). No
entanto, nenhum extrato inibiu o crescimento das formas promastigotas de L. (L.) amazonensis.
Na revisão sistemática, conduzida a partir de buscas nas bases de dados PubMed, Lilacs e
Scielo, foram incluídos 59 artigos, dos quais 39 (66,1%) apresentaram pelo menos um composto
isolado com atividade leishmanicida, enquanto 20 (33,9%) avaliaram apenas extratos brutos ou
frações semipurificadas. Os compostos ativos reportados foram produzidos principalmente por
Penicillium sp. e Aspergillus sp. As espécies de L. (L.) amazonensis e L. (L.) donovani foram
as mais avaliadas. Os resultados obtidos no estudo experimental, em conjunto com as
evidências reportadas pelas publicações reunidas na revisão sistemática, indicam na prospecção
de produtos microbianos um caminho promissor rumo ao desenvolvimento de novas entidades
químicas para o combate à leishmaniose.
Palavras-chave: Bioprospecção. Extremófilos. Produtos naturais. Leishmaniose. Agentes
Antiparasitários.
7
ABSTRACT
Diseases such as leishmaniasis remain neglected by the pharmaceutical industry. As a result,
the treatment for this disease is outdated, leaving countless affected individuals unattended. To
reverse the impact of this abandonment, it is essential to search for new prototypes of safer
drugs for the treatment of leishmaniasis. Therefore, the bioprospecting of natural products,
especially microbial products, represents an excellent starting point. From this perspective, this
study investigated the leishmanicidal activity of extracts of bacteria isolated from Antarctica,
as well as a systematic review of the leishmanicidal activity of fungal metabolites. In the
experimental study, eight bacterial isolates obtained from sediment samples and Antarctic
lichens were cultivated in nutrient broth for seven days at 15 °C for biomass production. The
intracellular pigmented metabolites were extracted with methanol and then the extractive
solutions obtained were dried in a desiccator under vacuum. These extracts did not show
cytotoxic effect when tested on J774.A1 lineage macrophages in the MTT assay. Furthermore,
the extracts demonstrated in vitro leishmanicidal activity against L. (L.) chagasi promastigote
forms, highlighting 14.AN.P1 (CI50 = 63.04 ± 5.49 µg/mL), 2.ANUV.P4 (CI50 = 91.19 ± 3.69
µg/mL), 14.UVAB.11 (CI50 = 52.65 ± 2.91 µg/mL), 4.UVAB.12 (CI50 = 36.83 ± 2.61 µg/mL),
and 7.UVAB.14 (CI50 = 78.10 ± 4.42 µg/mL). However, no extarct inhibited the growth of L.
(L.) amazonensis promastigote forms. In the systematic review, conducted from searches in the
PubMed, Lilacs and Scielo databases, 59 articles were included, of which 39 (66.1%) presented
at least one isolated compound with leishmanicidal activity, while 20 (33.9%) evaluated only
crude extracts or semi-purified fractions. The active compounds reported were mainly produced
by Penicillium sp. and Aspergillus sp. The species of L. (L.) amazonensis and L. (L.) donovani
were the most evaluated. The results obtained in the experimental study, together with the
evidence reported by the publications gathered in the systematic review, indicate a promising
path towards the development of new chemical entities to combat leishmaniasis in the
prospecting of microbial products.
Keywords: Bioprospecting. Extremophiles. Natural products. Leishmaniasis. Antiparasitic
Agents.
8
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1– Número de pessoas precisando de tratamento e cuidado para doenças negligenciadas
em 2016 segundo a Organização Mundial da Saúde ............................................. 17
Figura 2 – Taxonomia de Leishmania spp. .............................................................................. 19
Figura 3 – Status endêmico da leishmaniose cutânea (A) e visceral (B) no mundo, 2018 ...... 20
Figura 4 – Casos de leishmaniose visceral nos países das Américas (2001-2019) .................. 21
Figura 5 – Casos de leishmaniose cutânea Região das Américas e sub-regiões ...................... 22
Figura 6 – Estratificação de risco da leishmaniose visceral (A) e tegumentar (B) por
município de infecção no Brasil, 2017 a 2019. ..................................................... 23
Figura 7 – Formas evolutivas de Leishmania spp. ................................................................... 24
Figura 8 – Etapas do ciclo de vida do Phlebotomus spp. (A). Flebótomos fêmeas adultas
durante o repasto sanguíneo (B). ........................................................................... 25
Figura 9 – Ciclo de desenvolvimento e transmissão da Leishmania spp. ................................ 26
Figura 10 – Principais autores da resposta imune inata e adaptativa durante a patogenia da
leishmaniose .......................................................................................................... 29
Figura 11 – Principais moléculas envolvidas no reconhecimento da Leishmania spp............. 33
Figura 12 – Classificações e manifestações clínicas da leishmaniose...................................... 35
Figura 13 – Estrutura química das principais drogas atualmente disponíveis para o tratamento
da leishmaniose ...................................................................................................... 39
Figura 14 – Estratégias para a descoberta de medicamentos baseados em produtos naturais 45
Figura 15 – Mapa da Antártica, destacando o manto de gelo e as áreas de rocha exposta ..... 48
Figura 16 – Estação Antártica Comandante Ferraz (EACF) .................................................... 49
Figura 17 – Cultivo bacteriano em meio líquido ...................................................................... 55
Figura 18 – Diferentes estágios de extração dos pigmentos ..................................................... 56
Figura 19 – Etapas da extração dos pigmentos......................................................................... 57
9
LISTA DE QUADROS
Quadro 1– Doenças tropicais negligenciadas reconhecidas pela OMS .................................... 18
Quadro 2 – Classificação Clínica das leishmanioses e principais espécies causadoras ........... 34
Quadro 3 – Via de administração, efeito colateral/adverso e contraindicação dos principais
fármacos usados no tratamento da leishmaniose. .................................................. 44
Quadro 4 – Bactérias isoladas do ambiente antártico ............................................................... 54
10
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AIDS
Síndrome da imunodeficiência adquirida
APCs
Células apresentadoras de antígenos
BOD
Demanda bioquímica de oxigênio (incubadora)
C3b
Fragmento de Componente 3 do Complemento
CD
Grupo de diferenciação (do inglês, cluster of differentiation)
CDC
Centers for Disease Control and Prevention
CO2
Dióxido de Carbono
CR1, CR3
Receptor do Complemento Tipo 1 e Tipo 3
DMSO
Dimetilsulfóxido
DTNs
Doenças Tropicais Negligenciadas
DUDH
Declaração Universal dos Direitos Humanos
EACF
Estação Antártica Comandante Ferraz
ELISA
Ensaio de Imunoabsorção enzimática
EROs
Espécies Reativas de Oxigênio
FcγRs
Receptores para a porção Fc de IgG
FDA
Food and Drug Administration
FIOANTAR
Projeto Fiocruz na Antártica
FnRs
Receptores de fibronectina
G0/G1/S
Fase de repouso / intermediária 1 / síntese do ciclo celular
G2 / M
Fase intermediária 2 do ciclo celular / fase de Mitose
gp63
Glicoproteína 63
HIV
Vírus da Imunodeficiência Humana
IDH
Índice de Desenvolvimento Humano
IFN-γ
Interferon-gama
IgG
Imunoglobulina G
IL
Interleucina
L. (L.)
Leishmania do subgênero Leishmania
L. (V.)
Leishmania do subgênero Viannia
LC
Leishmaniose Cutânea
LC3
Cadeia leve 3 da proteína 1 associada a microtúbulos
LDPC
Leishmaniose Dérmica Pós-Calazar
11
LMC
Leishmaniose Mucocutânea
LPG
Lipofosfoglicano
LV
Leishmaniose Visceral
M1
Macrófago Classicamente Ativado
M2
Macrófago Alternativamente Ativado
MAC
Complexo de Ataque à Membrana
MHC II
Complexo Principal de Histocompatibilidade de Classe 2
MPO
Mieloperoxidase
MR
Receptor de Manose
MTT
3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina
NE
Elastase de Neutrófilos
NETs
Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos
NK
Células Natural Killer
NLR
Receptores do tipo NOD (do inglês, Nod Like Receptor)
NO
Óxido Nítrico
NO2¯
Nitrito
OMS
Organização Mundial da Saúde
OPERANTAR
Operação Antártica Brasileira
OPAS
Organização Pan-Americana da Saúde
P&D
Pesquisa e Desenvolvimento
PBS
Tampão Fosfato-Salino (do inglês, Phosphate Buffered Saline)
PI3K/AKT
Via do fosfatidilinositol-3-quinase / Proteína Quinase B
PROANTAR
Programa Antártico Brasileiro
PSG
Gel Secretado Por Promastigotas
rDNA
DNA Recombinante
RPMI
Roswell Park Memorial Institute Medium
Sb5+
Antimoniais Pentavalentes
SFB
Soro Fetal Bovino
SOD
Superóxido Dismutase
TH
Linfócito T auxiliar (do inglês, T helper)
TNF-α
Fatores de Necrose Tumoral Alfa
Treg
Linfócito T Reguladores
TLR
Receptor tipo Toll (do inglês, Toll-like Receptor)
12
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.............................................................................................................. 13
2 OBJETIVOS................................................................................................................... 15
2.1 Objetivo geral................................................................................................................ 15
2.2 Objetivos específicos..................................................................................................... 15
3 REVISÃO DE LITERATURA..................................................................................... 16
3.1 Doença tropicais negligenciadas................................................................................... 16
3.2 Aspectos Gerais da leishmaniose.................................................................................. 19
3.2.1 Epidemiologia da leishmaniose nas Américas........................................................... 21
3.2.2 Agente etiológico e vetor da leishmaniose................................................................. 24
3.2.3 Ciclo de Transmissão................................................................................................. 26
3.2.4 Imunopatogênese........................................................................................................ 28
3.2.5 Classificação Clínica.................................................................................................. 34
3.2.6 Farmacoterapia........................................................................................................... 38
3.3 Pesquisa e desenvolvimento (P&D) de novos fármacos............................................... 45
3.4 Antártica – características ambientais e potencial biotecnológico................................ 48
3.4.1 Metabólitos microbianos com atividade biológica de importância clínica................ 51
4 METODOLOGIA........................................................................................................... 54
4.1 Estudo experimental: Produção dos extratos bacterianos e ensaios farmacológicos.... 54
4.1.1 Obtenção dos produtos naturais oriundos de bactéria antárticas................................ 54
4.1.2 Cultivo e produção de biomassa................................................................................. 55
4.1.3 Extração de pigmentos intracelulares bacterianos...................................................... 56
4.1.4 Manutenção da linhagem macrófagos........................................................................ 58
4.1.5 Determinação da viabilidade celular.......................................................................... 58
4.1.6 Ensaio de viabilidade de promastigotas de Leishmania............................................. 58
4.1.7 Análise estatística....................................................................................................... 59
4.2 Estudo da literatura: Bioprodutos fúngicos com atividade leishmanicida – avaliação do
estado da arte...................................................................................................................... 59
5 PRODUTOS.................................................................................................................... 60
5.1 PRODUTO 1................................................................................................................ 61
5.2 PRODUTO 2................................................................................................................ 75
REFERÊNCIAS...............................................................................................................131
13
1 INTRODUÇÃO
A indústria farmacêutica mundial passa por importantes transformações estruturais
gerada por alterações demográficas e na carga de incidência das doenças (transição
epidemiológica). Em países desenvolvidos observa-se um predomínio de doenças crônicas não
transmissíveis, resultando em um processo de forte incentivo para o desenvolvimento de
medicamentos destinados a esse mercado. Em contraste, na maioria dos países não
desenvolvidos verifica-se a persistência de alta taxa de prevalência de doenças infecciosas
associadas à condições de vulnerabilidade social. Nesse último cenário, como as perspectivas
de retorno financeiro são baixas, o setor farmacêutico desloca ínfimos investimentos em
pesquisa e desenvolvimento para atender às necessidades médicas dessas regiões
(BERMUDEZ; COSTA; NORONHA, 2020; REIS; BARBOSA; PIMENTEL, 2016;
TROUILLER et al., 2002).
O acesso a medicamentos representa um dos componentes vitais do direito à saúde,
haja vista que eles constituem uma intervenção terapêutica valiosa para assegurar a melhoria
das condições de saúde das populações, pois podem prevenir, curar, controlar ou reduzir a
morbimortalidade associada a doenças e agravos (BERMUDEZ, 2014; BERMUDEZ; COSTA;
NORONHA, 2020). Entretanto, a saúde global é marcada por uma notória iniquidade no acesso
à assistência farmacêutica que afeta sobremaneira os países economicamente vulneráveis, o que
acaba refletindo em uma distribuição desigual das formas de adoecimento ou morte ao redor do
mundo (FORTES; RIBEIRO, 2014).
A leishmaniose exemplifica esse quadro de negligenciamento e iniquidade. Essa
doença é uma antropozoonose (doença própria de animais, que pode ser acidentalmente
transmitida aos seres humanos) provocada por protozoários do gênero Leishmania, com
transmissão vetorial feita por diferentes espécies de flebotomíneos. A leishmaniose no passado
ocorria de forma endêmica, principalmente em áreas rurais, porém, ao final da década de 1970
ela reemerge, aumentando sua incidência e ampliando sua área de transmissão para regiões
urbanas, anteriormente consideradas incólumes, estando no presente, distribuída amplamente
no mundo, e em especial afetando populações pobres (AKHOUNDI et al., 2016; RIFFEL; DE
OLIVEIRA VAZ, 2018).
As manifestações clínicas da leishmaniose variam de lesões cutâneas a acometimento
visceral, que podem apresentar elevada letalidade quando não tratada devido ao
comprometimento de órgãos vitais e possíveis infecções secundárias. A luta contra a
leishmaniose é uma tarefa difícil, pois os tratamentos atuais são longos, caros, requerem
14
hospitalização, no qual os pacientes são submetidos a dolorosas injeções, podendo gerar graves
efeitos colaterais devido à toxicidade. Esses fatores contribuem para inviabilidade ou abandono
do tratamento. Perceber, portanto, a importância de aprimorar os tratamentos para leishmaniose
atualmente disponíveis, visto que estão longe do ideal no que diz respeito à segurança e eficácia.
(DNDI, 2019b).
Nesse contexto, a busca por novas e eficientes moléculas bioativas se tornou um ponto
focal de interesse para a modernização da farmacoterapia de doenças infecciosas. Para este
propósito, a bioprospecção em ambientes subexplorados, como a Antártica, tem sido
reconhecida como uma ferramenta promissora para a descoberta de substâncias com diferentes
aplicações biotecnológicas e medicamente úteis (DANILOVICH et al., 2018; GIUDICE; FANI,
2016; LIU et al., 2013).
Diante disso tudo, o Laboratório de Farmacologia e Imunidade (UFAL / Campus A.C.
Simões) em colaboração com o Laboratório de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia
(UFAL / Campus Arapiraca), têm buscado identificar novos candidatos a fármacos que atendam
às necessidades de inovação na saúde pública brasileira em consonância com agenda global.
Nesse sentido, o presente estudo visou investigar a atividade leishmanicida de extratos de
bactérias isoladas da antártica, diante do potencial biotecnológico e farmacológico desses
produtos.
15
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Investigar a atividade de candidatos a protótipo de fármacos leishmanicidas à base de extratos
de bactérias antárticas isoladas de liquens e sedimento, que constituam opções terapêuticas mais
seguras ao tratamento da leishmaniose. Realizar uma revisão sistemática acerca do potencial
leishmanicida de metabólitos fúngicos.
2.2 Objetivos específicos
▪
Cultivar bactérias isoladas de solo e líquens da antártica;
▪
Produzir extratos pigmentados a partir da biomassa das bactérias cultivadas;
▪
Determinar a citotoxicidade dos produtos naturais para a célula hospedeira (macrófagos);
▪
Verificar a ação dos mesmos sobre promastigotas de Leishmania (L.) chagasi e (L.)
amazonensis;
▪
Identificar a seletividade dos produtos naturais para diferentes espécies do gênero
Leishmania;
▪
Realizar uma revisão sistemática acerca do potencial leishmanicida de metabólitos
fúngicos.
16
3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 Doença tropicais negligenciadas
A organização Médicos sem Fronteiras (2001) propõe uma classificação para as
doenças, agrupando-as em três categorias: Doenças Globais (aquelas que ocorrem em todo o
mundo); Doenças Negligenciadas (mais prevalentes nos países em desenvolvimento); e
Doenças Extremamente Negligenciadas (exclusivas dos países em desenvolvimento). Essas
duas últimas categorias são representadas por um grupo de diversas doenças transmissíveis
causadas por diferentes patógenos como bactérias, fungos, protozoários e vírus, que afetam
predominantemente cerca de 159 países emergentes e subdesenvolvidos em regiões
tropicais. Devido a essas características, tem-se convencionado chamar esse grupo de Doenças
Tropicais Negligenciadas (DTNs) (WHO, 2017).
Essas doenças variam em sua epidemiologia e impacto na saúde pública, porém,
possuem em comum, a forte relação com condições de pobreza numa conjuntura de baixo índice
de desenvolvimento humano (IDH) e de deterioração ambiental e sanitária. Por essa razão, é
possível encontrar na literatura científica a terminologia “doenças infecciosas da pobreza”
como sinônimo de DTNs (ANDRADE, 2015).
Mais recentemente, uma nova visão tem emergido nas discussões a respeito das
doenças tropicais, nessa perspectiva mais contemporânea elas são tidas como “doenças
promotoras da pobreza”, haja vista que tais doenças geram diversos agravos como:
desnutrição, deficiências físicas, estigma social e discriminação, o que e muitas vezes inabilita
os indivíduos para atividades laborais e reduz a taxa de escolarização, acarretando
consequências econômicas e sociais que afetam negativamente as famílias e comunidades.
Portanto, essas doenças promovem a perpetuação do ciclo de pobreza, constituindo um entrave
ao desenvolvimento humano dos países acometidos (ANDRADE, 2015; DNDI, 2018; MITRA;
MAWSON, 2017).
Por muito tempo as doenças negligenciadas não foram exclusividade dos países
tropicais. Elas estiveram altamente prevalentes em grande parte do mundo, entretanto, ao longo
do tempo, a gradual mudança nos padrões de saúde dos países do hemisfério norte,
caracterizada por melhora nas condições de moradia, alimentação e saneamento básico, resultou
em uma transformação epidemiológica evidenciada pelo progressivo desaparecimento das
doenças infecciosas e parasitárias, que hoje em dia permanecem endêmicas nos países tropicais,
compondo as DTNs (VON PHILIPSBORN et al., 2015; WHO, 2017).
17
Os países da África, Ásia, América Latina e Caribe são os mais atingidos (Figura 1).
Esses países possuem população com baixo poder aquisitivo e, portanto, não respondem ao
anseio de retorno financeiro do setor farmacêutico, o que gera uma distribuição desigual entre
os países desenvolvidos e os não-desenvolvidos no acesso a recursos de cuidados em saúde
(diagnostico, medicamentos, vacinas) (WHO, 2015, 2017).
Figura 1– Número de pessoas precisando de tratamento e cuidado para doenças negligenciadas
em 2016 segundo a Organização Mundial da Saúde.
Figura 2 – Taxonomia de Leishmania spp.Figura 3– Número de pessoas precisando de
tratamento e cuidado para doenças negligenciadas em 2016 segundo a Organização Mundial
da Saúde.
Fonte: Adaptado de DNDI, 2018, p.2.
As DTNs afetam mais de 1,5 bilhão de pessoas e cerca de 3 bilhões estão expostas ao
risco de adquirir uma ou mais dessas doenças em todo o mundo (WHO, 2017). Em conjunto,
as DTNs provocam, anualmente, cerca de meio milhão de mortes no mundo (HOTEZ et al.,
2006, 2014). Até mesmo as doenças consideradas relativamente simples e que possuem
tratamento cujo valor não chega à um dólar por dia, geram inúmeras mortes (CDC, 2018;
IQVIA, 2019).
Nos primeiros relatórios da OMS sobre doenças tropicais negligenciadas (WHO 2010,
2013, 2015) 17 enfermidades eram classificadas como DTNs, porém, em 2017 a
cromoblastomicose e outras micoses profundas, a sarna e outros ectoparasitas e o
envenenamento por picada de cobra foram adicionados à lista. Portando, atualmente 20 DTNs
são reconhecidas pela OMS (WHO, 2017). Todas elas estão elencadas no Quadro 1.
18
Quadro 1– Doenças tropicais negligenciadas reconhecidas pela OMS.
Categoria
Infecções por protozoários
Doenças
1.
2.
3.
Doença de Chagas
Doença do sono (tripanossomíase humana africana)
Leishmaniose
Infecções helmínticas
4. Teníase e neurocisticercose
5. Dracunculíase (doença do verme-da-guiné)
6. Equinococose
7. Trematodiases de origem alimentar
8. Filariose linfática (elefantíase)
9. Oncocercose (cegueira dos rios)
10. Esquistossomose (barriga d’água)
11. Helmintíases transmitidas pelo solo (ascaridíase,
ancilostomíase, tricuríase, estrongiloidíase)
Infecções bacterianas
12. Úlcera de buruli
13. Hanseníase;
14. Tracoma
15. Bouba
Infecções virais
16. Dengue e Chikungunya
17. Raiva
Infecções fúngicas
18. Micetoma, Romoblastomicose e outras micoses
profundas
Infecções ectoparasitárias
19. Escabiose, Miíase e outras doenças causadas por
ectoparasitas
Veneno
20. Envenenamento por picada de cobra
Fonte: Adaptado de ADDISU et al., 2019, p. 2.
A partir desta perspectiva, é possível perceber que ainda há falhas nas políticas
públicas de controle e eliminação das DTNs, acarretando um permanente panorama de altas
taxas de prevalência e incidência dessas doenças. A incompreensão da complexidade e
multicausalidade das DTNs estão entre os principais motivos que levam ao insucesso dessas
políticas. O predomínio de soluções pautadas majoritariamente no campo biomédico como
ênfase na doação de medicamentos é uma estratégia equivocada, pois para que esses
medicamentos cheguem aos pacientes, primeiramente é necessário o fortalecimento dos
sistemas de cuidados de saúde primária dos países vulneráveis (COHEN et al., 2016; HOTEZ,
2018).
19
3.2 Aspectos Gerais da leishmaniose
A leishmaniose é uma parasitose, de caráter antropozoonótico (doença primária de
animais que pode ser transmitida ao homem), causada por protozoários pertencentes a ordem
Kinetoplastida, da família Trypanosomatidae, gênero Leishmania, subgêneros Leishmania e
Viannia. Em mamíferos, mais de 25 espécies de Leishmania já foram descritas, dentre elas, 19
são infecciosas para humanos (OPS, 2019a). Inicialmente a diferenciação de espécies era
baseada na distribuição geográfica ou apresentação clínica, contudo, atualmente, a taxonomia
da leishmania e feita por meio de análises de material genético com técnicas de biologia
molecular (AKHOUNDI et al., 2016). A figura 2 representa uma proposta taxonômica do
gênero Leishmania.
Figura 2 – Taxonomia de Leishmania spp.
Figura 4 – Status endêmico da leishmaniose cutânea (A) e visceral (B) no mundo,
201Figura 5 – Taxonomia de Leishmania spp.
Fonte: Adaptado de OPS, 2019a, p. 17.
A leishmaniose possui ampla distribuição geográfica, como mostra a figura 3. Estimase que 350 milhões de pessoas vivam em áreas de risco e que haja incidência de 1,3 milhões
infecções anualmente, em todo o mundo. Essa doença é considerada endêmica em mais de 100
países sendo responsável por 20.000 a 30.000 mortes por ano, principalmente de indivíduos de
populações pobres de regiões tropicais e subtropicais da África, Ásia, América Latina e
Mediterrâneo (OPS, 2019a). Por prevalecer em condições de vulnerabilidade socioeconômica
e não despertar o interesse das indústrias farmacêuticas a OMS classifica a leishmaniose como
uma doença negligenciada (WHO, 2016).
20
Figura 3 – Status endêmico da leishmaniose cutânea (A) e visceral (B) no mundo, 2019.
Figura 4 – Casos de leishmaniose visceral nos países das Américas (2001-2019)Figura 6 –
Status endêmico da leishmaniose cutânea (A) e visceral (B) no mundo, 2019.
Fonte: Adaptado de WHO, 2021.
21
3.2.5 Epidemiologia da leishmaniose nas Américas
A leishmaniose visceral é endêmica em 13 países das Américas. Nessa região, entre
os anos de 2001 a 2019, foram registrados 65.934 casos novos de LV (Figura 4). Em 2019, o
Brasil representou 97,16% do total de registros com 2.529 casos, os demais foram notificados
na Venezuela (23); Paraguai (22); Colômbia (11); Argentina (9); Honduras (3); Uruguai (3);
Bolívia (1); Guatemala (1); México (1). A incidência de LV nas Américas em 2019 foi de 0,47
casos por 100.000 habitantes com letalidade de 7,7%. Do total de casos, 68,2% evoluíram para
cura. Somente o Brasil, Colômbia, Guatemala, Honduras e Venezuela apresentarão redução no
número de casos (OPAS, 2020).
Figura 4 – Casos de leishmaniose visceral nos países das Américas (2001-2019)
Figura 5 – Casos de leishmaniose cutânea Região das Américas e sub-regiõesFigura 4 –
Casos de leishmaniose visceral nos países das Américas (2001-2019)
Fonte: OPAS, 2020, p.5.
Nas Américas a leishmaniose cutânea/mucosa apresenta números vultuosos de
registros. De 2001 a 2019, 18 países endêmicos notificaram à OPAS uma média de 54.108
casos por ano, totalizando 1.028.054 casos nesse período. Em 2019 a taxa de incidência foi de
18,78 casos por 100.000 habitantes. O Brasil segue sendo o país com maior números de casos
com 15.484 notificações. Desde 2015, as Américas têm apresentado uma tendência
decrescimento nos casos de leishmaniose cutânea/mucosa (Figura 5), apesar disso, houve uma
expansão geográfica da doença (OPAS, 2020).
22
Figura 5 – Casos de leishmaniose cutânea Região das Américas e sub-regiões (2001-2019).
Figura 5 – Casos de leishmaniose cutânea Região das Américas e sub-regiões (2001-2019).
Fonte: OPAS, 2020, p.2.
A dificuldade para erradicação da leishmaniose está associado principalmente a baixos
investimentos em recursos de combate à miséria e promoção do acesso à assistência
médica/farmacêutica de populações vulneráveis, e ações de contenção da disseminação da
doença, essencialmente, no que diz respeito ao controle vetorial (OPS, 2017). Nesse contexto a
América Latina tem enfrentado muitos desafios, porém cada país apresenta diferentes perfis de
avanços ou retrocessos no combate das leishmanioses (OPAS, 2020).
O Brasil no âmbito da Secretaria de Vigilância em Saúde (Ministério da Saúde), desde
2017, utiliza o Índice Composto de Leishmaniose (ICL) para realizar a classificação
epidemiológica dos municípios com transmissão da leishmaniose. Esse indicador, desenvolvido
pela OPAS, toma como base o número absoluto de casos novos e a taxa de incidência da doença
nos últimos três anos, para estratificar os municípios em cinco categorias de transmissão: muito
intenso, intenso, alto, médio e baixo (BRASIL, 2021). A estratificação de risco da leishmaniose
no Brasil em 2019 utilizando o ICL é demonstrado na figura 6.
23
Figura 6 – Estratificação de risco da leishmaniose visceral (A) e tegumentar (B) por município
de infecção no Brasil, 2017 a 2019.
Figura 7 – Formas promastigotas (A) e amastigostas (B) de Leishmania spp.Figura 6 –
Estratificação de risco da leishmaniose visceral (A) e tegumentar (B) por município de infecção
no Brasil, 2017 a 2019.
Notas: Dados obtidos no Sinan / Ministério da Saúde. Fonte: Adaptado de BRASIL, 2021.
Em 2019, o Brasil apresentou uma taxa de incidência de 1,2 casos de LV a cada 100
mil habitantes com 9% de letalidade (a pior marca da última década). A região Nordeste foi
responsável pelo maior registro de casos do país com 49,1% dos 2.529 casos novos
confirmados. Um agravante preocupante é o aumento em todo país dos registros de coinfecção
Leishmania/HIV, chegando em 2019 a 11,1% do total de casos de LV. No mesmo ano, foram
confirmados 15.484 casos novos de LT no Brasil, com coeficiente de detecção de 7,37 casos a
cada 100 mil habitantes, no qual os maiores percentuais de registros ocorreram na região Norte
(42,8%). Do total de pacientes notificados no país (15.484 casos) 67,1% evoluíram para cura
clínica, sendo registrados 19 óbitos (BRASIL, 2021).
24
3.2.2 Agente etiológico e vetor da leishmaniose
Os parasitos do gênero Leishmania possuem ciclo de vida heteróxeno (digenético),
que envolve um hospedeiro vertebrado (humanos e outros animais) e um hospedeiro
invertebrado (flebótomos). Durante o ciclo os parasitos apresentam duas formas evolutivas. A
forma promastigota, que se desenvolve no tubo digestivo do flebótomo, possui corpo celular
afunilado que mede cerca de 10 μm, núcleo, cinetoblasto e flagelo (Figura 7A). A amastigota
é a forma aflagelada, ela possui corpo ovóide que mede 2,5 a 3,5μm e se desenvolve
intracelularmente nos fagócitos do hospedeiro vertebrado (Figura 7B) (SUNTER; GULL,
2017; WHEELER; GLUENZ; GULL, 2011).
Figura 7 – Formas promastigotas (A) e amastigostas (B) de Leishmania spp.
Figura 8 – Etapas do ciclo de vida do Phlebotomus spp. (A). Flebótomos fêmeas adultas
durante o repasto sanguíneo (B).Figura 7 – Formas promastigotas (A) e amastigostas (B) de
Leishmania spp.
Fonte: (A) adaptado OPS, 2019a, p. 18 , (B) adaptado de FIOCRUZ, 2008.
Os vetores responsáveis pela transmissão da leishmaniose em humanos, são dípteros
(insetos) nematóceros de diferentes espécies dos gêneros Lutzomyia (no Novo Mundo) e
Phlebotomus (no Velho Mundo) que pertencem à família Psychodidae, subfamília
Phlebotominae (AKHOUNDI et al., 2016; SADLOVA et al., 2013).
Os flebotomíneos são holometábolos, as etapas do seu ciclo de vida (Figura 8A)
compreendem a fase de ovo que eclodem de 7 a 10 dias após a postura, dando origem a fase
larval com quatro estádios de desenvolvimento que após em média de 20 a 30 dias,
transformam-se em pupas permanecendo imóveis por volta de 15 dias. Na fase adulta (Figura
8B), o flebotomíneo mede 1 a 3 mm de comprimento, possui pernas longas e delgadas, corpo e
as asas cobertos de cerdas de coloração que varia do amarelo ao castanho claro, seu aparelho
bucal apresenta uma probóscide adaptada para picar e sugar. Os machos e fêmeas adultos de
25
flebotomíneos possuem como fonte primária de energia, néctar e seiva de plantas, porém as
fêmeas necessitam se nutrir com sangue de vertebrados (hematofagia) para a maturação dos
seus ovos, portanto, somente as fêmeas atuam como vetores da leishmaniose (BRASIL, 2014;
BRAZIL; RODRIGUES; ANDRADE FILHO, 2015).
O habitat natural dos flebotomíneos originalmente são regiões silvestres, entretanto,
devido à ação antrópica de degradação ambiental ligada à atividade agrícola e expansão urbana,
muitas espécies de flebotomíneos têm se adaptados a áreas menos florestadas, especialmente
espaços peridomiciliares, estabelecendo, desse modo, um maior contato com humanos
(LAINSON; RANGEL, 2005; RANGEL; LAINSON, 2009).
Os flebotomíneos são popularmente conhecidos como mosquito-palha, birigui, mosca
de areia (sand fly - em inglês), entre outros nomes (BRASIL, 2014; MAROLI et al., 2013).
Esses insetos vivem preferencialmente no nível do solo, sua atividade é maior durante o
crepúsculo e a noite, período em que procuram alimentos realizando pequenos voos saltitantes.
Durante o dia, eles se abrigam em locais escuros e protegidos, como troncos de árvores, folhas
caídas no solo, fendas de rochas, grutas, tocas de animais (DIAS et al., 2011; SILVA et al.,
2008; SUCEN,2006).
Figura 8 – Etapas do ciclo de vida do Phlebotomus spp. (A). Flebótomos fêmeas adultas
durante o repasto sanguíneo (B).
Figura 9 – Ciclo de desenvolvimento e transmissão da Leishmania spp.Figura 8 – Etapas do
ciclo de vida do Phlebotomus spp. (A). Flebótomos fêmeas adultas durante o repasto sanguíneo
(B).
Fonte: (A) Adaptado de BOGITSH; CARTER; OELTMANN, 2019, p. 343. (B) DENLINGER et al., 2016, p. 3.
26
3.2.3 Ciclo de Transmissão
O ciclo de transmissão da leishmaniose ocorre em diferentes padrões epidemiológicos
a depender da espécie de Leishmania, dos fatores ambientais e dos hábitos das populações
humanas das regiões acometidas. Nas Américas, a leishmaniose é uma zooantroponose de zonas
rurais e urbanas que acomete roedores, marsupiais, primatas, canídeos silvestres, cães
domésticos e humanos (AKHOUNDI et al., 2016) Na índia, a leishmaniose é uma antroponose
urbana, cuja transmissão é mantida predominantemente entre indivíduos adultos (MUNIARAJ,
2014).
O ciclo de transmissão da leishmaniose inicia-se com o repasto sanguíneo, de fêmeas
de flebótomos infectadas com Leishmania, que acabam inoculando formas promastigotas
metacíclicas do parasito na pele do hospedeiro vertebrado, instaurando, dessa forma, a infecção
(CDC, 2020; PIMENTA et al., 2018). A Figura 9 ilustra as diferentes etapas do ciclo de
transmissão da Leishmania.
Figura 9 – Ciclo de desenvolvimento e transmissão da Leishmania spp.
Figura 10 – Principais atores da resposta imune inata e adaptativa durante a
patogenia da leishmanioseFigura 9 – Ciclo de desenvolvimento e transmissão da
Leishmania spp.
Fonte: Adaptado de MURRAY et al., 2015, p.742.
27
Após a inoculação, os parasitos são reconhecidos e internalizados por diferentes
células fagocíticas, sendo aprisionados em compartimentos intracelulares, que sofrem fusões
com organelas endocíticas, lisossomos e vesículas autofágicas resultando em compartimentos
ácido semelhantes a fagolisossomos chamados de vacúolos parasitóforos. No interior desses
vacúolos especializados, as formas promastigotas metacíclicas sofrem mudanças morfológicas
e fisiológicas diferenciando-se em amastigotas que estabelecem uma residência intracelular e
se multiplicam por divisão binária, provocando a lise das células hospedeiras com a liberação
dos parasitos, que poderão, então, ser interiorizada por novos fagócitos (PIMENTA et al., 2018;
REAL; MORTARA, 2012). Porém a disseminação das formas amastigotas não ocorre apenas
mediante eventos citolíticos, mas também, por meio de fenômeno de transferências no qual
macrófagos infectados promovem a extrusão de amastigotas dentro de estruturas zeióticas que
são então resgatados seletivamente por outros macrófagos adjacentes. Esse comportamento
representa um escape do sistema imunológico do hospedeiro, pois permite a migração sem
exposição ao meio extracelular. Por esses diferentes meios, os parasitos podem atingir outros
locais do corpo, como tecidos cutâneos, mucosos e órgãos viscerais (fígado e baço), gerando
distintas formas clínicas da doença (REAL et al., 2014).
Para que haja a continuidade do ciclo, é necessário que o flebótomo pique um
indivíduo infectado, ingerindo formas amastigotas livres no sangue ou presentes no interior das
células. No intestino médio do vetor (ambiente com maior pH e menor temperatura), os
parasitos se transformam em promastigotas procíclicas que irão atingir a maturação
remodelando sua arquitetura celular e propriedades fisiológicas, em um processo chamado de
metaciclogênese, transformando-se em promastigotas metacíclicas (ROSSI; FASEL, 2017).
Durante essa diferenciação, as promastigotas de Leishmania secretam um gel rico em
proteofosfoglicanos (PSG). Esta matriz densa forma um tampão que obstrui o intestino médio
do flebótomo. No decurso desse processo as promastigotas metacíclicas sofre modificações
bioquímicas em sua superfície perdendo a capacidade de aderirem ao epitélio do intestino
médio do flebótomo. Como resultado, as promastigotas metacíclicas destacam-se e migram
para a probóscida do flebótomo onde são regurgitadas durante um novo repasto sanguíneo e
desse modo, novos indivíduos podem ser infectados (GIRAUD et al., 2019; ROGERS, 2012).
28
3.2.4 Imunopatogênese
A patogenia da leishmaniose é ditada em grande parte pelo tipo e magnitude da
resposta imunológica do hospedeiro que envolve mecanismos do sistema imune inato (células
fagocitárias, sistema complemento e células Natural Killer - NK) e adquirido (linfócitos T e
B). Além disso, a suscetibilidade ou resistência à infecção é determinada pela espécie de
Leishmania e influenciada por fatores vetoriais (KHADEM; UZONNA, 2014; SCOTT;
NOVAIS, 2016).
A fêmea de flebotomíneo, para realizar a hematofagia, introduz suas peças bucais na
pele do hospedeiro até chegar às camadas superficiais da derme, onde cortam tecidos e
dilaceram capilares formando um pequeno poço subcutâneo de sangue (estratégia denominada
telmatofagia ou pool-feeder). Esse processo ativa o sistema imunológico e hemostático do
hospedeiro, prejudicando o repasto sanguíneo. Para superar esses obstáculos, o flebotomíneo
secreta saliva na derme com inúmeros componentes farmacologicamente ativos com
propriedades imunomoduladora, anti-inflamatórias, anticoagulantes, antiplaquetárias e
vasodilatadoras (ANDRADE et al., 2007; GOMES; OLIVEIRA, 2012; MARTINS, 2015).
Durante a telmatofagia de um flebotomíneo infectado, as promastigotas
de Leishmania são coinoculadas com a saliva, no local de alimentação. Os parasitos, então, se
beneficiam das alterações imunologicas promovidas pelos componentes salivares. Desse modo,
a saliva do vetor exerce um efeito potencializador da infecção por Leishmania
(ABDELADHIM; KAMHAWI; VALENZUELA, 2014; DE CASTRO et al., 2017;
LESTINOVA et al., 2017).
Os primeiros eventos da infecção são caracterizados pelo reconhecimento e captação
dos parasitos por diferentes células apresentadoras de antígenos (APCs) como células
dendríticas dérmicas e macrófagos residentes, entretanto essas células sentinelas não são
suficientemente capazes de conter a infecção, o que resulta no recrutamento de neutrófilos,
monócitos e macrófagos (Figura 10A) para o local da inoculação (SCOTT; NOVAIS, 2016;
TIBÚRCIO et al., 2019).
Os neutrófilos são os primeiros leucócitos que migram para o local da infecção. Essas
células possuem grânulos contendo proteínas antimicrobianas como elastase de neutrófilos
(NE) e mieloperoxidase (MPO), produzem espécies reativas de oxigênio (EROs) e podem
capturar e destruir parasitos extracelulares liberando estruturas chamadas "armadilhas
extracelulares de neutrófilos" (NETs), compostas de cromatina com proteínas citosólicas e
granulares. Em contrapartida, algumas espécies de Leishmania desenvolveram mecanismos
29
para resistir aos neutrófilos, como interferir no processo de fusão dos grânulos com
o fagossomo contendo os parasitos. Dessa forma a Leishmania transforma os neutrófilos em
hospedeiros temporários, pois essas células possuem vida curta e acabam por sofrer apoptose
espontânea liberando corpos apoptóticos infeciosos que protegem os parasitos da resposta
imune humoral e facilita a internalização em APCs de forma silenciosa, inibindo o
reconhecimento e ativação de mecanismos microbicida desses fagócitos, favorecendo a
progressão da infecção (BARHOUMI et al., 2019; GUIMARÃES-COSTA et al., 2009; REGLI
et al., 2017).
Figura 10 – Principais atores da resposta imune inata e adaptativa durante a patogenia da
leishmaniose
Figura 11 – Principais moléculas envolvidas no reconhecimento e endocitose de
LeishmaniaFigura 10 – Principais atores da resposta imune inata e adaptativa durante a
patogenia da leishmaniose
Notas: As células dendríticas, macrófagos, neutrófilos, monócitos e Natural Killer (NK) juntamentes com as
proteinas do sistema complemento, a exemplo das anafilatoxinas C3a e C5a, a opsonina C3b e o complexo de
ataque à membrana (MAC), são importantes mediadores da resposta imune inata durante a infecção por
Leishmania. Por outro lado, a resposta adaptativa envolve a participação dos linfócitos T citotóxicos (Tc) e os
linfócitos T auxiliares (Th), que se diferenciam nas subpopulação Th1, Th17, TReg e Th2 e direcionam a ativação
de macrófagos em perfil clássico (M1) associado à resistência, ou alternativo (M2) associado à susceptibilidade.
A resposta adaptativa conta ainda com a atividade dos linfócitos B através da produção de anticorpos direcionados
aos parasitos.
Fonte: Autor (2021).
30
Os macrófagos juntamente com outros fagócitos mononucleares, fagocitam
ativamente os corpos apoptóticos infeciosos além das promastigotas metacíclicas livres,
presentes no sítio inflamatório. Os macrófagos tornam-se as principais células hospedeiras da
Leishmania, nelas os parasitos conseguem não somente sobreviver, mas também multiplicarse. Assim, os macrófagos são essenciais para que a Leishmania spp. estabeleça uma infecção
bem sucedida (FALEIRO et al., 2014; ROMANO et al., 2017).
Outro componente da resposta imune inata presente desde a fase inicial da infecção
por Leishmania spp. é o sistema complemento (Figura 10B). O sistema complemento auxilia
no combate a infecções reconhecendo patógenos extracelulares. Essas proteínas se ativam
durante cascatas de reações proteolíticas que levam à lise celular (DUNKELBERGER; SONG,
2010; MURPHY, 2014; RICKLIN et al., 2010).
Os efeitos protetores do sistema complemento são subvertidos pelos mecanismos de
evasão da Leishmania spp. A resistência ao ataque do sistema do complemento está relacionada,
entre outros fatores, à presença de moléculas de superfície de promastigotas metacíclicas, como
o lipofosfoglicano (LPG) que recobre o parasito atuando como uma barreira mecânica, evitando
a inserção e a formação do complexo de ataque à membrana (MAC), abstendo o parasito da
lise. O LPG também protege promastigotas englobadas no fagossomo, retardando o processo
de fusão deste com as vesículas lisossomais. Outra molécula implicada no escape da atividade
lítica do sistema complemento é a leishmanolisina (gp63), uma metaloprotease de 63 kDa capaz
de clivar C3b ligado ao parasito gerando a forma inativa C3bi, interrompendo, desse modo, a
cascata do complemento e montagem da MAC. A formação de C3bi, no entanto, promove a
opsonização do parasito favorecendo a fagocitose e contribuindo para a progressão da infeção
(ATAYDE et al., 2016; FRANCO; BEVERLEY; ZAMBONI, 2012; LAUTHIER;
KORENAGA, 2018).
A imunidade inata do hospedeiro também conta com a participação das células
Natural Killer (NK) (Figura 10C). As células NK são importantes células linfoides que
desempenham papéis críticos na vigilância imunológica contra processos neoplásicos e
infecciosos. Elas constituem 5% a 15% das células mononucleares no sangue e podem ser
identificadas pela expressão do marcador CD56 e ausência de CD3 de célula T (ABEL et al.,
2018; FREUD et al., 2017).
Durante a infecção por Leishmania spp., as células NK, ao interagirem com celulas
infectadas, são rapidamente ativadas levandando a uma produção de citocinas pró-inflamatórias
(IFN-γ e TNF-α) e de granzima e perforina, induzindo apoptose nas células infectadas por
citotoxicidade. O IFN-γ e TNF-α produzidos pelas células NK, além de promoverem
31
sinergicamente a maturação de macrofagos, também auxiliam na condução da diferenciação
das células T imaturas em células TH1 (MEIRA; GEDAMU, 2019; CAMPOS et al., 2020;
SÉGUIN; DESCOTEAUX, 2016).
O aumento na proliferação de células NK entre as células mononucleares
do sangue periférico de indivíduos curados, indicam um papel protetor das células NK na
leishmaniose humana, entretanto, algumas evidências sugerem que a atividade citotóxica das
NK poderia contribuir para a exacerbação das lesões de cutâneas devido à manutenção de um
estado de hiperinflamação tecidual (ANTONELLI et al., 2005; BOGDAN, 2012; CUNHA et
al., 2016, 2020; MESSLINGER et al., 2018).
Para que o organismo do hospedeiro consiga estabelecer uma defesa eficiente e capaz
de levar a cura da leishmaniose, é fundamental que haja o desenvolvimento da resposta imune
adaptativa. Portanto, o combate efetivo aos parasitos requer que o sistema imune utilize
mecanismos potentes e especializados mediados por células T e macrófagos ativados (Figura
10D) (JAWED; DUTTA; MAJUMDAR, 2019, LIESE; SCHLEICHER; BOGDAN, 2008;
MARTÍNEZ-LÓPEZ et al., 2018).
A geração da imunidade adaptativa envolve a cooperação de células apresentadoras de
antígenos que captam e processam os parasitos de Leishmania no sítio de infecção, e
posteriormente migram para os linfonodos regionais, onde apresentam antígenos parasitarios
aos linfócitos T CD8+ e T CD4+, ativando-os e induzindo-os à proliferação (GABRIEL et al.,
2019; MEIRA; GEDAMU, 2019).
Resultados obtidos em de diferentes modelos de infeção por Leishmania têm apontado
para um papel controverso das células T CD8+, que podem adquirir funções patológicas ou
protetoras a depender do equilíbrio entre o perfil citotóxico e da produção de IFNγ por essas
células (BOUSSOFFARA et al., 2019; CARDOSO et al., 2015; FARIA et al., 2009; SCOTT;
NOVAIS, 2016; STAGER; RAFATI, 2012).
A apresentação antigênica e a produção de diversas interleucinas realizada pelas APCs,
atuam em conjunto para ativar os linfócitos T helper CD4+ naïve influindo na sua polarização
em diferentes populações efetoras (Th1, Th2, Th17) e reguladora (Treg) (JAWED; DUTTA;
MAJUMDAR, 2019; SCOTT; NOVAIS, 2016).
A resposta do tipo Th1 está relacionada a um perfil de resistência e cura. Ela é
caracterizada por uma população de células T CD4+ produtoras de IFN-γ e TNF-α, que ativam
macrofagos levando-os a um fenótipo denominado M1 (classicamente ativado), com alta
capacidade de debelar amastigotas intracelulares por meio da produção de espécies reativas de
oxigênio (EROs) e óxido nítrico (NO). Além disso, os macrófagos M1 secretam citocinas pró-
32
inflamatórias como IL-12, IL-1β e TNF-α essencial para a expansão da resposta protetora. A
resposta do tipo Th2 associa-se a suscetibilidade, exacerbação lesões e a cronicidade da
infecção. O status de polarização Th2 é induzido pela produção de IL-4 e por baixos niveis de
IL-12. Os linfócitos Th2 produzem IL-10, IL-13 e IL-4, que reduzem a expressão de IFN-γ
conduzindo os macrofagos a um fenótipo M2 (alternativamente ativado), os quais secretam IL10 e TGF-β com atividade anti-inflamatória (ATRI; GUERFALI; LAOUINI, 2018;
HURDAYAL; BROMBACHER, 2017; KAYE; SCOTT, 2011; KUMAR et al. , 2020;
TOMIOTTO-PELLISSIER et al., 2018; TY et al., 2019). O fenótipo M2 possui uma maior
expressão de arginase, provocando o direcionamento do metabolismo de L-arginina para a
produção de ornitinas e poliaminas em detrimento da produção de NO. As poliaminas são
nutrientes importantes para o favorecimento da replicação de Leishmania spp. no macrófago,
sendo assim, um fator de agravamento da doença (MUXEL et al., 2018).
As células Th17 e Treg (CD4+ CD25+ Foxp3+) são subpopulações de linfócitos T
helper envolvidas na manutenção da homeostase imunologica. A perda do equilíbrio entre essas
células é um elemento de vultosa relevância na patogênese de doenças infecciosas. No
contexto da leishmaniose, as atividades das células Th17 podem ajudar na depuração de
parasitos intracelulares, devido a sua colaboração com a resposta Th1 por meio da produção
de citocinas pró-inflamatórias, especialmente IL-17. Entretanto a liberação sustentada dessa
interleucina pode gerar manifestações auto-imunes, além de um recrutamento exacerbado de
neutrófilos, que levam à inflamação crônica. Em contraposição ao papel das celulas Th17, os
linfócitos Treg secretam IL-10, uma importante citocina reguladora que inibe a produção de IFNγ, facilitando o desenvolvimento de respostas Th2 incapaz de destruir os parasitos favorecendo
a suscetibilidade à infecção (BANERJEE et al., 2016; GONÇALVES-DE-ALBUQUERQUE
et al., 2017; LEE, 2018; NOACK; MIOSSEC, 2014; ROSSI; FASEL, 2017).
A produção de TNF-α por linfócitos T e principalmente por macrófagos ativados,
durante a infecção por Leishmania, induz a ativação policlonal de linfócitos B com abundante
produção de anticorpos anti-Leishmania (Figura 10E). Contudo, a resposta humoral
direcionada a esses parasitos, ao invés de conferir proteção ao hospedeiro, está associada
propagação do parasito, devido o favorecimento da fagocitose mediante a opsonização por
imunoglobulinas G (IgG). Os mecanismos pelos quais os linfócitos B influenciam no
desenvolvimento da doença ainda não estão bem estabelecidos na literatura (ANDREANI et
al., 2015; DEAK et al., 2010; FIRMINO-CRUZ et al., 2019; NYLÉN; KUMAR, 2012;
SOARES et al., 2017; UENO; WILSON, 2012).
33
As formas promastigotas possuem grandes quantidades de moléculas como LPG e
gp63 expostos, essas moléculas se ligam a receptores da superfície dos macrófagos – como o
receptor do complemento tipo 1 e tipo 3 (CR1 / CR3), o receptor de fibronectina (FnRs), o
receptor de manose (MR) e o receptor Toll-like 2 – desencadeando a fagocitose. As amastigotas,
por outro lado, expressão baixos níveis de LPG e gp63 e, por isso, se beneficiam bastante da
resposta humoral gerada durante a infecção. As amastigotas opsonizadas com imunoglobulinas
específicas irão aderir principalmente aos receptores gama Fc (FcγRs) na superfície de
macrófagos e células dendríticas contribuindo para sua internalização (POLANDO et al., 2018;
UENO; WILSON, 2012). A Figura 11 ilustra as principais moléculas de superfícies de
Leishmania spp. e os diferentes receptores de reconhecimentos de células hospedeiras.
Figura 11 – Principais moléculas envolvidas no reconhecimento e endocitose de Leishmania.
Figura 12 – Classificações e manifestações clínicas da leishmanioseFigura 11 – Principais
moléculas envolvidas no reconhecimento e endocitose de Leishmania.
Notas: O processo de endocitose dos parasitos de Leishmania requer uma complexa interação parasito-hospedeiro
que envolve múltiplos receptores da célula hospedeira como o receptor do complemento 1 e 3 (CR1 / CR3),
receptor de fibronectina (FnRs), receptor de manose (MR), receptor gama Fc (FcγR) e o receptor Toll-like (TLR),
que reconhecem ligantes presentes na superfície do corpo celular ou do flagelo da Leishmania, sendo o
lipofosfoglicano (LPG) e a metaloprotease gp63 (glicoproteína de 63 KDa) as principais moléculas envolvidas
nesse processo.
Fonte: Adaptado de BRASILEIRO FILHO, 2016, p.1453.
Além dos receptores da superfície, a interação Leishmania-macrófago envolve uma
série de eventos de sinalização citosólica. Os receptores tipo NOD (NLR) representam uma
subclasse de sensores citoplasmáticos de reconhecimento de padrões moleculares associados
34
aos patógenos. Durante a infecção por Leishmania os NLRs agem sinergicamente com TLRs
na ativação dos inflamassomas (NLRP3), responsáveis pela ativação da caspase-1 e maturação
de IL-1β e IL-18, desencadeando uma resposta inflamatória com produção de NO, restrição da
replicação do parasito e morte celular piroptótica (DE CARVALHO; ZAMBONI, 2020;
ZAMBONI; SACKS, 2019).
3.2.5 Classificação Clínica
As manifestações clínicas da leishmaniose podem ser classificadas em três síndromes
principais: leishmaniose cutânea (LC), leishmaniose mucocutânea (LMC) e leishmaniose
visceral (LV). O grande polimorfismo clínico da leishmaniose é resultado da interação entre
diferentes fatores, principalmente a espécie de Leishmania e a resposta imune do hospedeiro
(WHO, 2021). O Quadro 2 apresenta as principais classificações clínicas das leishmanioses e
as espécies de leishmania associadas.
Quadro 2 – Classificação Clínica das leishmanioses e principais espécies causadoras.
Classificação Clínica
Subgênero Leishmania
Velho Mundo
Leishmaniose Visceral
L. (L.) donovani
L. (L.) infantum
Novo Mundo
Novo Mundo
L. (L.) infantum chagasi
Leishmaniose Cutânea
L. (L.) major
L. (L.) tropica
L. (L.) aethiopica
L. (L.) infantum chagasi
L. (L.) mexicana
L. (L.) pifanol
L. (L.) amazonensis
Leishmaniose Cutânea Difusa
L. (L.) aethiopica
L. (L.) mexicana
L. (L.) amazonensis
Leishmaniose Mucocutânea
Subgênero Viannia
L. (V.) braziliensis
L. (V.) guyanensis
L. (V.) panamensis
L. (V.) peruviana
L. (V.) lainsoni
L. (V.) naiffi
L. (V.) lindenberg
L. (V.) shawi
L. (V.) braziliensis
L. (V.) panamensis
Fonte: TEIXEIRA et al., 2013, p. 14.
A Ásia Central, Oriente Médio, Mediterrâneo e as Américas são as regiões onde
ocorrem 95% dos casos de LC, que é a manifestação mais comum da leishmaniose. (OPS,
2019a). No Velho Mundo a LC é causada pelas espécies L. (L.) major, L. (L.) tropica e L. (L.)
35
aethiopica, enquanto que, no Novo Mundo mais de dez espécies estão relacionadas ao
desenvolvimento da LC, entre elas, as principais são: L. (L.) amazonensis, L. (V.) braziliensis e
L.(V.) guyanensis, encontradas no Brasil, e L. (L.) mexicana, L. (V.) panamensis e L. (V.)
peruviana, presentes em outros países das américas (BRASIL, 2006; BRASIL, 2017).
A LC possui diferentes apresentações: na Leishmaniose Cutânea Ulcerada (Figura
12A), observa-se uma lesão em forma de pápula que se desenvolve no local de inoculação. Essa
lesão aumenta, evoluindo para uma úlcera de fundo granuloso de tecido necrótico com borda
elevada bem circunscrita e endurecida com cerca de 3 cm, geralmente indolor. A úlcera pode
ser acometida por infecções secundarias bacteriana tornado mais inflamada, purulenta e
dolorosas, aumentando o seu período de recuperação. Se negligenciada, a úlcera pode sofrer
múltiplas complicações tornando-se crônica. Quando curada, a lesão deixa uma cicatriz atrófica
hiperpigmentada em sua periferia e hipocrômica ao centro. Nas infecções por L. (L.) tropica
podem ocorrer cicatrizações não estéril (presença de parasitos viáveis), que podem gerar novas
lesões próxima ao ferimento já cicatrizado, em fenômeno conhecido como Leishmaniose
Recidivante. Uma variante da LC observada em habitantes da Venezuela, Costa Rica, El
Salvador, Honduras e Nicarágua é chamada de Leishmaniose Cutânea Atípica (Figura 12B).
Nessa variante clínica, os indivíduos infectados por L. (L.) infantum apresentam pequenas
lesões papulares, pouco numerosas (1 a 3) e não ulceradas (BRASIL, 2006; BRASIL, 2017;
JAMESON, 2020; OPS, 2019a).
Figura 12 – Classificações e manifestações clínicas da leishmaniose.
Figura 7 – Estrutura química dos principais fármacos para o tratamento da
leishmanioseFigura 12 – Classificações e manifestações clínicas da
leishmaniose.
Fonte: Adaptado de OPS, 2019a, p.47
36
A Leishmaniose Cutânea Disseminada (Figura 12C) é uma manifestação incomum,
causada pelas espécies L. (V.) braziliensis, L. (L.) panamensis, L. (L.) amazonensis, L. (V.)
guyanensis e L. (V.) mexicana. Essa forma atinge indivíduos imunocompetentes, capazes de
montar uma resposta imune celular contra Leishmania, mas que possuem uma diminuição
periférica da resposta do tipo Th1, permitindo, desse modo, a disseminação do parasito por via
hematogênica ou linfática. Após o aparecimento da primeira lesão, dar-se início ao período
metastásico, no qual, os acometidos apresentam, durante alguns dias, sintomas como mal-estar,
astenia, febre e náusea. Em seguida, as lesões disseminadas aparecem simultaneamente ou de
forma progressiva. Essas lesões tipicamente são pequenas úlceras granulomatosas,
acneiformes, papulares, e numerosas, podendo atingir diferentes regiões anatômicas e afetar a
mucosa. A Leishmaniose Cutânea Disseminada apresenta boa resposta terapêutica
(HASHIGUCHI et al., 2016; OPS, 2019a; MACHADO; PRATES; MACHADO, 2019).
A Leishmaniose Cutânea Difusa (Figura 12D) é uma forma rara e grave gerada pela
acentuada proliferação e disseminação dos parasitos devido à ausência de resposta celular
específica em indivíduos com condição imune subjacente (anergia). No Brasil, essa
manifestação está associada a infecção por L. (L.) amazonensis. As lesões difusas são
caracterizadas por múltiplas pápulas que não se ulceram e formam nódulos cutâneos, de aspecto
lepromatoso, com abundante quantidade de parasitos. A LC difusa possui resistência aos
medicamentos disponíveis, gerando recaídas com frequência e cronificação das lesões
(BRASIL, 2017; HASHIGUCHI et al., 2016; OPS, 2019a).
A Leishmaniose Mucocutânea (Figura 12E) é uma complicação da LC decorrente da
extensão
de
lesões
próximas
a
mucosa
como
lábio,
ou
devido
à
metástase
hematogênica/linfática. No Brasil a L. (V.) braziliensis é a espécie associada à essa forma
clínica. Essa manifestação pode apresentar-se simultaneamente às lesões ativas preexistente ou
em um processo de recidiva. A mucosa oral e nasal são as mais acometida. Nessas regiões há
uma inflamação intensa, em virtude da resposta imune hiperérgica predominantemente do tipo
Th1, causando lesões infiltrativas e proliferativas com severa destruição tecidual. As infecções
bacterianas secundárias são frequentes e podem veloluir para pneumonia por aspiração. As
lesões não se curam expontaneamente, necessitando de um tratamento longo e com altas doses
de drogas para seu contrele (BRASIL, 2017; JAMESON, 2020; OPS, 2019a).
As manifestações clínicas provocadas pela infeção por Leishmania, não estão
limitadas apenas a lesões tegumentares. As espécies L. (L.) donovani e L. (L.) infantum (no
Novo mundo denominado de L. (L.) chagasi) possuem um forte tropismo para a visceralização
da infecção, levando ao comprometimento de diferentes órgãos, principalmente baço, fígado,
37
medula óssea e linfonodos, onde se multiplicam em células do sistema fagocitário mononuclear,
gerando o quadro da Leishmaniose Visceral (LV) (Figura 12F). O Brasil, Índia, Sudão, Sudão
do Sul, Etiópia e Quênia, concentram cerca de 90% da carga de LV no mundo (BRASIL, 2014;
OPS, 2019a).
A LV é a forma mais grave de leishmaniose. Na Ásia Meridional essa forma clínica é
conhecida como kala‑azar (febre negra em hindi) e tem como principal agente etiológico a L.
(L.) donovani. No Brasil a forma visceral é provocada pela L. (L.) infantum chagasi. Sem
tratamento 95% dos casos evoluem para óbito (WHO, 2021). Inicialmente, os primeiros
sintomas são a astenia com febre intermitente de longa duração, discreta esplenomegalia
seguida por hepatomegalia e linfadenopatia. Durante o agravamento da doença, observa-se uma
progressiva perda de peso, frequentes quadros hemorrágicos (gengival, epistaxe) e de infecções
oportunistas. O estágio avançado é marcado por severa hepatoesplenomegalia, pancitopenia
(resultante do comprometimento medular), hipoalbuminemia e hipergamaglobulemia
(fundamentalmente de IgG) (DUTHIE et al., 2019; KUMAR; PANDEY; SAMANT, 2020).
Nas infecções por L. (L.) donovani, alguns indivíduos clinicamente curados da LV
podem desenvolver após meses ou anos, uma complicação não letal denominada Leishmaniose
Dérmica Pós-Calazar (LDPC), que é uma forma dermotrópica da infecção primária. O
tratamento
incompleto
ou
tardio
da
LV,
a
exposição
solar
e
o
uso
de
medicamentos imunossupressores são fatores de risco que levam a uma maior incidência de
LDPC. Essa complicação ocorre em menos de 10% dos casos de LV na Ásia e é caracterizada
por erupção cutânea maculares, enquanto na África ela é observada em mais de 50% dos casos
de LV, apresentando-se na forma de lesões papulares. Os pacientes com LDPC são clinicamente
estáveis. Entretanto, ao abrigar parasitos em sua pele, contribuem para a transmissão vetorial
da LV na comunidade, dificultando o controle dessa doença (BURZA; CROFT; BOELAERT,
2018; DNDI, 2019b). Além disso, as epidemias da AIDS agravam ainda mais essa conjuntura,
visto que o status imunológico de indivíduos infectados pelo HIV os tornam mais suscetíveis a
de desenvolver a LV ativa (BRASIL, 2015; SOUSA-GOMES; ROMERO; WERNECK, 2017).
Um fator de risco para desenvolver a forma ativa da leishmaniose, é a coinfecção com
HIV, visto que o status imunológico de indivíduos infectados por esse vírus os tornam mais
suscetíveis a outras infeções. Os primeiros casos de coinfecção entre a Leishmania spp. e o
vírus da imunodeficiência humana (HIV) foram descritos no final da década de 80, e cresceram
nas décadas seguintes devido à disseminação das epidemias da AIDS para áreas rurais em
concomitância com o processo de urbanização das epidemias de leishmaniose, resultando na
sobreposição de ambas na mesma área geográfica. Desde então as coinfecção Leishmania-HIV
38
já foram descritas em 35 países. Pacientes com leishmaniose, coinfectados pelo HIV, requerem
cuidados especiais quanto à indicação terapêutica devido aos efeitos adversos e possíveis
ocorrências de recidivas. Portanto, é recomendável oferecer a sorologia para HIV a todos os
pacientes com leishmaniose em áreas endêmicas. (DNDI, 2019b; ADRIAENSEN et al., 2018;
FONTOURA et al., 2018; OPS, 2019b).
3.2.6 Farmacoterapia
Atualmente não existe nenhum medicamento ou vacina aprovados para uso
profiláticos para prevenção de infecções por Leishmania spp. em humanos (IKEOGU et al.,
2020). Além disso, o arsenal de fármacos disponíveis no mercado para o tratamento da
leishmaniose continua restrito a opções com limitações em termos de custo, vias de
administração e segurança (resistência / toxicidade), o que tem levado ao aumento de falhas
terapêuticas (ARONSON et al., 2016; CHARLTON et al., 2018).
O regime de tratamento da leishmaniose é complexo, pois necessita de abordagem
individualizada que leve em consideração diferentes fatores como: idade do paciente, espécies
de Leishmania, a área geográfica em que a infecção foi adquirida, características clínicas e
coinfecção com outros patógenos. Ademais, é importante um acompanhamento prolongado
juntamente com cuidados de suporte a possíveis comorbidades como infecções secundárias,
desnutrição, anemia e distúrbios hemorrágicos (CDC, 2020; ROATT et al., 2020).
Os diferentes compostos com atividade leishmanicida comercializados na atualidade,
possuem diferentes origens químicas e atuam por meio de diversos mecanismos de ação.
Classicamente, na maioria das regiões endêmicas do mundo, os fármacos de primeira escolha
são os antimoniais pentavalentes (Sb5+), como o estibogluconato de sódio (apresentamdo nome
comercial de Pentostan®) (Figura 13A) e o antimoniato de N-metil glucamina ou antimoniato
de meglumina (Glucantime®) (Figura 13B). Este último é a única formulação de antimonial
disponibilizada pelo Ministério da Saúde no Brasil (BRASIL, 2019; BRUNTON; HILALDANDAN; KNOLLMANN, 2018).
Os antimoniais são administrados aos pacientes em sua forma intramuscular ou,
preferencialmente, intravenosa. No tratamento regular para a forma cutânea são utilizados 10 a
20mg Sb+5/kg/dia entre 20 a 30 dias, enquanto para as formas mucosa ou visceral a posologia
consiste em 20mg Sb+5/kg/dia entre 30 a 40 dias. Na leishmaniose cutânea localizada, outra
opção para tratamento é a administração intralesional (via subcutanea) com intervalos de 15
dias, na qual é injetado um volume necessário para infiltrar a base da lesão (aproximadamente
39
uma a três aplicações de 5 mL), elevando-a e deixando-a intumescida (BRASIL, 2014, 2017,
2019).
Figura 13 – Estrutura química dos principais fármacos para o tratamento da leishmaniose.
Figura 14 – Estratégias para a descoberta de medicamentos baseados em produtos naturais
Figura 8 – Estrutura química dos principais fármacos para o tratamento da leishmaniose.
Fonte: Adaptado de CHARLTON et al., 2018.
A monoterapia com os antimoniais pentavalentes vêm sendo usados como tratamento
padrão para as leishmanioses há mais de 70 anos. Contudo, insucessos terapêuticos têm sido
observados durante esse período em varias regiões. Na Índia, a utilização dessas drogas foi
descontinuada devido aos altos índices de resistência relatados. Nos outros países endêmicos,
o uso dos antimoniais ainda é empregado, porém sua indicação é limitada a pacientes com idade
inferior a 50 anos, que não sejam portadores de cardiopatias, nefropatias, hepatopatias e doenca
de Chagas. Além disso, é contraindicado para coinfectados com HIV e para gestantes (BRASIL,
2019; CROFT, 2006).
O mecanismo de ação exato pelo qual os Sb5+ exercem a sua atividade leishmanicida
ainda não está bem estabelecido. Algumas hipóteses buscam elucidar a questão. A principal
propõe que o Sb5+ atue como pró-fármaco, sendo reduzidos à Sb3+, responsável pela inibição
de enzimas como a tripanotiona redutase, gerando danos oxidativos às formas amastigotas de
Leishmania spp. Outras hipóteses associam o Sb5+ à inibição de superóxido dismutase (SOD)
e topoisomerase de Leishmania, deflagrando a morte destes parasitos (DEMICHELI et al.,
2002; FRÉZARD et al, 2009, 2013; RAYCHAUDHURY et al., 2005).
40
No início da terapia as intercorrências são raras, entretendo a toxicidade do Sb5+
aumenta
no
decorrer
das
sessões,
gerando
efeitos
colaterais
com:
alterações
eletrocardiográficas, gastrointestinais, pancreatite aguda, insuficiência renal e hepática. As
limitações e riscos intrínsecos do Sb5+ levaram à necesidade de adoção de fármacos alternativos
visando estabelecer tratamentos equilibrados em termos de eficácia e segurança (DNDI, 2019b;
KATZUNG; TREVOR, 2017).
Quando o uso do Sb5+ é contraindicado, ou nos casos onde não há resposta satisfatória,
o tratamento de segunda linha é realizado com a anfotericina B (Figura 13C). A anfotericina
B é um antibiótico poliênico, inicialmente isolado de Streptomyces nodosus, amplamente
administrado como um medicamento antifúngico. Esse fármaco foi aprovado em 1997 pela
FDA para o tratamento da leishmaniose visceral (sua indicação para leishmaniose cutânea ou
mucosa são consideradas off-label). As formulações mais amplamente utilizada na
leishmaniose são o desoxicolato de anfotericina B (Anforicin B®) e a anfotericina B lipossomal
(AmBisome®), esta última apresenta menos efeitos tóxicos sistêmicos (GUERY et al., 2017;
MOSIMANN et al., 2018).
A anfotericina B é administrada por infusão intravenosa em regime de internação
hospitalar. Reações infusionais como febre, calafrios, tremores, hipotensão, cefaleia e
náuseassão são esperadas. Além disso, outros
efeitos adversos observados incluem:
hipocalemia, hipomagnesemia e nefrotoxicidade. O tratamento com anfotericina B demanda
um longo período e embora apresente alta taxa de cura é bastante restritiva devido seu alto
custo. Seu mecanismo de ação decorre da seletividade dessa droga ao ergosterol, que é um
componente da membrana da Leishmania, gerando poros que levam a um desequilíbrio
osmótico culminando na morte do parasito. (BRASIL, 2019; CDC, 2020; MOSIMANN et al.,
2018; RODRIGO et al., 2018).
Outros agentes parenterais usadas em casos de hipersensibilidade ou falência dos
antimoniais e da anfotericina B são a pentamidina e paromomicina. A pentamidina, cuja
estrutura química está disposta na Figura 13D, é uma diamina aromática concebida
originalmente para uso como hipoglicemiante, que mais tarde veio apresentar atividade contra
protozoários tripanossomatídeos e contra P. jiroveci. Esse fármaco é comercializada para uso
humano sob a forma de um sal isetionato (Di-B-Hidroxietano Sulfonato) (BRUNTON; HILALDANDAN; KNOLLMANN, 2018; KATZUNG; TREVOR, 2017). No tratamento das
leishmanioses o seu esquema posológico consiste em 3-4 mg/kg/dia, em dias alternados, de três
a dez doses dependendo da região e da forma clínica (BRASIL, 2017).
41
O mecanismo de ação da pentamidina possivelmente inclui a atuação na inibição da
S-adenosil-L-metionina e de outras enzimas que participam do metabolismo das poliaminas.
Além disso, evidências sugerem que a pentamidina ligar-se ao DNA do cinetoplasto, gerando
desequilíbrio oxidativo e interferindo na replicação e transcrição (KAUR; RAJPUT, 2014; NO,
2016).
Apesar de exibir notável seletividade de ação, a pentamidina está associada a uma
acentuada toxicidade, que faz com uma parcela dos indivíduos tratatos exibam alguns efeitos
adversos como hipotensao, cefaleia, nauseas, vomitos, insuficiencia renal, pancreatite,
hipoglicemia que pode evoluir para o diabetes mellitus tardio. Essa elevada toxidade e a menor
eficácia quando comparada com a anfotericina B, levou a um declínio gradual do seu uso na
monoterapia das leishmanioses, não sendo mais prescrito rotineiramente na atualidade para essa
finalidade, com exceção de regiões onde há predomínio de L. (V.) guyanensis (CHARLTON et
al., 2018; OPS, 2019a).
A paromomicina (Figura 13E) é um antibiótico aminoglicosídeo de amplo espectro
obtido a partir de algumas espécies de Streptomyces, sendo utilizado como sal de sulfato
inicialmente para tratamento oral de infecções parasitárias intestinais. Sua administração
intramuscular de 11 mg/kg durante 21 dias foi testada na Índia como monoterapia para LV e
demonstrou uma taxa de cura de 95%, levando o governo indiano a aprovar em 2006 o seu uso
para essa doença. Diferentemente dos resultados positivos encontrados na Índia, os testes
realizados na África Oriental (Sudão, Etiópia e Quênia) a eficácia da paromomicina foi
significativamente menor, sugerindo que há diferenças na capacidade dos pacientes africanos
de responder ao medicamento ou na suscetibilidade dos parasitos dessas regiões em comparação
com os da Índia (CHAKRAVARTY; SUNDAR, 2019; HAILU et al., 2010).
A paromomicina age principalmente sobre o ribossomo citoplasmático da Leishmania,
inibindo a síntese proteica e consequentemente causando efeitos deletérios no parasito
(SHALEV-BENAMI et al., 2017). Uma vantagem da paromomicina é seu baixo custo
comparado a outros fármacos usados na leishmaniose (DNDI, 2019a). Embora seja considera
um medicamento relativamente seguro, alguns indivíduos podem manifestar
efeitos
secundários como cólicas abdominais e náuseas, além de reações adversas mais significativas
como hepatotoxicidade, ototóxicidade reversível e mais raramente, nefrotóxicidade
(JAMESON, 2020).
A administração parenteral é um dos principais inconveniente no tratamento das
leishmanioses, haja vista que esse procedimento exige que os pacientes se desloquem à
unidades de saúde para serem atendidos por profissionais capacitados, e em alguns casos há
42
necessidade, também, de internação. Essas condições se contrapõe à realidade de
vulnerabilidade socioeconômica de grande parte dos portadores da doença. Portanto, nota-se
que nessa conjuntura, o desenvolvimento de medicamento para uso por via não invasivas é
imprescindível para que haja uma melhora no contexto global do acesso e adesão terapêutica
na leishmaniose (SOUZA, 2020). Nesse sentido a terapia tópica com cremes à base de
paramomicina isoladamente ou combinado com outras drogas com a gentamicina, foram
desenvolvidas e podem ser boas alternativas ao atual padrão de tratamento de leishmaniose
cutânea nos casos onde a terapia parenteral não é viável (KIM et al., 2009; SOSA et al., 2019).
Outras opções de terapias não parentais são a miltefosina e sitamaquina, ambas de uso oral
(CHARLTON et al., 2018).
A Miltefosina (Figura 13F) é uma alquilfosfocolina originalmente desenvolvida na
década de 1980 como um agente antineoplásico para o tratamento de câncer de mama e outros
tumores sólido (BENNETT; DOLIN; BLASER, 2015; REIMÃO; PITA PEDRO; COELHO,
2020). Em 1995 a OMS firmou uma parceria público-privada com a empresa farmacêutica,
Asta Medica para redirecionar essa droga para novas aplicações terapêuticas, visando o
combate à doenças tropicais negligenciadas. Essa parceria gerou estudos clínicos realizados na
Índia, nos quais foi observado a eficácia da miltefosina administrada por via oral no tratamento
da LV, sendo então esse medicamento registrado em 2002 nesse país. Em 2014, a FDA aprovou
a miltefosina para tratamento de todas as manifestações clínicas da leishmaniose (SUNYOTO;
POTET; BOELAERT, 2018). No Brasil a miltefosina não foi incorporada no protocolo
terapêutico em humanos, o que permitiu que em 2016 fosse emitida a licença do medicamento
importado Milteforan® de uso veterinário (BRASIL, 2016).
O principal mecanismo de ação da miltefosina é pouco compreendido, acredita-se que
esse fármaco apresenta mais de um sítio molecular de ação. De maneira geral, sua atividade
antileishmania envolve: a perturbação do metabolismo lipídico (diminuição na fosfatidilcolina
e aumento de fosfotidiletanolamina); morte celular semelhante à apoptose (inibição da via
PI3K/AKT); disfunção mitocondrial (inibição da citocromo c oxidase); além de efeitos
imunomoduladores (promove resposta Th1) (DORLO et al. 2012).
Em humanos, o regime de tratamento recomendado consiste em uma dose oral de 50
mg de miltefosina duas a três vezes por dia (total de 100-150 mg por dia) durante 28 dias
consecutivos. Distúrbios gastrointestinais foram relatados como efeitos adversos frequentes.
Além disso, elevações discretas nos níveis séricos de transaminases hepáticas e creatinina
podem ocorrer. Entretanto, estas manifestações são tipicamente brandas e reversíveis sem que
haja a necessidade de hospitalizar o paciente durante o uso da miltefosina. Devido a seus efeitos
43
teratogênicos, as mulheres em idade reprodutiva devem realizar teste de gravidez antes de
iniciar a terapia e fazer uso de métodos contraceptivos durante o tratamento e por mais 5 meses.
(BRUNTON; HILAL-DANDAN; KNOLLMANN, 2018; REIMÃO; PITA PEDRO;
COELHO, 2020). Além da teratogenicidade, outras desvantagens da miltefosina são a sua meiavida, significativamente longa, que juntamente com o uso inadequado, têm contribuído para o
número crescente de casos de insensibilidade à miltefosina (CARNIELLI et al., 2019;
KHANRA et al., 2017; SRIVASTAVA et al., 2017).
A sitamaquina (Figura 13G) é uma droga da classe das 8-aminoquinolina,
desenvolvida anteriormente para a malária, e posteriormente apontada como uma possível
alternativa no tratamento da LV. Além de ser administrado por via oral, uma outra vantagem
da sitamaquina é sua meia-vida de eliminação curta, o que evita o rápido surgimento de
resistência. Sua eficácia terapêutica foi verificada em triagens clínicas de fase I e II com
pacientes na Índia, Quênia e Brasil, apresentando taxas de curas contrastantes entre essas
diferentes populações. Os feitos adversos como a metemoglobinemia e nefrotoxicidade têm
sido os principais gargalos no desenvolvimento dessa medicação (LOISEAU; COJEAN;
SCHRÉVEL, 2011; SUNDAR; CHAKRAVARTY, 2015).
O mecanismo de ação da sitamaquina na Leishmania envolve a inibição de succinatoQ redutase (complexo II da cadeia respiratória), que por sua vez desencadeia o estresse
oxidativo pela produção de EROs e aumento do Ca 2+ intracelular, gerando uma morte
semelhante à apoptose dos parasitos (CARVALHO et al., 2011).
Ainda há muito o que avançar no desenvolvimento clínico e licenciamento de novos
composto para monoterapia ou como parte de uma terapia combinada para leishmaniose,
entretanto as expectativas são preocupantes. Segundo o relatório do G-Finder 2019 – principal
plataforma de monitoramento do setor global de P&D de novos produtos e tecnologias para
doenças negligenciadas – na última década, houve uma queda de quase 10% no financiamento
do setor (PCR, 2020). As projeções para os próximos anos indicam um agravamento na
diminuição do financiamento voltado às DTNs, devido aos desafios financeiros gerados pela
pandemia do COVID-19 (DE SOUZA et al., 2020).
44
Quadro 3 – Via de administração, efeito colateral/adverso e contraindicação dos principais
fármacos usados no tratamento da leishmaniose.
Fármaco
Vias de
administração
Intramuscular
Antimoniais
Pentavalentes a
Desoxicolato de
anfotericina B a
Intravenosa
Intralesional
Intravenosa
Efeito colateral / adverso
Contraindicação
Mialgias, artralgias, cefaleia,
anorexia, náuseas e febre,
aumento de transaminases,
fosfatase alcalina, amilase, lipase,
ureia e creatinina, diminuição da
hemoglobina e de leucócitos e
auterações de eletrocardiograma.
Gestação, hipersensibilidade aos
componentes do fármaco, uso
concomitante de medicamentos
que prolongam o intervalo QTc,
disfunção renal, disfunção
cardíaca e disfunção hepática.
Febre, cefaleia, náuseas, vômitos,
anorexia, tremores, calafrios,
flebite, hipopotassemia, cianose,
hipomagnesemia, hipotensão,
comprometimento da função
renal, anemia e distúrbios do
comporta-mento.
Insuficiência renal, hipersensibilidade à anfotericina B ou outro
componente da formulação.
Intravenosa
Semelhantes aos observados com
a desoxicolato de anfotericina B,
porém com menor frequência e
intensidade.
Pentamidina a
Intramuscular
Dor, induração e abscessos
estéreis no local da aplicação
intramuscular, náuseas, vômitos,
tontura, adinamia, mialgias,
cefaleia, hipotensão, lipotímias,
síncope, hipoglicemia,
hiperglicemia, hipoglicemia,
diabetes mellitus tardio,
elevações de creatinina
fosfoquinase e da desidrogenase
láctica séricas, pancreatite,
arritmias cardíacas, leucopenia,
trombocitopenia, insuficiência
renal aguda, hipocalcemia,
taquicardia ventricular e choque
anafilático.
Gestação, aleitamento, crianças
menores de 1 ano, diabetes
mellitus, intolerância à glicose,
insuficiência renal, insuficiência
hepática, doenças cardíacas ou
hipersensibilidade aos componentes do medicamento.
Paramomicina b
Intramuscular
Intravenosa
Tópico
Cólicas abdominais, náuseas,
hepatotoxicidade,
nefrotóxicidade, ototóxicidade,
eritema, irritação cutânea.
Hipersensibilidade aos componentes do medicamento.
Miltefosina c
Oral
Teratogenicidade,
nefrotóxicidade,
hepatotoxicidade, náuseas,
vômitos, diarreia, dor abdominal,
sonolência, dor de cabeça, e
desconforto geral.
Gestação e hipersensibilidade aos
componentes do medicamento.
Sitamaquina d
Oral
Metemoglobinemia, cianose,
nefrotoxicidade.
Em estudo.
Anfotericina B
lipossomal a
Fonte:
a
BRASIL, 2017;
SCHRÉVEL, 2011.
b
JAMESON, 2020;
c
CHAKRAVARTY; SUNDAR, 2019;
d
LOISEAU; COJEAN;
45
3.3 Pesquisa e desenvolvimento (P&D) de novos fármacos
No início do século XX, em torno de 80% de todos os medicamentos obtidos até aquele
momento, partiram de fontes vegetais (SIDDIQUI et al., 2014; SNEADER, 1997). Contudo,
em 1928, a descoberta acidental da atividade antimicrobiana do fungo Penicillium notatum,
serviu como base da criação de um medicamento revolucionário: a penicilina. O pioneirismo
da penicilina abril novos caminhos na investigação de produtos naturais, que até então era muito
pautada na pesquisa com plantas, agregando a microbiologia aos estudos de farmacologia
(BENNETT; CHUNG, 2001; LERNER, 2004).
Os micro-organismos surgiram na terra – muito tempo antes das plantas, animais e
seres humanos – há aproximadamente 3,5 bilhões de anos. Eles evoluíram durante todo esse
período e hoje ocupam os mais variados habitats do planeta, até aqueles de condições mais
extremas. Dessa forma os micro-organismos desenvolveram a capacidade de biossintetizar uma
exuberante quantidade de produtos naturais com diversas atividades biológicas, tais como
antimicrobiana, antioxidante, anti-inflamatória, antitumoral, antinociceptiva, citotóxica, entre
outras (MARTHO, 1997; SAMUELSSON; BOHLIN, 2009).
Um produto natural é um composto ou substância química proveniente de um
organismo vivo isolado ou de organismos simbiontes, produzidos pelas vias do metabolismo
primário ou secundário desses. Os produtos naturais, inicialmente, podem ser obtidos
diretamente de fontes naturais para, então, ser utilizados como modelos moleculares (protótipo)
em processos de Síntese Química (síntese parcial ou total) para elaboração de produtos
análogos, favorecendo sua produção em larga escala (HANSON, 2003; LAHLOU, 2013). Essa
estratégia é esquematizada na figura 14.
Figura 14 – Estratégias para a descoberta de medicamentos baseados em produtos naturais.
Figura 15 – Mapa da Antártica, destacando o manto de gelo e as áreas de rocha expostaFigura
14 – Estratégias para a descoberta de medicamentos baseados em produtos naturais.
Fonte: Adaptado de LI; LOU, 2018, p.2.
46
As inovações tecnológicas nas áreas de biologia molecular e bioinformática, ocorridos
por volta de 1990, possibilitaram a melhor compreensão dos mecanismos que envolvem a
regulação da biossíntese e expressão de metabolitos secundário, isso permitiu à indústria
farmacêutica desenvolver novas estratégia para pesquisa de entidades químicas bioativas, como
o uso de modernas ferramentas de Modelagem Molecular e Química Combinatória pra formar
coleções de compostos em Bibliotecas Sintética. Essas novas estratégias receberam, ano a ano,
elevados investimentos, entretanto, falharam em proporcionar um expressivo aumento na
descoberta de moléculas ativas inovadoras capazes de chegar a se tornar um medicamento
(HOPWOOD, 2007; VIEGAS JR; BOLZANI; BARREIRO, 2006). Diante desse insucesso, a
indústria farmacêutica retomou o interesse na tradicional bioprospecção de produtos naturais
(especialmente os produtos microbianos) que continuam a fornecer excelentes fontes de
moléculas estruturalmente e quimicamente diversas com enorme potencial de aplicações
terapêuticas (BERNARDINI et al., 2018; PHAM et al., 2019; SANCHEZ et al., 2012;
NEWMAN; CRAGG, 2016).
Inovar a partir de produtos naturais, ou de qualquer outra fonte, é um processo
trabalhoso, caro e bastante longo, devido as inúmeras etapas necessárias (DIMASI;
GRABOWSKI; HANSEN, 2016). Os produtos alvos precisam ser testados quanto a sua
eficácia, segurança, perfil farmacocinético e custo-efetividade, para então serem aprovados
pelas agências reguladoras (LUEPKE; MOHR III, 2017).
Apenas um medicamento entre os 5.000 e 10.000 compostos avaliados na cadeia de
P&D do setor farmacêutico, consegue lograr êxito e chegar ao mercado. Para percorrer todos
esses passos, um medicamento chega a necessitar, em média, mais de uma década de
investimentos contínuos (IFPMA, 2017). O custo associado ao pipeline de desenvolvimento de
novos produtos pela indústria farmacêutica é estimado em US$ 1-2 bilhões (AL SHAER et al,
2019).
O aumento do mercado em economias emergentes, aliado a uma maior rigidez
regulatória nos países desenvolvidos, resultou em uma importante migração de atividades
econômicas e de pesquisa da Europa para esses mercados. Entretanto, os investimentos
ocorridos nesse contexto, tem dado maior ênfase em inovações incrementais. Desse modo, a
produção de medicamentos “me-too” (similares) ou “me-better” (melhorados) ocorre em
detrimento do lançamento de medicamentos verdadeiramente inéditos (EFPIA, 2018; JENA et
al., 2009; PAUL et al., 2010). Perante a essa situação, a produção de medicamentos baseados
na síntese química mostrou-se insuficientemente capaz de responder sozinha, às necessidades
de inovação e de aumento de competitividade no setor. Por isso, as indústrias farmacêuticas
47
buscaram incorporar à suas cadeias de P&D, novas estratégias, visando atender essas demandas
(BERNARDINI et al., 2018). É nessa conjuntura que a biotecnologia surge como uma
oportunidade de fortalecimento e crescimento da inovação terapêutica (PHAM, 2018).
A biotecnologia é a ciência da aplicação controlada de agentes biológicos, como
microrganismos (algas, bactérias, fungos e leveduras) e células (vegetal e animal), de modo a
gerar produtos ou serviços funcionais para fins industriais, agrícolas ou médicos, como objetivo
de melhorar o bem-estar humano (BHATIA; GOLI, 2018). Diferentes áreas do conhecimento
com a bioquímica, biologia molecular e microbiologia, compõem a biotecnologia. Dentre suas
principais técnicas utilizadas, destacam-se a engenharia genética (rDNA), cultura de células,
bioinformática, eletroforese, western blotting, PCR e a clonagem (PANDEY; TEIXEIRA,
2016; SILVEIRA; FUTINO; OLALDE 2002).
No campo médico-farmacêutico (também conhecido como “biotecnologia vermelha”),
suas principais aplicações envolvem os métodos de pesquisa e de produção de moléculas com
atividade terapêutica, que são usualmente chamadas de Biofármacos, Produtos Biológicos ou
simplesmente Biológicos (BHATIA; GOLI, 2018; REIS et al., 2009).
Os Produtos Biológicos são moléculas de elevado peso molecular (proteínas
recombinantes, anticorpos monoclonais, hemoderivados, enzimas e vacinas) e de alta
complexidade estrutural. Essas características impendem que esses produtos sejam produzidos
por meio da síntese química (PHAM et al., 2019).
Diferentemente das drogas quimicamente sintetizadas (também chamadas de
Pequenas Moléculas ou Farmoquímicos), os medicamentos biológicos possuem uma
caracterização molecular difícil, além disso, sua identidade química pode sofrer alterações
devido ao processo e aos insumos empregados na sua fabricação (MAKURVET, 2020).
Apesar dos obstáculos, a revolução biotecnológica expandiu significativamente o
número de novos medicamentos. A participação dos biológicos vem crescendo, tornando-se um
componente cada vez mais importante no mercado farmacêutico. Essa nova classe de
medicamento, tornou possível o desenvolvimento de terapias para necessidades de saúde até
então não tratadas eficazmente com as intervenções tradicionais (FRIEDMAN, 2008;
INTERFARMA, 2012; OGASAWARA; ALEXANDER, 2019).
Uma forma de fortalecer e impulsionar a inovação na biotecnologia é investir na
prospecção de microrganismo de ambientes extremos, como a Antártica, considerando-se que
os seus metabolismos adaptados a condições inóspitas os tornam recursos adequados para a
descobertas de moléculas que podem ser potencialmente convertidas em produtos
biofarmacêuticos de alto valor (GIUDICE, et al., 2020; SILVA, et al., 2018).
48
3.4 Antártica – características ambientais e potencial biotecnológico
A Antártica ou Antártida são termos derivados da palavra “anti-ártico”. A despeito de
ambas as denominações serem aceitas na norma culta da língua portuguesa, praticamente todos
os órgãos públicos envolvidos no Programa Antártico Brasileiro (PROANTAR) utilizam,
preferencialmente, o vocábulo Antártica (BRASIL, 2018).
O continente Antártico fica situado abaixo do paralelo 60 °S e possui cerca de 14
milhões de km2. Menos de 0,5% do seu solo rochoso fica exposto pois grande parte da sua
superfície é permanentemente coberta por um espesso manto de gelo e neve, representando
cerca de 90% da água doce do planeta (Figura 15) (BURTON-JOHNSON et al., 2016;
TERAUDS; LEE, 2016). A temperatura média anual da Antártica varia de -10 °C na costa,
podendo atingir nas partes mais altas do interior até −60 °C (AUSTRÁLIA, 2019). No inverno
o mar ao redor do continente congela formando um cinturão (Pack-ice) de cerca de 1.000 Km,
ampliando a área em 18 milhões de Km2 (PROANTAR, 2020).
Figura 15 – Mapa da Antártica, destacando o manto de gelo e as áreas de rocha exposta.
Figura 16 – Estação Antártica Comandante Ferraz (EACF)Figura 15 – Mapa da Antártica,
destacando o manto de gelo e as áreas de rocha exposta.
Fonte: Adaptado de INCT-CRIOSFERA, 2013, p. 3.
49
O esquema tradicional de classificação de zoneamento da Antártica divide a região em
três principais topônimos: (1) Antártica continental – região mais interna e de alta latitude,
representa a principal massa continental. Ela é cortada pelas Montanhas Transantárticas que a
divide nas sub-regiões: ocidental e oriental; (2) Antártica marítima – corresponde à costa oeste
da Península Antártica e ilhas adjacentes; (3) zona Sub-Antártica – inclui as ilhas espalhadas
no oceano austral como a: Geórgia do Sul, Bouvet, Kerguelen, Heard & Macdonald, Prince
Edward, Crozet e Macquarie (TERAUDS et al., 2012).
A Antártica não possui povos nativos e até hoje não tem população permanente,
somente uma população provisória composta por cientistas expedicionários e pessoal de apoio
presentes nas 70 estações polares, que são dedicadas exclusivamente a pesquisa (FIOANTAR,
2020). Esse continente não está sob posse exclusiva de nenhum país, sua gestão é regida pelo
Tratado da Antártica que entrou em vigor em 1961 e o Protocolo de Madri (1998). Atualmente
o tratado possui 50 signatários, dos quais, 29 nações (incluindo o Brasil) têm status consultivo.
Durante as últimas seis décadas em que o tratado está em vigência, a antártica se mantém uma
zona desmilitarizada com proibição de mineração e proteção de recursos biológicos (DODDS,
2019; USAP, 2020).
O Brasil aderiu ao Tratado da Antártica em 1975. Em 1982, por meio do PROANTAR
houve a primeira Operação Antártica Brasileira (OPERANTAR I). Em 1984 foi estabelecida a
Estação Antártica Comandante Ferraz (EACF), localizada na Península de Keller, no interior
da Baía do Almirantado, Ilha Rei George. A estação permaneceu ocupada continuamente entre
1986 até 2012, quando foi acometida por um incêndio que afetou 70% das instalações. Apesar
da perda, as atividades científicas brasileiras no continente não pararam. Em janeiro de 2020 a
nova EACF foi inaugurada (Figura 16). A instalação possui 4.500m², com capacidade para
abrigar até 64 pessoas (BRASIL, 2020).
Figura 16 – Estação Antártica Comandante Ferraz (EACF).
Figura 17 – Aspecto do cultivo bacteriano em meio líquidoFigura 16 – Estação Antártica
Comandante Ferraz (EACF).
Fonte: ESTUDIO 41, 2020.
50
O ambiente Antártico reúne uma variedade de condições extremas, que além das
baixas temperaturas, possui características geoquímicas desafiadoras, tais como os constantes
ciclos de congelamento e descongelamento, hipersalinidade e intensa radiação solar. Em
conjunto, essas condições exercem uma pressão evolutiva, que seleciona comunidades
microbianas com adaptações metabólicas que envolve a produção de compostos bioativos como
estratégia de sobrevivência (BRATCHKOVA; IVANOVA, 2011; SCHULTZ; ROSADO,
2019; WONG et al., 2019). Estes microrganismos sobrevivem à essas condições adversas
devido à diversidade bioquímica e metabólica que lhes permitem produzir um conjunto de
moléculas orgânicas únicas – como extremólitos, extremozimas e crioprotetores – para a
proteção de suas estruturas celulares. Desse modo, bactérias, fungos filamentosos, leveduras e
microalgas resistem e se desenvolvem em locais com níveis extremos de estresse físico e
oxidativo, típicos do deste continente (BECKER; WITTMANN, 2020; MAURYA et al., 2020).
Uma variedade de estudos de análises espaciais da Antártica tem identificado diversas
regiões biogeográficas distintas tanto nos sistemas terrestres como marinhos. Essas pesquisas
demonstram que a biodiversidade da Antártica é muito mais extensa e ecologicamente
estruturada do que se imaginava anteriormente (CHOWN et al., 2015; TERAUDS et al., 2016).
A microbiota representa a maior parte da biodiversidade da Antártica (CHOWN et al.,
2015). Essa região foi colonizada com sucesso por microrganismos psicrófilos (cresce a
temperaturas abaixo de 15 °C), xerofílicos (adaptados à baixa disponibilidade de água),
oligotróficos (adaptados à escassez de nutrientes), halófilos (adaptados à ambiente salino) e
radiorresistente (tolerantes à radiação ionizante) que se espalham nos diferentes substratos
disponíveis, como gelo, solos, rochas, fezes de animais, penas de pássaros, além de serem
abrigados em briófitas, líquenes, macroalgas e esponjas marinhas (CHOWN et al., 2015,
SAVOCA et al., 2019; ZUCCONI et al., 2020).
Os raros eventos de dispersão natural permitiram que a biota da Antártica evoluísse e
se diversificasse em relativo isolamento (BARNES et al., 2006). Para manter o metabolismo,
sustentar o seu crescimento e reprodução em meio as rigorosas condições da Antártica, os
microrganismos se adaptaram, passando por uma gama de ajustes metabólicos, estruturais e
funcionais em suas membranas, sistemas energéticos e seu maquinário de síntese de proteínas
e enzimas, para dessa forma resistirem aos fatores ambientais bióticos e abióticos (TRIPATHI
et al., 2018; ZUCCONI et al., 2020). Além disso a diversificação microbiana, é favorecida pela
transferência horizontal de genes entre táxons, resultando em grande diversidade bioquímica.
Ao longo do tempo essas trocas contribuem para a formação de táxons filogenéticos distintos e
51
para a evolução de genes biossintéticos de metabólitos secundários em resposta às pressões do
ecossistema inóspito da Antártica (PURVES et al., 2016).
Diversas novas ferramentas desenvolvidas recentemente nos campos de análise,
planejamento e otimização experimental em microbiologia e bioquímica, em combinação com
os avanços na tecnologia de sequenciamento, tem ajudado na compreensão crescente sobre o
potencial metabólico de microrganismo da Antártica. Isso tem impulsionado o interesse na
exploração dos recursos naturais desse continente na busca por compostos bioativos (CHOWN
et al., 2015; TIAN; ZHAO, 2017).
3.4.1 Metabólitos microbianos com atividade biológica de importância clínica
Os microrganismos da Antártica são produtores excepcionais de metabólitos
secundários, como alcaloides, carboidratos, esteroides, lipídios, peptídeos, policetídeos e
terpenóides. Essas moléculas evolutivamente refinadas e versáteis desempenham um papel
fundamental nas interações inter e intra-específicas dentro das comunidades microbianas,
fornecendo vantagens competitivas sobre outros microrganismos. Além disso, essas estruturas
químicas únicas também podem ser usadas como condutores terapêuticos para doenças
humanas (O’BRIEN; WRIGHT, 2011; ZUCCONI et al., 2020).
Atualmente, muitas pesquisas têm examinado um grande número de compostos
derivados de microrganismo antárticos (GIORDANO, 2020; TRIPATHI et al., 2018). Esses
estudos têm levado a novos insights sobre moléculas químicas de extremófilos, levantado
evidências concretas sobre as atividades biológicas desses produtos, e de seu grande potencial
em aplicações biotecnológicas e farmacêuticas. Dessa forma, os microrganismos da Antártica
desempenham um papel central nos esforços para descoberta de medicamentos para tratamento
de doenças infecciosas e oncológicas (GIORDANO, 2020; TRIPATHI et al., 2018).
A investigação química da bactéria Gram-negativa Aequorivita sp., isolada de
sedimentos rasos do mar Antártico, resultou no isolamento de quatro aminolipídios que
mostraram atividade antimicrobiana moderada in vitro contra Staphylococcus aureus resistente
à meticilina (MRSA) (CHIANESE et al., 2018). Em outro estudo, amostras de sedimentos
marinhos da Antártica, coletadas a 20 m de profundidade, levou ao isolamento da cepa de
Pseudomonas BNT1 e a purificação dos extratos dessa cepa produziu dois ramnolipídeos que
exibiram efeito antimicrobiano contra Burkholderia cepacia, B. metallica, B. seminalis,
B. latens e S. aureus. Além disso, um terceiro ramnolipídeo apresentou atividade moderada
(MBC de 100 μg/mL) contra S. aureus (TEDESCO et al., 2016).
52
A análise do extrato bruto etanólico rico do pigmento violaceína da bactéria
psicrotolerante Janthinobacterium lividum ROICE173, isolada da neve da região antártica,
mostrou efeito antimicrobiano contra cepas de MRSA e MSSA, e também foi ativo contra cepas
de Enterococci (E. avium, E. fecalis E. faecium) e Enterobacteriaceae (Citrobacter,
Escherichia coli, Klebsiella, Morganella, Salmonella, Yersinia) (BARICZ et al., 2018). Mais
recentemente, a investigação do extrato purificado de violaceína da bactéria não patogênica
Iodobacter sp. 7MAnt, isolada de lagoa localizada na Ilha Rei George – Antártica, demonstrou
que esse pigmento possui atividade também, contra Pseudomonas aeruginosa (ATALAH et al.,
2020).
Em Silva et al. (2018) um total de 326 isolados bacterianos, distribuídos em 39 gêneros
diferentes, foram recuperados de diferentes locais da Antártica e posteriormente identificados.
A triagem antimicrobiana revelou quinze isolados capazes de inibir o crescimento de pelo
menos uma das cepas: Escherichia coli, Micrococcus luteus, S. aureus, Bacillus subtilis e
Candida albicans. Um dos isolados identificado com Pseudomonas sp. exibiu ampla faixa
antimicrobiana, além disso seu extrato de hexano apresentou atividade anti-Trypanosoma cruzi
e promoveu a inibição do crescimento de linhagens de U251 (glioblastoma) e NCI-H460
(carcinoma de pulmão de células não pequenas).
Outras iniciativas também visaram explorar do potencial antiproliferativo em células
tumorais humanas. A investigação do microbioma associado a fanerógamas comumente
encontradas na Antártica (Deschampsia antarctica Desv.) levou ao isolamento de cepas de
Streptomyces sp. Os metabólitos secundários das cepas CMAA 1527 e CMAA 1653
apresentaram atividades antiproliferativas contra as células cancerosas humanas U251
(glioblastoma), MCF-7 (adenocarcinoma de mama); 786-0 (adenocarcinoma de rim), NCIH460 (carcinoma de pulmão de células não pequenas) (SILVA et al., 2020).
Assim como as bactérias, os fungos antárticos também foram explorados em busca de
compostos com atividade biológica. O extrato etanólico do fungo antártico Purpureocillium
lilacinum, apresentou alto nível de atividade antimicrobiana contra E. coli, S. aureus,
P. aeruginosa,
C.
albicans,
Candida krusei,
Cladosporium
sphaerospermum
e
Paracoccidioides brasiliensis, como também, efeito antiprotozoário (L. amazonensis e T. cruzi)
e ação citotóxica em células tumorais humanas mamárias (MCF-7) e renais (TK-10), com
toxicidade moderada para células normais (GONÇALVES et al., 2015).
Sun et al. (2020) descreveram novos tripeptídeos cíclicos, obtidos a partir do extrato
de acetato de etila do fungo Aspergillus insulicola, isolado de uma esponja não identificada da
Antártica. O tripeptídeo M e N mostraram ampla atividade antimicrobiana contra um painel de
53
cepas patogênicas, incluindo Bacillus cereus, Proteus sp., Mycobacterium phlei, Bacillus
subtilis, Vibrio parahemolyticus, Edwardsiella tarda, MRSA e Sstafilococcus coagulasenegativos resistentes à meticilina.
Ogaki et al. (2020) acessaram bibliotecas de fungos cultiváveis presentes em
sedimentos de três lagos da Península de Fildes, Antártica. Os extratos de acetato de etila de
Penicillium chrysogenum e Penicillium solitum demonstraram atividade antifúngica
contra Cladosporium sphaerospermum. Extratos de P. chrysogenum, Penicillium palitans e
P. solitum exibiram altas atividades contra T. cruzi. Além disso, os extratos de Penicillium alliisativi, P. chrysogenum, P. palitans, e P. solitum demonstraram atividade contra Plasmodium
falciparum. Os extratos de Penicillium, Acremonium fusidioides e Pseudogymnoascus
verrucosus apresentaram fraca atividade contra L. amazonensis.
Buscando avaliar o potencial terapêutico de metabólitos fúngicos contra doenças
tropicais negligenciadas, De Menezes et al. (2020) recuperaram fungos presentes em
fragmentos de gelo glacial coletados em diferentes locais da Península Antártica. A análise dos
extratos de Penicillium spp., P. chrysogenum e P. palitans apresentaram atividades contra
T. cruzi
e
L. amazonensis.
Em
um
estudo
semelhante,
os
extratos
de
Pseudogymnoascus destructans, Mortierella parvispora e P. chrysogenum, isolados de
amostras de solo superficial coletadas em diferentes regiões da Antártica, exibiram atividade
contra L. amazonensis e T. cruzi. (GOMES et al., 2018).
Diante dos diferentes relatos encontrados na literatura quanto à eficácia de compostos
naturais derivados de microrganismos antárticos em aplicações terapêuticas, fica evidente a
potencialidade desses produtos para o combate de diversas doenças. Apesar disso, ainda não há
nenhum medicamento disponível proveniente de microrganismos antárticos, entretanto, os
resultados preliminares reportados são encorajadores. Portanto, mais estudos devem ser
conduzidos para embasar pesquisas clínicas futuras.
54
4 METODOLOGIA
4.1 Estudo experimental: Produção dos extratos bacterianos e ensaios farmacológicos
4.1.1 Obtenção dos produtos naturais oriundos de bactéria antárticas
Amostras de bactérias coletadas na Antártica foram cedidas pelo Prof. Dr. Alysson
Wagner Fernandes Duarte (Campus Arapiraca/UFAL), participante do projeto MycoAntar:
Diversidade e Bioprospecção de Fungos da Antártica. Os microrganismos foram isolados de
amostras de sedimentos e de liquens coletados no Continente Antártico em duas expedições ao
polo sul pela Equipe Brasileira de Pesquisa (OPERANTAR XXXIV e XXXVI, verões de
2015/2016 e 2017/2018, respectivamente).
Ao todo foram avaliados oito isolados bacterianos conforme demonstrado no Quadro
4. Os isolados do grupo AN (14. AN. P1, 14. AN. P3, 4. AN. P4) foram obtidos de amostras de
sedimento, assim com os isolados do grupo ANUV (1. ANUV. P4, 2. ANUV. P4). Entretanto,
as bactérias desse último grupo apresentaram resistência à luz ultravioleta (30 minutos de
exposição de radiação UVC, usando a lâmpada Osram 30W) em resultados prévios descritos
no nosso grupo de pesquisa (dados não publicados). Os isolados do grupo UVAB (14.
UVAB.11, 4. UVAB.12, 7. UVAB.14) foram obtidos de líquens.
Quadro 4 – Bactérias isoladas do ambiente antártico
Grupo
Código do
microrganismo
AN
14. AN. P1
14. AN. P3
4. AN. P4
ANUV
UVAB
Fonte: Autor (2021).
Origem
Cor da colônia
Ilha Deception (Sedimento)
Ilha Deception (Sedimento )
Amarelo Cítrico
Amarelo
Vermelho
1. ANUV. P4
2. ANUV. P4
Ilha Deception (Sedimento)
Ilha Deception (Sedimento)
Vermelho
Vermelho
14. UVAB. 11–
4. UVAB. 12–
7. UVAB. 14–
Liquens
Liquens
Liquens
Laranja
Amarelo
Vermelho
Ilha Deception (Sedimento)
55
4.1.2 Cultivo e produção de biomassa
O cultivo dos isolados bacterianos foi baseado em método descrito por Silva et al.
(2019) com algumas modificações. Primeiramente, as amostras das bactérias da antárticas,
criopreservada em glicerol 20% (v/v) em freezer à -80°C, foram descongeladas à temperatura
ambiente e semeadas com auxílio de uma alça bacteriológica em Ágar nutriente (AN). As
placas de AN foram então incubadas durante 7 dias a 20 °C. Após o crescimento bacteriano, 3
a 6 colônias com mesma morfologia foram inoculadas em 6 mL de solução salina (0,85%) para
formar uma suspensão homogênea. As suspensões foram padronizadas em espectrofotômetro a
600 nm, com absorbância de 900 a 1000 nm, e, em seguida, transferidas para Erlenmeyer de
250 mL contendo 150 mL de caldo nutriente para serem incubados sob agitação a 150 rpm,
durante 7 dias a 15 °C (Figura 17). Após esse período, as amostras foram transferidas para
tubos tipo falcon de 50 mL e submetidas à centrifugação a 3.500 rpm durante 10 minutos, sendo
descartado o sobrenadante. O pellet formado (que corresponde a biomassa bacteriana) foi
submetido à lavagem com solução salina esterilizada, seguido de congelamento em freezer a 80°C.
Figura 17 – Aspecto do cultivo bacteriano em meio líquido após incubação por 7 dias a 15 ºC
e 150 rpm.
Figura 9 – Diferentes estágios de extração dos pigmentosFigura 17 – Aspecto do cultivo
bacteriano em meio líquido após incubação por 7 dias a 15 ºC e 150 rpm.
Fonte: Autor (2021).
56
4.1.3 Extração de pigmentos intracelulares bacterianos
Para obtenção dos pigmentos intracelulares, as biomassas bacterianas foram
submetidas à extração exaustiva por maceração com metanol P.A conforme descrito por Silva
et al. (2019), com modificações. Todas as etapas da extração foram realizadas sob condições
mínimas de luz para evitar a degradação dos pigmentos. Inicialmente as extrações foram
realizadas em tubos tipo falcon de 50 mL contendo a biomassa bacteriana, juntamente com 5
mL de metanol. As biomassas com solvente foram então agitadas vigorosamente em vortex
(AP59, Phoenix®) e em seguida mantidas por 30 minutos em cuba ultrassônica (USC-750,
Unique®). Após a maceração e lise celular, as amostras foram submetidas à centrifugação a
3.500 rpm durante 10 minutos a 4 °C. Por fim, os sobrenadantes foram cuidadosamente
coletados para não ressuspender a biomassa, e em seguida transferidos para tubos falcon de 15
mL devidamente identificados. Esse processo foi repetido, reduzindo gradativamente o volume
de solvente, até a máxima despigmentação da biomassa (Figura 18C). A confirmação da total
despigmentação da biomassa foi feita observando não somente a coloração do pellet, mais
também, a ausência de pigmento no sobrenadante. As etapas do processo de extração de
pigmento estão ilustradas na Figura 19. As soluções extrativas obtidas foram secas em
dessecador de vidro sob vácuo ao abrigo da luz.
Figura 18 – Diferentes estágios de extração dos pigmentos de bactérias da Antártica.
Figura 10 – Etapas da extração dos pigmentosFigura 11 – Diferentes estágios de extração
dos pigmentos de bactérias da Antártica.
Fonte: Autor (2021).
57
Figura 19 – Etapas da extração dos pigmentos.
Fonte: Autor (2021).
58
4.1.4 Manutenção da linhagem macrófagos
Macrófagos da linhagem J774.A1 foram mantidos em garrafas de cultura em 10 mL
de meio RPMI (Roswell Park Memorial Institute-1640) suplementado com L-glutamina,
piruvato, aminoácidos não essenciais, 10% de soro fetal bovino (Roche), e mantidos em estufa
a 37oC com 95% de umidade e 5% CO2. No momento do uso, as células foram contadas,
ajustadas em meio RPMI suplementado, na concentração de 1 x 105 células/mL e 200 μL dessa
suspensão foi distribuída em placa de 96 poços (Nunc, Denmark) ou 1 x 105 células /poço de
placa de 24 poços com lamínulas.
4.1.5 Determinação da viabilidade celular
Macrófagos da linhagem J774.A1 foram cultivados em placas de 96 poços, na
concentração de 5 x 104 células/poço e incubadas overnight em estufa a 37 ºC com atmosfera
úmida contendo 7% de CO2. Em seguida, os poços foram lavados para remoção das células não
aderentes e posteriormente preenchidos em triplicata com 200 μL dos extratos testados diluídos
em meio RPMI nas concentrações de 100, 30, 10, 1, 3 e 0,3 mg/mL e reincubados por 48h. Os
poços controles foram células cultivadas somente com meio de cultura e 10% de SFB ou células
cultivadas na presença do diluente dos extratos (DMSO, Sigma). A viabilidade celular foi
determinada ensaio de redução de MTT (MOSMANN, 1983) realizando a leitura das
absorbâncias em espectrofotômetro a 550 nm. A viabilidade celular dos macrófagos tratados
com os extratos foi comparada ao padrão de morte obtido nas culturas controle.
4.1.6 Ensaio de viabilidade de promastigotas de Leishmania
As formas promastigotas de L. chagasi e L. amazonensis em fase exponencial tardia
de crescimento, foram centrifugadas e posteriormente resuspensas em meio Schneider
suplementado com 10% de SFB, 2 mM de L-glutamina e 2% de urina humana, para obter uma
concentração de 1x105 parasitos/mL. Em seguida, alíquotas de 100μL dessa suspensão foram
distribuídas em placa de 96 poços. Posteriormente, foram adicionadas em triplicatas, diferentes
concentrações dos extratos bacterianos (100, 30, 10, 1, 3 e 0,3 mg/mL) e anfotericina b (100 a
0,001 μM), como também o controle de veículo DMSO (0,2%) preparadas em meio Schneider
suplementado, para alcançar um volume final de 200μL por poço. A placa então foi incubada
em estufa BOD a 27 oC por 48 horas. Após esse período, o número de parasitos foi determinado
59
utilizando câmara de Neubauer, em microscópio óptico. A inibição causada por cada extrato
foi expressa como uma porcentagem em relação às células cultivadas apenas na presença do
veículo DMSO.
4.1.7 Análise estatística
As análises estatísticas dos dados obtidos no ensaio in vitro foram realizadas por meio
de análise de variância (ANOVA) e testes post-hoc de Tukey, utilizando o GraphPad Prism 5
(GraphPad Software, San Diego, CA, USA Statistical). Os dados foram considerados
significativos quando *p <0,05, **p <0,01 e ***p <0,001 em relação ao diluente dos extratos
DMSO 0,1%.
4.2 Estudo da literatura: Bioprodutos fúngicos com atividade leishmanicida – avaliação
do estado da arte
Para estabelecer o estado da arte da produção científica sobre as evidências quanto à
eficácia da atividade anti-Leishmania de bioprodutos fúngicos foi produzido uma revisão
sistemática da literatura, na qual foram realizadas consultas nas bases de dados do PubMed,
Lilacs e Scielo. A busca dos artigos foi feita entre os meses de novembro e dezembro de 2020,
utilizando os seguintes descritores/termos livres e conectores booleanos: (1) ("Fungi"[Mesh])
AND "Leishmania"[Mesh]; (2) Fungi AND Leishmania; (3) Fungi AND leishmanicidal; (4)
Lichen AND Leishmania e (5) Fungo AND Leishmania. Tendo como critérios de inclusão:
artigos originais com delineamento experimental que testaram o potencial leishmanicida de
bioprodutos (extratos/compostos isolados) obtidos de fungos (com pelo menos um bioprodutos
ativo), e que estejam disponíveis na íntegra, publicados em qualquer período e idioma. Foram
excluídos os artigos que não abordaram o recorte temático proposto ou que não seguiram todos
os critérios de inclusão.
60
5 PRODUTOS
1.
LEISHMANICIDAL AND ANTI-GLIOBLASTOMA POTENTIAL OF ANTARCTIC
MICROBIAL
PRODUCTS:
PHARMACOLOGICAL
EVALUATION
OF
PIGMENTED BACTERIAL EXTRACTS, segundo as normas da ARCHIVES OF
MEDICAL RESEARCH.
2.
LEISHMANICIDAL ACTIVITY OF FUNGAL BIOPRODUCTS: A SYSTEMATIC
REVIEW, segundo as normas da FUNGAL BIOLOGY REVIEWS.
61
5.1 PRODUTO 1
Leishmanicidal potential of antarctic microbial products: pharmacological evaluation of
pigmented bacterial extracts
Márcio Thomaz dos Santos Varjão 1,3, Alysson Wagner Fernandes Duarte 1,4, Luiz Henrique Rosa
4,5
, Magna Suzana Alexandre Moreira 2,3, Aline Cavalcanti de Queiroz 1,3,4 *.
Affiliation
1. Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, Faculdade de Medicina, Universidade
Federal de Alagoas – UFAL / Campus A.C. Simões, Maceió, AL, Brazil.
2. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Instituto de Ciências Biológicas e da
Saúde, Universidade Federal de Alagoas – UFAL / Campus A.C. Simões, Maceió, AL, Brazil.
3. Laboratório de Farmacologia e Imunidade, Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde,
Universidade Federal de Alagoas – UFAL / Campus A.C. Simões, Maceió, AL, Brazil.
4. Laboratório de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia, Complexo de Ciências Médicas,
Universidade Federal de Alagoas – UFAL / Campus Arapiraca, Arapiraca, AL, Brazil.
5. Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais – UFMG, Belo
Horizonte, MG, Brazil.
*Corresponding author: Ph.D. Aline Cavalcanti de Queiroz, Complexo de Ciências Médicas e de
Enfermagem, Universidade Federal de Alagoas, Campus Arapiraca, Av. Manoel Severino Barbosa,
s/n, Bairro Bom Sucesso, CEP 57309-005, Arapiraca, Alagoas, Brazil. E-mail address:
aline.queiroz@arapiraca.ufal.br
Background and Aims
The decline in pharmaceutical innovation has put healthcare systems at risk. Diseases such as
leishmaniasis continue to have unmet pharmacotherapeutic demands. In this context, the
bioprospecting of Antarctic microorganisms is part of a movement that seeks to mitigate the
deficit in drug innovation. Therefore, the present study aimed to evaluate the leishmanicidal
properties of bacterial extracts from Antarctica.
Methods
The bacterial isolates were grown in liquid medium to produce biomass. The intracellular
pigmented metabolites were extracted with methanol and subsequently the extractive solutions
were dried in a vacuum desiccator. The cytotoxicity of the extracts was evaluated in host cells
(macrophages of the J774.A1 lineage) through the MTT colorimetric assay. Leishmanicidal
activity was evaluated in L. chagasi and L. amazonensis promastigote cultures by direct counting
under an optical microscope.
Conclusion
The extracts demonstrated in vitro leishmanicidal activity against L. (L.) chagasi promastigote
forms, but failed to inhibit the growth of L. (L.) amazonensis promastigote forms.
Key Words
Bioprospecting; Extremophiles; Leishmaniasis; Antiparasitic Agents.
62
Graphical abstract:
63
Introduction
Despite the efforts of medicinal chemistry to find new entities with biological activity, there
has been a decline in pharmaceutical innovation in recent decades, with many diseases still
awaiting the emergence of more improved alternatives (1). Medicines, particularly antibiotics,
are an essential medical resource for saving lives, however the options currently available
have gradually lost their effectiveness on human pathogens due to the development of
resistance (2,3). Because of this, infectious diseases such as leishmaniasis continue to be treated
with obsolete drugs, presenting many therapeutic failures (4). In addition, the spread of AIDS
epidemics in areas at risk of transmission of leishmaniasis has resulted in a high number of
cases of co-infected HIV-Leishmania. This overlapping of diseases has undermined
leishmaniasis elimination programs and therefore represents an emerging challenge in global
public health (5).
The maintenance of the double burden of morbidity and mortality from infectious and chronic
diseases has placed an alarming demand on health systems, indicating a global health crisis
(6,7)
. The answer to this scenario must be, among other factors, the expansion of therapeutic
options (8). In this sense, the remodeling or combinations of existing drugs have not
adequately responded to the growing need for innovation, therefore, the search for new
bioactive chemical entities is essential. In view of this, natural products continue to be the
starting points for the development of the main classes of drugs, including antibiotics and
chemotherapeutic agents (9).
The compounds produced by microorganisms, and in particular bacteria, represent the main
source of bioactive molecules. The development of high-throughput (omic) techniques has
greatly increased the understanding of the mechanisms of biosynthesis of microbial secondary
metabolites, triggering a revolution in the search for the discovery of potentially therapeutic
molecules, revitalizing the pharmaceutical industry's interest in natural products (10).
A single bacterial strain can produce a variety of chemically diverse and structurally complex
compounds with different biological properties (11,12), however the rediscovery of already
known compounds hampers innovation, so several strategies seek to improve the likelihood of
identifying unpublished metabolites, among which is bioprospecting of microorganisms in
extreme and little explored environments such as Antarctica (13,14).
64
Antarctica is home to several communities of microorganisms endowed with adaptive
mechanisms and characteristics that allow them to grow and overcome various environmental
challenges with low temperatures, low water availability, nutrient shortages, intense UV
radiation and hypersalinity. These factors exert an evolutionary pressure on the Antarctic
microorganisms, inducing a biochemical and metabolic diversity that allow them to
biosynthesize specialized organic molecules such as antifreeze proteins, heat shock proteins,
cold active enzymes, antioxidant enzymes in addition to several other metabolites such as
amino acids, peptides and polyketides with a remarkable range of biological activities
(15,16,17,18).
Antarctic microorganisms are also excellent pigment producers. Several bacterial isolates
recovered from different Antarctic niches such as soil, ice, lakes and marine sediments, are
often pigmented. Bacterial pigments play a photoprotective and antioxidant function, which is
important for the adaptation process to the Antarctic environment. In addition, these
molecules also have potential applications in medicine, which can act as antimicrobial,
antiparasitic and anticancer agents (19,20,21).
In view of the, the present study was carried out with the objective of producing pigmented
extracts from the biomass of bacteria isolated from soil and lichen samples from the Antarctic
environment and evaluating their leishmanicidal properties against L. (L.) chagasi and L. (L.)
amazonensis promastigotes.
Materials and Methods
Obtaining Antarctic Bacteria
The bacteria used in this study were isolated from sediment and lichen samples collected in
the Antarctic continent on two expeditions to the south pole by the Brazilian Research Team
(OPERANTAR XXXIV and XXXVI, summers of 2015/2016 and 2017/2018, respectively).
In total, eight bacterial isolates were evaluated. The isolates of the AN group (14.AN.P1,
14.AN.P3, 4.AN.P4) were obtained from soil samples, as well as the isolates of the ANUV
group (1.ANUV.P4, 2. ANUV. P4). However, the bacteria in the latter group showed
resistance to ultraviolet light (30 minutes of exposure to UVC radiation, using the Osram
30W lamp). The isolates of the UVAB group (14.UVAB.11, 4.UVAB.12, 7.UVAB.14) were
obtained from lichens.
65
Cultivation and production of biomass
The cultivation of bacterial isolates was based on the method described by Silva et al.(19) with
modifications. First, the isolates were incubated on nutrient agar for 7 days at 20 °C. After
bacterial growth, 3 to 6 colonies with the same morphology were inoculated in 6 mL of saline
solution (0.85%) to form a standardized suspension in a spectrophotometer at 900-1000nm
and then transferred to Erlenmeyer containing 150 mL of nutrient broth for incubated with
shaking at 150 rpm for 7 days at 15 °C. After that period, the samples were transferred to
falcon tubes and subjected to centrifugation at 3.500 rpm for 10 minutes. The formed pellet
(which corresponds to bacterial biomass) was subjected to washing with sterile saline
solution. Finally, the biomasses were frozen in a freezer at -80 °C.
Extraction of bacterial intracellular pigments
All extraction steps were performed under minimal light conditions to avoid degradation of
the pigments. Initially 5 mL of methanol was added to the bacterial biomass. The solvent
samples were then shaken vigorously with the aid of a vortex and then kept for 30 minutes in
an ultrasonic cleaner for maceration and cell lysis. the samples were subjected to
centrifugation at 3.500 rpm for 10 minutes at 4 °C. Finally, the supernatants were collected
and transferred to new duly identified tubes. This process was repeated, gradually reducing
the volume of solvent, until the maximum depigmentation of the biomass. The extractive
solutions obtained were dried in a glass desiccator under vacuum protected from light.
Cytotoxicity assay in macrophages
Macrophages of the J774.A1 strain were grown in 96-well plates, at a concentration of 5 x 104
cells /well and incubated overnight in an oven at 37 ºC with a humid atmosphere containing
5% CO2. Then, the wells were washed to remove non-adherent cells and subsequently filled
in triplicate with 200 μL of the tested substances diluted in RPMI medium in concentrations
of 100, 30, 10, 1, 3 and 0.3 µg/mL and reincubated by 48h. The control wells were cells
cultured only with supplemented culture medium or cells cultured in the presence of the
diluent of the substances (DMSO, Sigma). Cell viability was determined by an MTT
reduction assay (22) by reading the absorbances in a spectrophotometer at 550 nm. The cell
viability of the macrophages treated with the substances was compared to the pattern of death
obtained in the control cultures.
66
Leishmania promastigote viability assay
The promastigote forms of L. chagasi and L. amazonensis at late exponential phase of growth
were centrifuged and subsequently resuspended in Schneider medium supplemented with
10% FBS, 2 mM L-glutamine and 2% human urine, to obtain a concentration of 1x105
parasites/ml. Then, 100μL aliquots of this suspension were distributed in a 96-well plate.
Subsequently, different concentrations of bacterial extracts (100, 30, 10, 1, 3 and 0.3 mg/mL)
and amphotericin b (100 to 0.001 μM) were added in triplicate, as well as the DMSO vehicle
control (0.2%) prepared in supplemented Schneider medium, to reach a final volume of
200μL per well. The plate was then incubated in a BOD oven at 27 ºC for 48 hours. After this
period, the number of parasites was determined using a Neubauer chamber, under an optical
microscope. The inhibition caused by each extract was expressed as a percentage in relation to
cells grown only in the presence of the vehicle.
Statistical analysis
The statistical analysis of the data obtained in vitro assay were performed by means of
analysis of variance (ANOVA) and Tukey's post-hoc tests, using the GraphPad Prism 5
(GraphPad Software, San Diego, CA, USA Statistical). Data were considered significant
when *p <0.05, **p <0.01 and ***p <0.001 in relation to the diluent of 0.1% DMSO extracts.
Results and Discussion
The cultivation in nutrient broth of all bacterial isolates obtained from the Antarctic
environment allowed the production of biomass rich in pigmented metabolites. The use of
methanol to extract intracellular metabolites provided complete depigmentation of bacterial
biomass. The use of a glass vacuum desiccator for drying extractive solutions allowed for a
safe process without the need to raise the temperature of the samples, preventing their
degradation. After drying, the extracts maintained the same colorimetric aspects of the
original bacterial colonies.
The extracts of the AN group obtained from bacteria isolated from sediment (14.AN.P1, 14.
AN.P3 and 4.AN.P4), showed pigments with greenish-yellow, yellow and red stains,
respectively. The two extracts of bacteria resistant to UV light that make up the ANUV group
(1.ANUV.P4 and 2.ANUV.P4) showed red color. The extracts of the isolates from the UVAB
group (14.UVAB.11, 4.UVAB.12 and 7.UVAB.14) obtained from lichens, showed pigments
67
Orange, yellow and red, respectively. The origin and color of the pigmented extracts are
presented in table 1.
Table 1 – Bacteria isolated from the Antarctic environment
Group
Microorganism code
14. AN. P1
Origin
Deception island (Sediment)
Pigment color
Greenish-Yellow
AN
14. AN. P3
Deception island (Sediment)
Yellow
4. AN. P4
Deception island (Sediment)
Red
1. ANUV. P4
Deception island (Sediment)
Red
2. ANUV. P4
Deception island (Sediment)
Red
14. UVAB. 11
4. UVAB. 12
7. UVAB. 14
Lichen
Lichen
Lichen
Orange
Yellow
Red
ANUV
UVAB
AN: bacteria isolated from sediment. ANUV: UV light resistant bacteria isolated from sediment. UVAB:
bacteria isolated from lichens.
Obtaining pigmented compounds produced by Antarctic bacteria has been previously
described by some authors, among them Órdenes-Aenishanslins et al. reported that UVresistant bacteria isolated from soil samples from Antarctica identified as Hymenobacter sp.
and Chryseobacterium sp., are prolific producers of red and yellow pigments, respectively.
The pigments produced by these bacteria were extracted and classified as belonging to the
carotenoids family, specifically the xanthophylls (23). In another study, Reis-Mansur et al.
pointed out the Microbacterium sp. isolate LEMMJ01 as a valuable source of carotenoids
(neurosporene, α-carotene, echinenone, canthaxanthin and astaxanthin). The authors further
demonstrated that these extracted pigments do not induce cytotoxic effects in mouse cells or
in human keratinocytes and fibroblasts (24).
The therapeutic potential of a chemical entity essentially involves the balance between its
ability to exert its intended effect and to generate harm. Therefore, drug prototype toxicity is a
major concern in pharmacology, since safety assessment is a prerequisite during the
development of new chemical entities to be introduced in the market. In this regard, an
important tool to assess the in vitro cytotoxicity of prototypes is the MTT test. This
colorimetric assay is based on the ability of the mitochondrial enzyme succinate
dehydrogenase from viable cells to reduce a tetrazolium salt to formazan which is then
68
solubilized with dimethylsulfoxide (DMSO), allowing its colorimetric measurement. Thus,
the ability of cells to reduce MTT through mitochondrial activity can be interpreted as a
measure of cell viability after exposure to test compounds (25).
In the present study, the MTT assay was used to evaluate the effect of bacterial extracts from
the AN, ANUV and UVAB group on the viability of macrophages of the J774.A1 strain after
48h of treatment (Table 2). The control group was established as cells cultivated only in the
presence of the vehicle used to dilute the extracts (0.2% DMSO). Amphotericin B
deoxycholate (Sigma-Aldrich), a polyenic antibiotic, widely administered as a second-line
treatment in leishmaniasis, was chosen as the standard drug in this trial and showed a
maximum cytotoxicity of 93.76 ± 0.34% and an IC50 of 23.96 ± 1.32 µM. All eight tested
extracts showed an IC50 greater than 100µg/ml, and did not show cytotoxic activity, when
compared to the 0.2% DMSO group.
Table 2 – Effect of bacterial extracts of lichens and sediment from Antarctica (100, 30, 10, 3,
1 and 0.3 µg/mL) and Amphotericin B (100 to 0.001 μM) on the viability of macrophages
J774.A1 strain in the MTT assay.
a
Treatment
IC50 a ± SEM
Maximum cytotoxicity ±SEM (%) b
14. AN. P1
> 100 µg/ml
NC
14. AN. P3
> 100 µg/mL
NC
4. AN. P4
> 100 µg/mL
NC
1. ANUV.P4
> 100 µg/mL
NC
2. ANUV.P4
> 100 µg/mL
NC
14. UVAB.11
> 100 µg/mL
NC
4. UVAB.12
> 100 µg/mL
NC
7. UVAB.14
> 100 µg/mL
NC
Amphotericin B
22.14 ± 1.2 µg/mL
(23.96 ± 1.32 µM***)
93.76 ± 0.34***
50% inhibitory concentration of J774.A1, calculated using concentration-response curves. bMean ± standard error
of the mean of the maximum effect on the viability of J774.A1, in triplicates of a representative experiment.
Maximum effect values were significant when ***p <0.001 compared to the 0.2% DMSO group. NC: non-cytotoxic
effect determined up to the maximum concentration tested, when compared to the 0.2% DMSO group.
69
The bacterial extracts were then tested for biological activity against L. (L.) chagasi and L.
(L.) amazonensis species. Therefore, viability tests were carried out on promastigote forms
during 48h of treatment. As shown in Table 3, the pigmented extracts did not show
antiparasitic activity against the promastigote forms of L. (L.) amazonensis at any of the
concentrations tested. On the other hand, all extracts were able to inhibit L. (L.) chagasi
promastigotes in a statistically significant way, highlighting 14.AN.P1 (maximum effect of
89.08 ± 0.84 and IC50 of 63.04 ± 5.49 µg/mL), 2.ANUV.P4 (maximum effect of 73.28 ± 0.76
and IC50 of 91.19 ± 3.69 µg/mL), 14.UVAB.11 (maximum effect of 87.79 ± 0.76 and IC50 of
52.65 ± 2.91 µg/mL), 4.UVAB.12 (maximum effect of 100.0 ± 0.00 and IC50 of 36.83 ± 2.61
µg/mL), and 7.UVAB.14 (maximum effect of 74.05 ± 3.05 and IC50 of 78.10 ± 4.42 µg/mL).
The standard drug amphotericin B, inhibited, at the maximum concentration tested, 100.00 ±
0.00 % of the growth of Leishmania parasites of both species, presenting IC50 of 0.32 ± 0.02
μM and 0.13 ± 0.01 μM against L. (L.) chagasi and L. (L.) amazonensis, respectively.
Table 3 – Effect of bacterial extracts of lichens and sediment from Antarctica (100, 30, 10, 3,
1 and 0.3 µg / mL) and Amphotericin B (100 to 0,001 μM) on the viability of Leishmania
promastigote assay.
L. chagasi promastigote
Extract
a
L. amazonensis promastigote
IC50a ± SEM
Maximum Effectb ± SEM
(%)
IC50 ±SEM
Maximum Effectb ±
SEM (%)
14.AN.P1
63.04 ± 5.49 µg/mL
89.08 ± 0.84 ***
> 100 µg/mL
NA
14.AN.P3
> 100 µg/mL
37.82 ± 0.84 *
> 100 µg/mL
NA
4.AN.P4
> 100 µg/mL
32.77 ± 0.84 *
> 100 µg/mL
NA
1.ANUV.P4
> 100 µg/mL
ND
> 100 µg/ml
NA
2.ANUV.P4
91.19 ± 3.69 µg/mL
73.28 ± 0.76 ***
> 100 µg/mL
NA
14.UVAB.11
52.65 ± 2.91 µg/mL
87.79 ± 0.76 ***
> 100 µg/mL
NA
4.UVAB.12
36.83 ± 2.61 µg/mL
100.0 ± 0.00 ***
> 100 µg/mL
NA
7.UVAB.14
78.10 ± 4.42 µg/mL
74.05 ± 3.05 ***
> 100 µg/mL
NA
Amphotericin B
0,30 ± 0.02 µg/mL
(0.32 ± 0.02 μM)
100 ± 0.00 ***
0.12± 0.01 µg/mL
(0.13 ± 0.01 μM)
100.00 ± 0.00***
50% inhibitory concentration of Leishmania promastigote, calculated using concentration-response curves. bMean
± standard error of the mean of the maximum effect on the viability of Leishmania promastigote, in triplicates of
a representative experiment. Maximum effect values were significant when *p <0.05, **p <0.01 and ***p <0.001
compared to the 0.2% DMSO group. NA: extract is not active, when compared to the DMSO group.
70
Only two works are found in the literature about leishmanicidal activity of bacterial pigments.
The first report was from a study conducted by Leon et al., which demonstrated the
leishmanicidal activity of a purple pigment, extracted from Chromobacterium violaceum,
called violacein. This pigment had an IC50/24h value of 4.3 ± 1.15 μmol/L against L. (L.)
amazonensis promastigotes (26). More recently, Numan et al., investigated the activity of a
yellow pigment extracted from the bacterium Arthrobacter gandavensis and observed through
an MTT assay that the treatment with 100μg/mL inhibited 43.91 ±1.21% against L. (L.)
tropica promastigotes (27). Therefore, both studies, as well as the results observed in the
present work, corroborate the leishmanicidal biotechnological potential of bacterial pigmented
metabolites, which should be more explored. The present study is the first work to report the
leishmanicidal activity of Antarctic bacteria pigments.
The genus Leishmania encompasses parasites from different geographically and genetically
isolated populations that form a mosaic of phylogenetically distinct species, which reflects the
ability of this group to parasitize a wide range of vertebrate hosts and vectors, but also to
produce different clinical presentations (28,29). The parasites of the species L. (L.) chagasi, for
example, have strong tropism for organs such as the spleen, liver and bone marrow, thus
causing the visceral manifestation of leishmaniasis, while other species such as L. (L.)
amazonensis, are dermotropic, causing integumentary forms (30). In addition to pathogenic
factors, the different species of the genus Leishmania also differ about drug susceptibility
profiles, as observed in the results of the present study.
The molecular and phenotypic heterogeneity present among natural populations of different
species and clinical isolates of Leishmania leads to the emergence of different drug resistance
profiles, even in the absence of previous exposure. This variability makes it difficult to screen
for new compounds with therapeutic potential. In view of this, it has been increasingly sought
to employ new high-throughput sequencing technologies that allow detailed comparative
analyzes at the inter and intra-species level of Leishmania in order to try to elucidate the
genetic factors that contribute to variation in drug resistance of these parasites (31,32).
71
Conclusion
From the biomass of bacteria isolated from the Antarctic environment, it was possible to
obtain extracts with intracellular compounds rich in pigments. These extracts did not show
cytotoxic effect when tested on J774.A1 lineage macrophages in MTT assay. Furthermore, the
extracts demonstrated in vitro leishmanicidal activity against L. (L.) chagasi promastigote
forms, but failed to inhibit L. (L.) amazonensis promastigote forms. Given these results, it is
worth deepening the studies with pigmented bacterial extracts, evaluating their activity and
mechanism of action against amastigote forms in vitro and in an animal model of infection, as
well as on other species of Leishmania.
Conflict of interest
The authors declare no conflicts of interest.
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75
5.2 PRODUTO 2
Leishmanicidal activity of fungal bioproducts: A systematic review.
Márcio Thomaz dos Santos Varjão 1,2, Alysson Wagner Fernandes Duarte 1,3, Luiz Henrique
Rosa4, Magna Suzana Alexandre Moreira 2, Aline Cavalcanti de Queiroz 1,2,3 *.
Affiliation
1. Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, Faculdade de Medicina, Universidade
Federal de Alagoas – UFAL / Campus A.C. Simões.
2. Laboratório de Farmacologia e Imunidade, Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde,
Universidade Federal de Alagoas – UFAL / Campus A.C. Simões.
3. Laboratório de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia, Complexo de Ciências Médicas,
Universidade Federal de Alagoas – UFAL / Campus Arapiraca.
4. Departamento de Microbiologia, Universidade Federal de Minas Gerais, Avenida
Presidente Antônio Carlos, 6627, 31270-901, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil
*Corresponding author: Ph.D. Aline Cavalcanti de Queiroz, Complexo de Ciências Médicas e
de Enfermagem, Universidade Federal de Alagoas, Campus Arapiraca, Av. Manoel Severino
Barbosa, s/n, Bairro Bom Sucesso, CEP 57309-005, Arapiraca, Alagoas, Brazil. E-mail
address: aline.queiroz@arapiraca.ufal.br
Highlights
• Leishmania amazonensis was the most evaluated species (present in 49.6% of the studies).
• Bioproducts with leishmanicidal activity are mainly produced by Penicillium sp. and
Aspergillus sp.
• Most studies (89.8%) performed exclusively in vitro assay.
• Assays with promastigotes are present in 70.1% of in vitro studies.
• Ethyl acetate was the main solvent used to produce the extracts.
• 66.1% of the studies evaluated isolated compounds.
• BALB/c mice is the main animal model (83.8%).
76
Abstract
The genome mining of biosynthetic genes from fungi demonstrates the enormous
pharmacological potential that is still little explored. These results have encouraged the
scientific community to invest in fungi as a source of innovative alternatives for the treatment
of neglected diseases, such as leishmaniasis. Therefore, this work aimed to identify, through a
systematic search in the databases of PubMed, Lilacs and Scielo, the existing evidence in the
literature regarding the efficacy of the leishmanicidal activity of fungal bioproducts that
represent new starting points for the advancement of pharmacotherapy of leishmaniasis.
During the search process, 59 articles met all the eligibility criteria and, therefore, were
included in this review. The studies demonstrate that different prospecting, cultivation,
biotechnological and synthetic modification strategies contribute to the discovery and
development of new therapeutic fungal compounds. 39 (66.1%) of the studies presented at
least one isolated compound with leishmanicidal activity, while 20 (33.9%) evaluated only
crude extracts or semipurified fractions. Terpenes, steroids and quinones were the most
prevalent chemical classes among the isolated compounds. The active compounds are mainly
produced by Penicillium and Aspergillus genera. A large majority (89.8%) of the selected
studies bee conducted in vitro. Only six studies performed in vivo assay. The species of
Leishmania amazonensis and Leishmania donovani were the most evaluated. The results
support the hypothesis of the pharmacological potential of fungal bioproducts in the treatment
of leishmaniasis.
Keywords: Natural product, pre-clinical trial, microbial metabolite, antiparasitic agents.
Graphical abstract:
77
1. Introduction
Fungi constitute a diverse group of organisms that can be found in almost all ecosystems on
Earth (PEAY; KENNEDY; TALBOT, 2016), including extreme environments such as
Antarctic soils (ROSA, 2019) or deep ocean sediments (GROSSART et al., 2019). These
organisms have crucial ecological roles in the regulation of the main processes of ecosystems,
directly influencing the maintenance and composition of fauna and flora communities (PEAY;
KENNEDY; TALBOT, 2016; VĚTROVSKÝ et al., 2019).
After insects, fungi are the second most diverse eukaryotic organisms on Earth
(RAGHUKUMAR, 2017). The scientific nomenclature of fungi is established by the
International Code of Nomenclature for algae, fungi, and plants (TURLAND et al., 2018).
Currently, about 120,000 species of fungi have already been described and it is estimated that
the fungal diversity is between 2.2 to 3.8 million (HAWKSWORTH; LÜCKING, 2017).
Fungi have been challenged by biotic and abiotic pressures over millions of years, causing
adaptations in various aspects of the cellular mechanism such as metabolism, catabolism,
enzymatic activity and gene expression, contributing to the enormous fungal biodiversity.
Reflecting this process is the development of a rich chemical ecology expressed in the wide
production of different metabolite profiles with potent physiological activities (BRAKHAGE,
2013; KELLER, 2019; KELLER; TURNER; BENNETT, 2005; MAFART; COUVERT;
LEGUÉRINEL, 2001; SPITELLER, 2015).
Secondary fungal metabolites commonly belong to four main chemical classes: indole
alkaloids, non-ribosomal peptides, polyketides and terpenes (KELLER; TURNER;
BENNETT, 2005). These fungi-derived bioactive compounds have been the source of many
approved drugs, with various applications, such as hypolipidemic agent (lovastatin,
compactin), antibiotic (penicillin, cephalosporin), anti-inflammatory and immunosuppressant
(ascomycin, mycophenolic acid, cyclosporine A, gliotoxin) (HOEKSMA et al., 2019;
GONZÁLEZ-MEDINA, 2017; KÜCK; BLOEMENDAL; TEICHERT, 2014). In addition,
studies have shown other biological activities of fungal products, such as antineoplastic
(CHEN, 2016; DESHMUKH; PRAKASH; RANJAN, 2018), antiviral (LINNAKOSKI et al.,
2018), antiparasitic (LENZI et al., 2018), among other properties (MASI et al., 2018;
OSMANOVA; SCHULTZE; AYOUB, 2010; SINGH et al., 2017)
78
Given the several examples of successful results and considering that only a small fraction of
the biodiversity of the Fungi Kingdom has been evaluated, the bioprospecting of fungal
products has been established as a valuable starting point for obtaining medicines in the most
diverse therapeutic applications (HOEKSMA et al., 2019). The promising pharmacological
potential of fungal metabolites has boosted the interest of the scientific community in the
search for new alternatives for the treatment of infectious diseases with great relevance in
public health, as is the case of leishmaniasis (NAGLE et al., 2014).
Leishmaniasis is a tropical disease whose etiologic agent is the flagellated protozoan of the
genus Leishmania. These parasites are transmitted by the bite of contaminated sandflies. This
disease has a zoonotic and anthroponotic character, having as main reservoirs (hosts) humans,
wild mammals and domestic dogs (AKHOUNDI et al., 2016; (SASIDHARAN;
SAUDAGAR, 2021). Leishmania is an obligate intracellular parasite that has two
evolutionary forms: the promastigote (flagellate) form present in the vector and the
amastigote (aflagellate) form present in the cells of the host's mononuclear phagocytic system
(BURZA; CROFT; BOELAERT, 2018).
The increase in therapeutic failures, largely due to conditions such as resistance to
chemotherapy, side effects / toxicity and high cost of drugs, has been detrimental to the
eradication of leishmaniasis. In several regions, drugs of the first choice for the treatment of
leishmaniasis continue to be pentavalent antimonials. Other therapeutic options include
amphotericin B, pentamidine, miltefosine and paromomycin (DIDWANIA et al., 2017;
PONTE-SUCRE et al., 2017; ULIANA; TRINCONI; COELHO, 2018).
In the light of these observations, this study aimed to identify, through a systematic search in
electronic databases, the existing evidence in the literature regarding the effectiveness of the
activity of fungal bioproducts that represent new potential alternatives for the treatment of
leishmaniasis.
2. Material and methods
The present study is a systematic review of the literature, in which database searches were
carried out in PubMed (National Library of Medicine / NLM), Lilacs (Latin American and
Caribbean Literature in Health Sciences) and Scielo (Scientific Library Online). The search
for the articles was carried out between the months of November and December 2019, using
79
the following descriptors / free terms and Boolean connectors: (1) ("Fungi"[Mesh]) AND
"Leishmania"[Mesh]; (2) Fungi AND Leishmania; (3) Fungi AND leishmanicidal; (4) Lichen
AND Leishmania e (5) Fungo AND Leishmania.
The inclusion criteria defined to compose the review sample were: original articles with
experimental design that tested the leishmanicidal potential of bioproducts (extracts / isolated
compounds) obtained from fungi (with at least one active bioproduct), and that are available
in full, published in any period and language. Articles that did not address the thematic focus
of this review or that did not follow all inclusion criteria were excluded.
The publications found during the search process were initially evaluated for the title and
reading of the abstract to verify the adequacy regarding the inclusion criteria. After selecting
articles from all databases, repeated articles were excluded. Finally, all articles were read in
full.
Figure 1 - diagram of the study selection process for inclusion in the systematic review.
3. Results
In the process of obtaining the articles, PUBMED was the database that presented the largest
number of results found (Table 1), followed by LILACS and SCIELO respectively. In total
598 results were obtained. Among these, 520 articles were excluded because they did not
address the proposed theme. In addition, there was no exclusion due to incomplete data or
other criteria.
Initially 78 articles were selected by searching the databases. In addition to these, two new
articles were found performing the reading of the references of the included articles, thus
totaling 80 articles. After excluding the repeated studies, 59 studies remained. The articles
80
were coded by the acronym SA-, from the initials of “Selected Articles”, followed by the
article number in descending order from the date of publication.
Table 1 - Number of articles found and selected in the systematic review using different
databases and descriptors.
Database
Descriptors
Results
Selected
("Fungi"[Mesh]) AND "Leishmania"[Mesh]
366
47
PUBMED
Fungi AND leishmanicidal
131
19
Lichen AND Leishmania
6
5
LILACS
Fungi AND Leishmania
81
2
Fungo AND Leishmania
5
2
SCIELO
Fungi AND Leishmania
9
3
Other sources
–
2
Total: 598
80
Total articles selected after excluding duplicates:
59
The oldest publication found, dating the 1997 describes in vitro and in vivo studies carried out
by Fournet and collaborators [SA-59]. In the following decades, there was a variation in the
number of annual publications, with its highest peak in 2018 with 9 articles, as shown in
Figure 2.
Figure 2 - Annual distribution of publications selected in the systematic review
Regarding the design of the selected studies (Figure 3), 53 (89.8 %) carried out exclusively in
vitro assays, while only 2 (3.4 %) carried out exclusively in vivo assays. Another 4 (6.8 %)
performed both analysis methodoloies (in vitro and in vivo).
81
Figure 3 - Venn diagram grouping the studies by the type of assay in vivo and in vitro.
In Table 2 the 57 studies with in vitro tests are gathered. The information collected to
compose this table was: the species of fungi; fungal bioproducts (extract / isolated compound)
with leishmanicidal activity; the species of Leishmania and its evolutionary form
(promastigote / amastigote) and, finally, the reference of the article (name of the main author
and year of publication).
Table 2 - In vitro studies of leishmanicidal activity of fungal bioproducts selected in the
systematic review, summarized by year of publication.
Fungi
Extract / Compound isolated
(specie and strain identifier)
Leishmania species
(in vitro)
Reference
Ethanolic Extract
HMWF fraction
Trichoderma asperelloides LIBASP02
L. amazonensis (promastigote)
LMWF fraction
LMWF fraction
[SA-1]
LOPES et al.,
2020.
L. amazonensis (amastigote)
Acremonium fusidioides UFMGCB 13041
Penicillium allii-sativi UFMGCB 13048, UFMGCB
13045, UFMGCB 13053, UFMGCB 13054
Penicillium
chrysogenum
UFMGCB
13035;
UFMGCB 13036; UFMGCB 13039; UFMGCB
13042;
UFMGCB
13043;
UFMGCB
13046;
UFMGCB 13047; UFMGCB 13049; UFMGCB
13050;
UFMGCB
13051;
UFMGCB
13052; Ethyl acetate extract
UFMGCB 13038.
Penicillium palitans UFMGCB 13034; UFMGCB
13037;
UFMGCB
13027;
UFMGCB
13028;
UFMGCB 13029; UFMGCB 13030; UFMGCB
13031;
UFMGCB
13032;
UFMGCB
13033;
UFMGCB 13044; UFMGCB 13056; UFMGCB 13057
Pseudogymnoascus verrucosus UFMGCB 13055
L. amazonensis (promastigote)
[SA-2]
OGAKI et al.,
2020.
82
Penicillium
chrysogenum
UFMGCB
12439;
UFMGCB 12447; UFMGCB 12444; UFMGCB
12445; UFMGCB 13066
Dichloromethane extract
Penicillium palitans UFMGCB 12446
L. amazonensis (promastigote)
Penicillium sp. UFMGCB 12440; UFMGCB 13070;
[SA-3]
DE MENEZES
et al., 2020.
UFMGCB 13071; UFMGCB 13065; UFMGCB
12575; UFMGCB 13062; UFMGCB 13081
Phyllosticta capitalensis Tg06
Ethyl acetate extract
Paecilomyces sp. 7A22
Harzialactone A
L. amazonensis (promastigote)
L. infantum (promastigote)
L. amazonensis (promastigote)
L. amazonensis (amastigote)
[SA-4]
GOLIAS et al.,
2019.
[SA-5]
BRAUN et al.,
2019.
(1S,2R,3R,4R,5R)-2,3,4-trihydroxy-5L. donovani (promastigote)
[SA-6]
MALAK et al.,
2018.
Ethyl acetate extract
L. amazonensis (promastigote)
[SA-7]
DE ALMEIDA
et al., 2018.
Fucogalactan FG-Aa
L. amazonensis (amastigote)
[SA-8]
MOTOSHIMA
et al., 2018.
Ethanol Extract
L. donovani (promastigote)
methylcyclohexyl-2′,5′-dihydroxybenzoate
Geosmithia langdonii
(1S,2S,3S,4R,5R)- 4-[(2′,5′-dihydroxybenzyl)oxy]-5methylcyclohexane-1,2,3-triol
Bipolaris sp. C36
Bipolaris sp. AZ26
Agrocybe aegerita
L. donovani (promastigote)
Grifola frondosa
Semipurified fraction
L. donovani (amastigote)
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SULTANA, et
al., 2018
L. major (promastigote)
L. tropica (promastigote)
Vermisporium-like CMIAT232
Emericella nidulans CMIAT233
Dichotomophtora
Enzymatic extract
portulacae CBS 149.94
L. amazonensis (promastigote /
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Dichotomophtora boerhaaviae CMIAT 235
Aqueous fraction
80% ethanol fraction
Morchella importuna
Water-soluble polysaccharide fraction
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L. amazonensis (promastigote)
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GOMES et al.,
2018.
Polyphenolic fraction
10-acetyl trichoderonic acid A
6'-acetoxy-piliformic acid
Nectria pseudotrichia
hydroheptelidic acid
Pseudogymnoascus destructans UFMGCB 10169;
UFMGCB 10453; UFMGCB 10312; UFMGCB
10185;
UFMGCB
10268;
UFMGCB
10286;
UFMGCB 10310; UFMGCB 10339; UFMGCB
10342;
UFMGCB
10356;
UFMGCB
UFMGCB 10441; UFMGCB 10454
10378;
Dichloromethane extract
Mortierella sp. UFMGCB 10364
Mortierella sp. UFMGCB 10351
Mortierella sp. UFMGCB 10316
Penicillium chrysogenum UFMGCB 10240
Pseudogymanoascus sp. UFMGCB 10344
L. major (promastigote)
Lichenized fungi
Usnic acid
L. tropica (promastigote)
L. infantum (promastigote)
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Ethyl acetate extract
Cochliobolus sp.
Diaporthe phaseolorum 92C
Anhydrocochlioquinone A
18-des-hydroxy Cytochalasin H
L. amazonensis (amastigote)
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[SA-17]
DA SILVA et
al., 2017.
L. major (promastigote)
[SA-18]
SIDDIQUI et
al., 2017.
Terrein
Aspergillus terreus F7
Butyrolactone I
Butyrolactone V
Cunninghamella blakesleeana ATCC 8688A
+
Cunninghamella echinulata ATCC 9244
6β,17β-dihydroxy-7α,17α-dimethylestr-4-en-3-one
Macrophomina phaseolina KUCC 730
11β,17β-dihydroxy-7α,17α-dimethylestr-4-en-3-one
Ergosterol peroxide
L. amazonensis (promastigote)
L. amazonensis (amastigote)
Trametes versicolor
Trametenolic acid B
Integracides H
Fusarium sp.
Integracides J
Integracides F
Fusarium sp.
Integracides G
L. amazonensis (promastigote)
L. amazonensis (amastigote)
L. donovani (promastigote)
[SA-20]
IBRAHIM et
al., 2016a.
L. donovani (promastigote)
[SA-21]
IBRAHIM et
al., 2016b.
L. donovani (promastigote)
[SA-22]
ELKHAYAT et
al., 2016.
(22E,24R)-stigmasta-5,7,22-trien-3-β-ol
Aspergillus terréus
stigmast-4-ene-3-one
Terrenolide S
Aspergillus sp. 114QD
Curvularia sp. P1-F1
Phomopsis sp. P5-F1
2-hidroxifenilquinoline
L. amazonensis (promastigote)
L. braziliensis (promastigote)
[SA-23]
PARRA
LIZARAZU et
al., 2016.
Ethanol Extract
Ethanol extract
L. amazonensis (promastigote)
Hexane phase
Cochliobolus sativus P2-F3
[SA-19]
LELIEBRELARA et al.,
2016.
[SA-24]
DO
NASCIMENTO
et al., 2015.
Cochlioquinone A + isocochlioquinone
Anhydrocochlioquinone A
1,3-cis-1-Methoxy-1-(2,5-dihydroxyphenyl)-3Mucor ramannianus ATCC 9628
Astraeus hygrometricus
hydroxy-3-phenylpropane
Astrakurkurone
L. donovani
(unreported evolutionary form)
L. donovani (promastigote)
L. donovani (amastigote)
[SA-25]
MIKELL et al.,
2015.
[SA-26]
MALLICK et
al., 2015.
Fusarium sp. JQ905668.1
Fusarium sp. HM631978.1
N. pseudotrichia JN995626.1
Ethyl acetate extract
L. amazonensis (amastigote)
[SA-27]
CAMPOS et al.,
2015.
Xylaria sp. JN995626.1
Lichenized fungi
Cladonia substellata
Usnic acid
L. infantum chagasi
(promastigote)
[SA-28]
DA LUZ et al.,
2015.
84
(6-S)-3-(1,3-dihydroxypropyl)-6-(2methylpropyl)piperazine-2,5-dione
Trichosporum sp.
(6-R)-3-(1,3-dihydroxypropyl)-6-(2-
L. donovani (promastigote)
[SA-29]
METWALY et
al., 2015.
L. donovani (promastigote)
[SA-30]
MALAK et al.,
2014.
L. major (promastigote)
[SA-31]
BAYDOUN et
al., 2014.
methylpropyl)piperazine-2,5-dione
Ethyl acetate extract (potato dextrose medium)
Ethyl acetate extract (tryptic soy medium)
4-[2′,4′-dihydroxy-6′-(hydroxymethyl)
benzyl]benzene-1,2-diol
(+)-epiepoformin
Geosmithia langdonii
(4S,5S)-4,5-dihydroxy-2-methylcyclohex-2-enone
2,5-dihydroxybenzaldehyde
3-hydroxybenzyl alcohol
2,5-dihydroxybenzyl alcohol
3-hydroxytoluene
Nandrolone
10β,16α,17β-trihydroxy-19-nor-4-androsten-3-one
6β,10β,17β-trihydroxy-19-nor-4-androsten-3-one
Cunninghamella echinulate ATCC 9244
+ Cunninghamella blakesleeana ATCC 9244
10β,17β-dihydroxy-19-nor-4-androsten-3-one
6β,17β-dihydroxy-19-nor-4-androsten-3-one
10β-hydroxy-19-nor-4-androsten-3,17-dione
16b,17b-Dihydroxy-19-nor-4-androsten-3-one
L. amazonensis (promastigote)
Aspergillus sp.
Kojic acid (KA)
Edenia sp. F0755
Palmarumycin CP18
L. donovani (amastigote)
Tricholoma giganteum AMFH- 510
80% ethanol fraction
L. donovani (promastigote)
80% ethanol fraction
L. donovani (promastigote)
Water-soluble polysaccharide fraction
L. donovani (amastigote)
L. amazonensis (amastigote)
[SA-32]
RODRIGUES et
al., 2014.
[SA-33]
ORTEGA, et
al., 2014.
Astraeus hygrometricus AMFH- 583
Water-soluble polysaccharide fraction
Russula laurocerasi AMFH- 602
Polyphenolic extract
L. donovani (amastigote)
[SA-34]
MALLICK et
al., 2014.
Russula albonigra AMFH- 598
Russula delica AMFH- 600
Water-soluble polysaccharide fraction
L. donovani (amastigote)
Termitomyces eurhizus AMFH- 604
Ethanol extract
Drechslera rostrate DSM 62596
di-2-ethylhexyl phthalate
L. major (promastigote)
Ethanol extract
Eurotium tonpholium ATCC 16440
[SA-35]
AWAAD et al.,
2014.
1,8-dihydroxy-3-methoxy-6-methyl-anthraquinone
L. braziliensis (promastigote)
Aphidicolin
L. braziliensis (amastigote)
L. major (promastigote)
Nigrospora sphaerica
3-deoxy-aphidicolin
3-oxoaphidicolin
L. braziliensis (promastigote)
L. major (promastigote)
L. braziliensis (promastigote)
[SA-36]
SANTOS et al.,
2014.
85
3-oxime-aphidicolin
L. braziliensis (promastigote)
L. braziliensis (amastigote)
Citreorosein
Penicillium herquei LaBioMi 019
L. braziliensis (promastigote)
[SA-37]
MARINHO et
al., 2013.
Ethyl acetate extract
L. mexicana (promastigote)
[SA-38]
GAMBOAANGULO et al.,
2013.
Astrakurkurone
L. donovani (promastigote)
[SA-39]
LAI et al., 2012.
L. chagasi (promastigote)
[SA-40]
VALADARES
et al., 2012a.
Emodin
Janthinone
Fusarium sp. TA50
Fusarium sp. TA54
Verticillium sp. TH28
2TA2 strain
Astraeus hygrometricus
Aqueous extract (crude)
Agaricus blazei
Aqueous extract (Fab4)
Aqueous extract (Fab5)
L. chagasi (amastigote)
Pseurotin A
14-norpseurotin A
Aspergillus sp. F1544
L. donovani (amastigote)
[SA-42]
MARTÍNEZLUIS et al.,
2012.
Ethanol extract
L. amazonensis (amastigote)
[SA-43]
SANTIAGO et
al., 2012.
Ethyl acetate extract
L. donovani (amastigote)
[SA-44]
MARTÍNEZLUIS et al.,
2011.
L. donovani (amastigote)
[SA-45]
MORENO et
al., 2011.
FD-838
Pseurotin D
Fumoquinone B
Alternaria sp. UFMGCB 2301; UFMGCB 2508;
UFMGCB 2564; UFMGCB 2673
Cadophora luteo-olivacea UFMGCB 2569
Helgardia sp. UFMGCB 2630
Herpotrichia sp. UFMGCB 2682
Phaeosphaeria herpotrichoides UFMGCB 2272
Phaeosphaeria sp. UFMGCB 2515; UFMGCB 2518;
UFMGCB 2528; UFMGCB 2560; UFMGCB 2649;
UFMGCB 2650; UFMGCB 2667; UFMGCB 2669
Oculimacula sp. UFMGCB 2567
Antarctomyces psychrotrophicus UFMGCB 2666
Phaeosphaeria herpotrichoides UFMGCB 2672
Aspergillus sp. F1544A; F1544B; F1544C
Diaporthe sp. F1647C
Diaporthe sp. F1647D
Edenia sp. F0755A; F0755B; F0755C; F0755D;
F1644B; F1644C
Unidentified sp. strain F0194B
Mycosphaerella sp. F2140A; F2140B; F2140C;
F2140D
Nectria sp. F1491B; F1491C
Penicillium sp. F1534C
Phomopsis sp. F1566C; F1566D
Stenocarpella sp. F0275A; F0275B; F0275D
Xylaria sp. F1220D
Xylariaceae sp. F0307B
Cercosporin
Mycosphaerella sp. F2140
Cercosporin acetylate
86
L. amazonensis (promastigote)
L. chagasi (promastigote)
Agaricus blazei
Aqueous extract
L. major (promastigote)
L. amazonensis (amastigote)
[SA-46]
VALADARES
et al., 2011.
L. chagasi (amastigote)
L. major (amastigote)
Panepoxydone
Lentinus strigosus UFMGCB975
Hypnophilin
L. amazonensis (amastigote)
[SA-47]
SOUZAFAGUNDES et
al., 2010.
L. amazonensis (amastigote)
[SA-48]
ROSA et al.,
2010.
L. amazonensis (amastigote)
[SA-50]
ROSA et al.,
2009.
L. amazonensis (amastigote)
[SA-51]
CAMPOS et al.,
2009.
L. donovani (amastigote)
[SA-52]
PONTIUS et al.,
2008.
L. donovani (amastigote)
[SA-53]
MARTÍNEZLUIS et al.,
2008.
L. tarentolae (promastigote)
[SA-54]
GUIMARÃES
et al., 2008.
Arthrinium sp. UFMCB 509; UFMCB 513
Fusarium oxysporum UFMCB 529
Cochliobolus melinidis UFMCB 554
Alternaria arborescens UFMCB 563
Ethyl acetate extract
Penicillium citrinium UFMCB 579
Gibberella sp. UFMCB 648
Fungal endophyte UFMCB 914
Gymnopilus cf. areolatus UFMGCB36
Nothopanus hygrophanus CCB216
Lentinus cf. strigosus CCB162
Ethyl acetate extract (Mycelium)
Irpex lacteus CCB196
Ethanol extract (Basidium)
Pleurotus flabellatus CCB210
Basidiomycete (not identified) CCB369
Cochlioquinone A
Cochliobolus sp. UFMGCB-555
Isocochlioquinone A
Chaetoxanthone C1
Chaetomium sp.
Chaetoxanthone C2
Chaetoxanthone C3
Preussomerin EG1
Palmarumycin CP2
Edenia sp.
Palmarumycin CP17
Palmarumycin CP18
CJ-12,371
Diaporthe phaseolorum VA14
Phyllosticta sp. or Guignardia mangiferae VA16
Ethyl acetate extract
Phomopsis sp. VA35
Dichloromethane extract
Lichenized fungi
Methanolic extract
Protousnea poeppigii
Isodivaricatic acid
Isodivaricatic acid diacetate
L. amazonensis (promastigote)
L. braziliensis (promastigote)
Dichloromethane extract
Lichenized fungi
Methanolic extract
Usnea florida
Divaricatinic acid
Usnic acid
L. infantum (promastigote)
[SA-55]
SCHMEDAHIRSCHMANN
et al., 2008
87
Hexanic extract
Acetone extract
L. panamensis (amastigote)
[SA-56]
CORREA et al.,
2006.
Citrinin
L. mexicana (amastigote)
[SA-57]
MARINHO et
al., 2005.
GMPOLY
L. amazonensis (amastigote)
Fraction 1
Pycnoporus sanguineus
Fraction 2
Ergosterol 5,8‐endoperoxide
Penicillium janthinellum LaBioMi-018
Lichenized fungi
Ramalina celastri 30911
L. amazonensis (promastigote)
GMPOLYVO
Lichenized fungi
SA-58]
NOLETO et al.,
2002.
L. amazonensis (amastigote)
(+) Usnic acid
Protousnea malacea
L. amazonensis (promastigote)
L. braziliensis (promastigote)
1′-Chloropannarine
Erioderma leylandii
L. donovani (promastigote)
[SA-59]
FOURNET et
al.,1997.
Pannarine
Psoroma pallidum Nyl.
The 6 studies with in vivo tests are presented in Table 3. In this table, information is compiled
such as: the fungal bioproducts tested and the microorganism of origin, the methodology
applied in the test, the main results presented and the publication reference.
Table 3 - In vivo studies of leishmanicidal activity of fungal bioproducts selected in the
systematic review, summarized by year of publication.
Fungi
Extract / Compound
Animal Model
Leishmania
species
Treatment
Result
L. amazonensis
Daily treatment with topical
formulation for 4 weeks
started after 5 weeks of
infection.
There was a decrease in the
number of parasites at the
injury site by 92.1%. The
formulation promoted the
production of collagen
contributing to healing.
[SA-32]
RODRIGUES
et al., 2014.
L. major
Daily oral treatment of
medications (twice a day) for
28 days (100 mg / kg of the
ethanolic extract or 50 mg /
kg of the isolated
compounds).
Treatment with extracts and
isolated compounds induced
complete healing after 17
and 13 days of treatment,
respectively.
[SA-35]
AWAAD et al.,
2014.
Aspergillus sp.
Golden Hamsters
Kojic acid (KA)
Reference
Drechslera rostrata
Ethanol extract
di-2-ethylhexyl phthalate
Eurotium tonpholium
Ethanol extract
1,8-dihydroxy-3methoxy-6
-methyl-anthraquinone
BALB/c mice
88
Agaricus blazei
Aqueous extract (crude)
Aqueous extract (Fab5)
BALB/c mice
L. chagasi
Agaricus blazei
BALB/c mice
L. amazonensis
Aqueous extract (crude)
Aureobasidium pullulans
Sophy β-glucana
Animals treated by the two
treatment regimens had a
significant reduction in
parasitic burden on the liver,
spleen and lymph nodes. The
treated mice had higher
levels of IFN-γ and lower
levels of IL-4 and IL-10.
[SA-40]
VALADARES
et al., 2012a.
Daily oral administration of
100 mg / kg bw per day for
20 days.
Mice treated presented at
60% reduction in the
inflammation of infected
footpads, 60 and 66%
reductions in parasitic loads
on the footpad and drainage
lymph nodes, respectively.
These treated animals
produced significantly higher
levels of IFN-γ, NO, higher
levels of parasite-specific
IgG2a isotype antibodies,
and lower levels of IL-4, and
IL-10 in the spleen and
lymph node cell cultures.
[SA-41]
VALADARES
et al., 2012b.
Supplementation with Sophy
β-glucan increased NK
activity and IFN-γ levels in
infected C57BL / 6 mice. In
addition, the treated C57BL /
6 showed lower swelling of
the infected footpad
compared to the untreated
group.
[SA-49]
YATAWARA
et al., 2009.
The treatments had no effect.
[SA-59]
FOURNET et
al.,1997.
BALB/c and
C57BL/6 mice
L. amazonensis
The mice continuously
received water supplemented
with 5% β-glucan Sophy
together with conventional
feed ad libitum.
BALB/c mice
L. amazonensis
Subcutaneous (intralesional
injections: 25 mg / kg bw) or
oral (25 mg / kg bw).
Protousnea malacea
(+) Usnic acid
Daily oral treatment with
Fab5 fraction or aqueous
crude extract (20 and 100 mg
/ kg / day, respectively), 5
days before infection, and
maintained for another 20
days post-infection
(chemoprophylactic regime)
or between days 0–20
infection (therapeutic
regimen).
In the 59 studies selected in this systematic review 8 species of Leishmania were evaluated
(Figure 4). Three species were prevalent: L. amazonensis in 28 studies (47.4%), L. donovani
in 18 (30.5%) and L. major being evaluated in 7 studies (11.8%).
Figure 4 - Number of studies selected in the systematic review in relation to the Leishmania
species studied.
89
Among the 57 studies with in vitro tests selected in this systematic review (Table 2) 28
evaluated the susceptibility of amastigotes of Leishmania spp. to fungal bioproducts
(supplementary material 4). 12 studies obtained amastigote forms by performing axenic
cultures, 13 studies used murine macrophage culture and 3 other studies used human
monocytic cell lines (Figure 5).
Figure 5 - Number of studies selected in the systematic review in relation to the test method
for in vitro evaluation of the susceptibility to amastigote forms.
Among the selected studies 14 genera belong to the phylum Basidiomycota (20.6%); only 3 to
traditional Zygomycota (4.5%) and in greater prevalence are Ascomycota with 50 different
genera (74,6%). The bioproducts with leishmanicidal activity were mainly produced by
Penicillium sp. (11.9%), Aspergillus sp. (10.2%) and Fusarium sp. (8.5%). Altogether, 68
different genera of fungi were identified in the analyzed articles (supplementary material 6).
Figure 6 - Main genera and phyla of fungi that produce bioproducts with leishmanicidal
activity.
90
Moreover, 39 (66.1%) of the studies presented at least one isolated compound with
leishmanicidal activity, while 20 (33.9%) evaluated only crude extracts or semipurified
fractions (Figure 7). Altogether, 84 different isolated compounds were reported. The most
prevalent chemical classes were terpenes with 14 compounds (16.67%), steroids with 10
compounds (11.91%), quinones with 9 compounds (10.71%), and depsides with 5 compounds
(5.95%) (supplementary material 7)
Figure 7 – Proportion of studies with at least one isolated compound and studies with only
crude extracts or semi-purified fractions (A). Main chemical classes of isolated fungal
compounds with leishmanicidal activity (B).
4. Discussion
4.1 Prospecting for bioactive fungal compounds
The classic methodology for prospecting fungal metabolites is based mainly on the
identification and cultivation of isolates in the laboratory, followed by solvent extraction and
solvent-solvent partition to produce fractions with different polarities. In the end, the
characterization and isolation of the metabolites of the crude extracts or their fractions,
commonly involve the use of chromatographic methods to obtain pure products (BUCAR;
WUBE; SCHMID, 2013; CHÁVEZ et al., 2015; LI; LOU, 2018).
Among the studies included in this review, 38 (70.4%) of them present at least one isolated
compound with leishmanicidal activity, while 16 (29.6%) of the studies evaluated only crude
extracts or semipurified fractions. Regarding the production of the extracts, the main solvents
used were ethyl acetate, acetone, water, dichloromethane, ethanol, hexane and methanol
(supplementary material 3).
91
Despite the recurring rediscovery of already known compounds, fungi continue to play a
central role in contemporary pharmacology. Microbial genome mining has demonstrated the
existence of several clusters of silent biosynthetic genes that represent a huge field of
exploration for new metabolites with potential therapeutic activities. These discoveries have
again attracted the scientific community and the pharmaceutical industry to invest in
prospecting for bioactive fungal compounds (BALTZ, 2019; KELLER, 2019; PYE et al.,
2017). Among the articles analyzed in this review, it was observed that in the search for
fungal metabolites, the researchers sought to establish some prospecting strategies to enhance
the discovery of therapeutic compounds.
4.1.1 Prospecting strategies – Endophytic and symbiont organisms
Endophytes are a taxonomic and ecologically heterogeneous group of microbial communities,
including bacteria, archaea, protists and mainly fungi, which at some point in their lives
colonize plant tissues, in mandatory or facultative associations, without causing damage to
them (HARDOIM et al., 2015; OMOMOWO; BABALOLA, 2019). The close relationship
that endophytic fungi establish with the host plants, allow them to produce new organic
molecules, including terpenoids, peptides, carbohydrates, aromatics, hydrocarbons and other
biologically active compounds with applications in medicine, agriculture and industrial
facilities (DESHMUKH et al., 2018; STROBEL, 2018; TEIXEIRA et al., 2019).
Golias et al. (2019) [SA-4] reported that crude extracts of the endophytic fungus Phyllosticta
capitalensis (Desr.) Cogn. (Melastomataceae) isolated from healthy leaves of Tibouchina
granulosa had activity against L. amazonensi and L. infantum. The study of De Almeida et al.
(2018) [SA-7] investigated the chemical composition of crude extracts from strains of
endophytic fungi of the genus Bipolaris isolated from two species of aquatic macrophytes:
Eichhornia azurea (Kunth) and Eichhornia crassipes (Mart.). In biological screening, crude
extracts exhibited activity against L. amazonensis promastigotes with IC50 values ranging
from 70–84,2 μg.mL−1. Alves et al. (2018) [SA-10] described the production of lipases and
biological activity against the parasite L. amazonensis from endophytic fungi:
Dichotomophtora portulaceae, Dichotomophtora boerhaaviae, Emericella nidullans and
Vermisporium-like, obtained from fresh seeds of Jatropha curcas L.
Two studies selected in this review evaluated the leishmanicidal activity of endophytic fungi
isolated from the native Brazilian tree: Caesalpinia echinata Lam. (Fabaceae), Brazilwood. In
92
the first study, Campos et al. (2015) [SA-27] isolated 82 fungi from stems and barks of
Brazilwood. The crude extract of ethyl acetate from three isolates (Fusarium sp., Nectria
pseudotrichia and Xylaria sp.) It was able to inhibit L. amazonensis. On the other hand, Cota
et al. (2018) [SA-12] demonstrated the inhibitory activity against L. braziliensis of three
compounds isolated from the fungus N. pseudotrichia: 10-acetyl trichoderonic acid A, 6'acetoxy-piliformic acid, hydroheptelidic acid.
Campos et al. (2017) [SA-15] verified the activity against L. amazonensis of
anhydrococlioquinone A (ANDC-A) obtained from the fungus Cochliobolus sp. isolated from
the plant Piptadenia adiantoides JF Macbr (Fabaceae). Previously, two other compounds of
the fungus Cochliobolus sp. (cochlioquinone A and isocochlioquinone A) had also shown
activity against L. amazonensis (CAMPOS et al., 2009) [SA-51]. In the study by Brissow et
al. (2017) [SA-16], the chemical investigation of the ethyl acetate extract of the endophytic
fungus Diaporthe phaseolorum-92C isolated from the roots of Combretum lanceolatum led to
the isolation of the 18-des-hydroxy cytochalasin H active against promastigotes of L.
amazonensis.
Four studies from this review evaluated the leishmanicidal potential of secondary metabolites
of the endophytic fungus Aspergillus spp. In the study by Da Silva et al. (2017) [SA-17] the
compounds terrein, butyrolactone I and butyrolactone V, isolated from the crude extract of
Aspergillus terreus-F7 obtained from Hyptis suaveolens (L.) Poit., showed activity against L.
amazonensis. In the study by Elkhayat et al. (2016) [SA-22] compounds (22E, 24R)stigmasta-5,7,22-trien-3-β-ol, stigmast-4-ene-3-one and terrenolide S, isolated from the
obtained Aspergillus terreus from Carthamus lanatus (Asteraceae) roots, exhibited activity
against L. donovani.
In the research carried out by Martínez-Luis et al. (2011) [R-44], 25 fungi were isolated from
the leaves of nineteen plants collected in the protected areas of Panama. Eleven isolates –
including Aspergillus sp. – presented good antiparasitic potential, showing moderate or
marked activity against L. donovani with inhibitions of 65.3 - 98.5%.
In another study, five compounds isolated from Aspergillus sp. obtained from a mature leaf of
Guapira standleyana (Nyctaginaceae), which showed good activity (IC50: 0.5 - 5.8µM)
against L. donovani (MARTÍNEZ-LUIS et al., 2012) [SA-42]. Formerly Martínez-Luis et al.
(2008) [SA-53] had verified – in a similar study carried out in 2012 – the leishmanicidal
93
activity of five compounds of the fungus Edenia sp. isolated from Guapira standleyana
against L. donovani.
A survey of tetracyclic triterpenoids isolated from the endophytic fungus Fusarium sp.
obtained from the roots of Mentha longifolia L. (Labiatae) from Saudi Arabia, observed a
significant leishmanicidal activity of these compounds in relation to L. donovani (IBRAHIM
et al., 2016a, 2016b) [SA-20], [SA-21]. Do Nascimento et al. (2015) [SA-24] verified the
leishmanicidal activity against L. amazonensis of endophytic fungi identified as Curvularia
spp., Phomopsis spp. and Cochliobolus sativus isolated from leaves of the medicinal plant
Vernonia polyanthes.
Marinho et al. (2013) [SA-37] reported the isolation of six polyketides of Penicillium herquei
isolated from Melia azedarach. The compounds citreorosein, emodin and janthinone showed
activity against the promastigote forms of L. braziliensis. Chemical investigation of the
endophytic fungus Mycosphaerella sp. associated with the foliage of the Psychotria
horizontalis (Rubiaceae) plant in Panama, resulted in the isolation of cercosporin and a new
analog of cercosporin both with activity against L. donovani (MORENO et al., 2011) [SA-45].
Rosa et al. (2010) [SA-48] isolated 121 endophytic fungi recovered from leaves of the
bioactive Brazilian plant species: Ageratum myriadenia, Palicourea tetraphylla, Piptadenia
adiantoides and Trixis vauthieri. Among all the isolates, the fungi Alternaria sp., Arthrinium
sp., Cochliobolus sp., Colletotrichum sp., Penicillium sp., Fusarium sp. and Gibberella sp.
had activity against L. amazonensis. Previously, Rosa et al. (2009) [SA-50] had already
demonstrated that extracts from Gymnopilus cf. areolatus Murr., Nothopanus hygrophanus,
L. cf. strigosus, Irpex lacteus, Pleurotus flabellatus and an unidentified basidiomycete, also
have activity against L. amazonensis.
In the study by Guimarães et al. (2008) [SA-54] 39 endophytic fungi of Viguiera arenaria
and Tithonia diversifolia were isolated, both collected in Brazil. The fungi Diaporthe
phaseolorum, Phyllosticta sp. (or Guignardia mangiferae) and Phomopsis sp. isolates of
Viguiera arenaria showed activity against L. tarentolae. In Schmeda‐Hirschmann et al.
(2008) [SA-55] extracts of the Andean lichens Protousnea poeppigii and Usnea florida
isolated from Nothofagus (Fagaceae) trees showed activity in L. amazonensis, L. brasiliensis
and L. infantum promastigotes. In the investigation conducted by Fournet et al. (1997) [R-59]
three secondary metabolites isolated from Chilean lichens (usnic acid, pannarine and 1'-
94
chloropannarine) inhibited the promastigote forms of L. amazonensis, L. braziliensis and L.
donovani.
4.1.2 Prospecting strategies – Extremophilic Organisms
Extremophiles are microorganisms that thrive ideally in habitats whose physico-chemical
conditions are challenging and harmful to most other beings. These organisms have
adaptations that allow them to operate metabolically and biochemically under harsh
environmental circumstances with extreme levels of pH, temperatures, hydrostatic pressure,
radiation, osmotic stress and nutritional scarcity (COKER, 2019; MERINO et al., 2019;
ZHANG et al., 2018). The investigation of fungi obtained from under-explored environments,
such as glaciers, arid regions, hot springs, volcanic areas and deep ocean sediments, are
considered good sources of bioactive compounds with biotechnological potential and of
clinical importance (ARIFEEN et al., 2020; COKER, 2016; ZHANG et al., 2018).
Ogaki et al. (2020) [SA-2] Accessed cultivable fungi present in Antarctic marine sediments.
The biological analysis of ethyl acetate extracts from the fungi Acremonium fusidioides,
Penicillium allii-sativi, Penicillium chrysogenum, Penicillium palitans, Penicillium solitum
and Pseudogymnoascus verrucosus demonstrate the leishmanicidal activity of these products
against promastigotic forms of L. amazonensis. De Menezes et al. (2020) [SA-3] reported
leishmanicidal activity against L. amazonensis from crude extracts of Penicillium spp.,
P. chrysogenum and P. palitan isolated from fragments of Antarctic glacial ice.
In a bioprospecting study of antiparasitic metabolites and herbicides, Gomes et al. (2018)
[SA-13] used molecular biology techniques to identify 218 fungi present in soil samples
collected on four Antarctic islands. The fungi Pseudogymnoascus destructans, Mortierella
parvispora and Penicillium chrysogenum were active against L. amazonensis. In Santiago et
al. (2012) [SA-43] A total of 564 endophytic fungi were recovered from Deschampsia
antarctica and Colobanthus quitensis plants in Antarctica. Of these, 12 species showed antiLeishmania activity, highlighting the fungus Phaeosphaeria herpotrichoides which exhibited
leishmanicidal activity against L. amazonensis with an IC50 of 0,2 μg mL −1, equivalent to
inhibition by amphotericin B.
95
4.1.3 Prospecting strategies – Chemical modifications
The drug discovery and development process started with the study of natural products,
however, the re-isolation of already known compounds has been causing a deficit in
pharmacotherapeutic innovation. Faced with this challenge, several technological instruments
of analysis and computational molecular design have been used in medicinal chemistry for the
structural elucidation of natural products allowing the rational planning of drugs based on
these products (BARNES; KUMAR; DAVIS, 2016; BUTLER, 2004; LI; LOU, 2018;
THOMFORD et al., 2018).
Small changes in the structure of a natural product allow the improvement of some
characteristics such as solubility, stability and selectivity of the molecule, in addition to being
able to add new biological activities and, thus, obtain new candidates for innovative semisynthetic drug prototypes. Thus, aggregating the knowledge of synthetic organic chemistry
and the pharmacology of natural products has been one of the main ways to accelerate the
discovery of new drugs (DECORTE, 2016; GUO, 2017; YAO et al., 2017).
In an assay with L. donovani carried out by Moreno et al. (2011) [SA-45], the cercosporin
compound isolated from Mycosphaerella sp. presented an IC50 of 0,46 ± 0,05 μM, while its
analog, obtained by the acetylation process, presented an IC50 of 0,64 ± 0,05 μM. In Noleto et
al. (2002) [SA-58] a galactomannan (GMPOLY) isolated from the lichen Ramalina celastri
underwent a complex reaction with vanadyl ions (IV; VO) forming the GMPOLY-VO
complex. Both GMPOLY and GMPOLY-VO exhibited leishmanicidal effects in the
amastigote form of L. amazonesis, however only GMPOLY-VO inhibited the growth of the
promastigote form.
In the study by Santos et al. (2014) [SA-36] a series of aphidicolin derivatives (a secondary
metabolite of the endophytic fungus Nigrospora sphaerica) as well as the oxime analog have
been synthesized. Eight compounds were synthesized and tested against L. braziliensis. The
evaluation showed a high leishmanicidal activity of aphidicolin while the derivative 3-oximeaphidicolin presents moderate selectivity (IC50: 2.7 M ± 0.33) against the species L.
braziliensis.
96
4.1.4 Prospecting strategies – Biotransformation
The microbial biotransformation strategy is an alternative approach to the production of new
bioactive chemical derivatives through a reaction or a set of multi-enzymatic reactions in
which a precursor molecule (natural or synthetic) is converted into a desired target product.
The goal of biotransformation is to change the structure of a molecule by modifying some of
its characteristics such as solubility, toxicity and effectiveness (BRENNA et al., 2011; CAO
et al., 2015; SHAH et al., 2014).
Fungi are notably useful as a resource for biotransformation, due to their potent biocatalytic
system that involves a variety of reactions such as dehydrogenation, demethylation,
esterification, glycosylation, hydrogenation, hydrolysis, hydroxylation, isomerization,
methylation, oxidation and reduction. The production of analogous compounds resulting from
fungal biotransformation processes has been extensively explored in the field of
biotechnology, especially in the pharmaceutical area (CAO et al., 2015; LI; LOU, 2018; LI et
al., 2020; NASCIMENTO et al., 2019; SHAH et al., 2014; SURESH; ABRAHAM, 2020).
In Siddiqui et al. (2017) [SA-18] two metabolites obtained from the biotransformation of
mibolerone (a potent synthetic anabolic androgenic steroid) with Cunninghamella
blakesleeana, C. echinulata and Macrophomina phaseolina, showed activity against L. major.
In another similar study, Baydoun et al. (2014) [SA-31] evaluated the leishmanicidal activity
of the steroid nandrolone and its derivatives synthesized by biotransformation with
Cunninghamella echinulata and Cunninghamella blakesleeana. Nandrolone and derivative
16b,17b-Dihydroxy-19-nor-4-androsten-3-one were found to have significant activity against
L. major.
In the 2016 study, Parra Lizarazu et al. [SA-23] sought to elucidate the biological activity of
2-hydroxyphenylquinoline obtained in the biotransformation process of 2-phenylquinoline by
Aspergillus spp. Both 2-phenylquinoline and its hydroxylated form showed activity against L.
amazonensis and L. braziliensis. In Mikell et al. (2015) [SA-25] The microbial transformation
of 6-Hydroxyflavone by the fungus Mucor ramannianus resulted in the formation of 5
metabolites, among them the metabolite 1,3-cis-1-Methoxy-1-(2,5-dihydroxyphenyl)-3hydroxy-3-phenylpropane that showed activity against L. donovani.
97
4.1.5 Prospecting strategies – Different cultivation conditions
The variation of fungus cultivation parameters, such as changes in the environment, aeration,
salinity, pH and temperature, has an effect not only on fungal growth, but also on its
metabolic profile, thus optimizing the production and discovery of new secondary metabolites
during a screening of clinically important biomolecules. The diversification of microbial
cultivation conditions leads to the activation of gene clusters that remain silenced under
standard laboratory conditions, providing different biosynthetic pathways for the expression
of novel compounds with therapeutic potential (BRAKHAGE, 2013; PAN et al., 2019; REEN
et al., 2015; ROMANO et al., 2018; VANDERMOLEN et al., 2013).
Malak et al. (2014) [SA-30] evaluated leishmanicidal activities of Geosmithia langdonii ethyl
acetate extracts, obtained through different growth media: potato dextrose broth, tryptic soy
broth and malt extract broth. The extract obtained from cultures grown on potato dextrose
showed the highest activity against Leishmania donovani, while the extract obtained using the
tryptic soy medium showed lower activity and the extract obtained from the malt medium was
not active. The potato dextrose medium was chosen for the large-scale cultivation of G.
langdonii, which led to the production of five active metabolites.
In order to verify possible changes in the bioactivity profile of fungi Aspergillus sp. and
Mycosphaerella sp., Martínez-Luis et al. (2012) [SA-42] and Moreno et al. (2011) [SA-45],
respectively, proceeded to cultivate these microorganisms using four culture media: malt
extract, potato dextrose, Czapek Dox and V8. In these two studies, all the growth media tested
led to the production of active compounds against L. donovani.
4.2 Investigation of leishmanicidal activity of bioproducts.
The process of identifying leishmanicidal compounds requires different laboratory methods
that traditionally involve screening for potentially active molecules in in vitro parasite growth
or multiplication assays using different stages of the parasite's life cycle (ALCÂNTARA et
al., 2018; WOODS; WILLIAMS, 2007; SERENO et al., 2007).
The initial screening, in general, is directed to promastigote forms, which have the advantage
of less complexity in maintaining the culture and lower cost. The next step is to investigate
the action of the treatment on the intracellular amastigote form obtained in a culture of murine
macrophages (peritoneal exudate, bone marrow derivatives, J744.A1 lines) in addition to
98
other cell lines such as macrophages derived from human blood monocytes and macrophages
transformed into monocytes (THP-1, U937 and HL-60) (ALCÂNTARA et al., 2018;
HENDRICKX et al., 2019).
The evolutionary stage of amastigote is responsible for all clinical manifestations in the host.
This stage differs from promastigotes not only in their morphology, but also in relation to
their biochemical profile. For the amastigote to be susceptible to a compound it is necessary
that it can cross the membranes of the host cell and remain stable under low pH, in addition
the activation of the compound may depend on its metabolism by the macrophage. In this
way, assays with amastigote culture can mimic the pathophysiological picture of
leishmaniasis, which affords more reliable results (DE MUYLDER et al., 2011; GUPTA;
GOYAL; RASTOGI, 2001).
The intracellular amastigote model, despite covering many aspects of the development of the
parasite in its clinically relevant form, presents some difficulties such as the limited supply of
parasites and the frequent contamination due to more complex manipulation compared to the
cultivation of cell-free parasites (GUPTA; GOYAL; RASTOGI, 2001; VERMEERSCH et al.,
2009). Therefore, the development of axenic cultures (cell-free) by means of different
techniques of promastigotes in forms similar to amastigotes, simulating phagolysosomal
conditions (raising the incubation temperature and reducing the pH of the culture medium)
has been presented as an intermediate option between screening with promastigotes and
intracellular amastigotes (ALCOLEA et al., 2010; ZILBERSTEIN, 2020).
During the preclinical stage of a drug's development process, it is essential that the results of
in vitro tests be revalidated in an animal model. The main objective of in vivo models is to
determine the activity of a compound concerning its pharmacokinetic and pharmacodynamic
profile (CROFT; BRUN, 2003; MEARS et al., 2015). Many in vivo experimental models
targeting leishmaniasis have been developed. The experiments of infection by Leishmania
spp. commonly use mice of pure lineage and specific-pathogen-free (SPF), in acute and
chronic models, without cure and with self-healing, however, other animal models, such as
hamster and rat species are also reported (CROFT; BRUN, 2003; MEARS et al., 2015).
99
5. Conclusion
The results found in the literature consulted for the preparation of this systematic review
support the hypothesis of the pharmacological potential of fungal bioproducts in the treatment
of leishmaniasis. The evidence presented corroborates the need for the scientific community
and the pharmaceutical industry to engage in the strengthening of bioprospecting programs
for natural products.
The investigation of endophytic and symbiont fungi or those selected from underexplored
environments, especially in extreme conditions or obtained through different cultivation
conditions, favors the discovery of new biologically active products. Furthermore, strategies
such as chemical modifications and biotransformation also contribute to the development of
innovative molecules.
This review provided an overview of current efforts in the search for alternatives to the
pharmacotherapy of leishmaniasis, exploring fungal biodiversity. From this perspective, it
was observed that scientific and technological development in this segment is very incipient.
Most studies are still focused on in vitro assays and with non-isolated compounds. There was
also a lack of studies that were sufficiently advanced to be able to advance to clinical trials.
This gap is largely due to the low level of public and private investment in research aimed at
combating neglected diseases. Taken together, the evidence reported by the publications
gathered in this review, indicates in the prospecting of fungal bioproducts a promising path in
the fight against leishmaniasis.
Financial support
This work has been supported by the Brazilian National Council for Scientific and
Technological Development (CNPq, Grant no. MycoAntar/PROANTAR 442258/2018-6 and
Universal 433388/2018-8), Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel
(CAPES), Foundation for Research Support of the State of Alagoas (FAPEAL), and Federal
University of Alagoas (UFAL).
100
Acknowledgments
The authors thank parliamentarian Tereza Nelma da Silva Porto Viana Soares for
supporting the Brazilian Antarctic research. The authors would also like to thank the CAPES,
CNPq, MCTC, FINEP, and FAPEAL. Moreover, the authors would like to thank several
colleagues working at the UFAL for constructive criticism of and assistance with this project.
Conflicts of interest
The authors report no conflicts of interest.
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Fungi AND Leishmania
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Fungi AND Leishmania
(SCIELO)
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Fungo AND Leishmania
(SCIELO)
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Lichen AND Leishmania
(PUBMED)
SELECTED ARTICLE [SA]
("Fungi"[Mesh]) AND
"Leishmania"[Mesh]
(PUBMED)
Fungi AND leishmanicidal
(PUBMED)
List of articles selected in the systematic review, using different descriptors and databases,
summarized by the bibliographic references in decreasing order of the year of publication.
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[SA-32] RODRIGUES et al., 2014.
[SA-33] ORTEGA, et al., 2014.
[SA-34] MALLICK et al., 2014.
[SA-35] AWAAD et al., 2014.
[SA-36] SANTOS et al., 2014.
[SA-37] MARINHO et al., 2013.
[SA-38] GAMBOA-ANGULO et
al., 2013.
[SA-39] LAI et al., 2012.
[SA-40] VALADARES et al.,
2012a.
[SA-41] VALADARES et al.,
2012b.
[SA-42] MARTÍNEZ-LUIS et al.,
2012.
[SA-43] SANTIAGO et al., 2012.
[SA-44] MARTÍNEZ-LUIS et al.,
2011.
[SA-45] MORENO et al., 2011.
[SA-46] VALADARES et al., 2011.
[SA-47] SOUZA-FAGUNDES et
al., 2010.
[SA-48] ROSA et al., 2010.
[SA-49] YATAWARA et al., 2009.
[SA-50] ROSA et al., 2009.
[SA-51] CAMPOS et al., 2009.
[SA-52] PONTIUS et al., 2008.
[SA-53] MARTÍNEZ-LUIS et al.,
2008.
[SA-54] GUIMARÃES et al., 2008.
[SA-55] SCHMEDA‐
HIRSCHMANN et al., 2008.
[SA-56] CORREA et al., 2006.
[SA-57] MARINHO et al., 2005.
[SA-58] NOLETO et al., 2002.
[SA-59] FOURNET et al., 1997.
x
—
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x
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—
113
SUPPLEMENTARY MATERIAL 2
List of titles of the articles selected in the systematic review, summarized by the bibliographic
references in decreasing order of the year of publication.
Selected article [SA]
Title
[SA-1] LOPES et al., 2020.
Ethanolic Extract of the Fungus Trichoderma
asperelloides Induces Ultrastructural Effects and
Death on Leishmania amazonensis
[SA-2] OGAKI et al., 2020.
Cultivable fungi present in deep-sea sediments of
Antarctica: taxonomy, diversity, and
bioprospecting of bioactive compounds
[SA-3] DE MENEZES et al., 2020.
[SA-4] GOLIAS et al., 2019.
[SA-5] BRAUN et al., 2019.
[SA-6] MALAK et al., 2018.
[SA-7] DE ALMEIDA et al., 2018.
[SA-8] MOTOSHIMA et al., 2018.
Fungi in glacial ice of Antarctica: diversity,
distribution and bioprospecting of bioactive
compounds
Tibouchina granulosa (Vell.) Cogn
(Melastomataceae) as source of endophytic fungi:
Isolation, identification, and antiprotozoal activity
of metabolites from Phyllosticta capitalensis.
Evaluation of antileishmanial activity of
harzialactone a isolated from the marine-derived
fungus Paecilomyces sp.
Antileishmanial Carbasugars from Geosmithia
langdonii.
Curvulin and spirostaphylotrichins R and U from
extracts produced by two endophytic Bipolaris sp.
associated to aquatic macrophytes with
antileishmanial activity.
Inhibition of Leishmania amazonensis arginase by
fucogalactan isolated from Agrocybe aegerita
mushroom
[SA-9] SULTANA, et al., 2018.
Selective in vitro inhibition of Leishmania
donovani by a semi-purified fraction of wild
mushroom Grifola frondose
[SA-10] ALVES et al., 2018.
Leishmanicidal and fungicidal activity of lipases
obtained from endophytic fungi extracts.
[SA-11] PERETZ et al., 2018.
In vitro antileishmanial activity of a black Morel,
Morchella importuna (ascomycetes).
[SA-12] COTA et al., 2018.
Leishmanicidal compounds of Nectria
pseudotrichia, an endophytic fungus isolated from
the plant Caesalpinia echinata (Brazilwood).
114
[SA-13] GOMES et al., 2018.
Cultivable fungi present in Antarctic soils:
taxonomy, phylogeny, diversity, and
bioprospecting of antiparasitic and herbicidal
metabolites.
[SA-14] DERICI et al., 2018.
Usnic acid causes apoptotic-like death in
Leishmania major, L. infantum and L. tropica.
[SA-15] CAMPOS et al., 2017.
[SA-16] BRISSOW et al., 2017.
[SA-17] DA SILVA et al., 2017.
[SA-18] SIDDIQUI et al., 2017.
In vitro leishmanicidal, antibacterial and
antitumour potential of anhydrocochlioquinone A
obtained from the fungus Cochliobolus sp.
18-Des-hydroxy Cytochalasin: an antiparasitic
compound of Diaporthe phaseolorum-92C, an
endophytic fungus isolated from Combretum
lanceolatum Pohl ex Eichler
Bioactive compounds of Aspergillus terreus—F7,
an endophytic fungus from Hyptis suaveolens (L.)
Poit.
Biotransformation of a potent anabolic steroid,
mibolerone, with Cunninghamella blakesleeana,
C. echinulata, and Macrophomina phaseolina, and
biological activity evaluation of its metabolites.
[SA-19] LELIEBRE-LARA et al.,
2016.
In vitro antileishmanial activity of sterols from
Trametes versicolor (Bres. Rivarden).
[SA-20] IBRAHIM et al., 2016a.
Integracides H J: New tetracyclic triterpenoids
from the endophytic fungus Fusarium sp.
[SA-21] IBRAHIM et al., 2016b.
Integracides F and G: New tetracyclic
triterpenoids from the endophytic fungus
Fusarium sp.
[SA-22] ELKHAYAT et al., 2016.
Terrenolide S, a new antileishmanial butenolide
from the endophytic fungus Aspergillus terreus.
[SA-23] PARRA LIZARAZU et al.,
2016.
[SA-24] DO NASCIMENTO et al.,
2015.
[SA-25] MIKELL et al., 2015.
Caracterización química y biológica de los
productos derivados de la biotransformación del
alcaloide leishmanicida 2-fenilquinolina (2FQ)
por Aspergillus spp.
Antileishmanial activity of compounds produced
by endophytic fungi derived from medicinal plant
Vernonia polyanthes and their potential as source
of bioactive substances.
Eleven microbial metabolites of 6hydroxyflavanone.
115
[SA-26] MALLICK et al., 2015.
[SA-27] CAMPOS et al., 2015.
[SA-28] DA LUZ et al., 2015.
A novel triterpene from Astraeus hygrometricus
induces reactive oxygen species leading to death
in Leishmania donovani.
Bioactive endophytic fungi isolated from
Caesalpinia echinata Lam. (Brazilwood) and
identification of beauvericin as a trypanocidal
metabolite from Fusarium sp.
Ultrastructural analysis of Leishmania infantum
chagasi promastigotes forms treated in vitro with
usnic acid.
[SA-29] METWALY et al., 2015.
Two new antileishmanial diketopiperazine
alkaloids from the endophytic fungus
Trichosporum sp.
[SA-30] MALAK et al., 2014.
Antileishmanial metabolites from Geosmithia
langdonii.
[SA-31] BAYDOUN et al., 2014.
[SA-32] RODRIGUES et al., 2014.
[SA-33] ORTEGA, et al., 2014.
[SA-34] MALLICK et al., 2014.
[SA-35] AWAAD et al., 2014.
Microbial transformation of nandrolone with
Cunninghamella echinulata and Cunninghamella
blakesleeana and evaluation of leishmaniacidal
activity of transformed products.
A novel function for kojic acid, a secondary
metabolite from Aspergillus fungi, as
antileishmanial agent.
Anti-L. donovani Activity in
Macrophage/Amastigote Model of Palmarumycin
CP18 and its Large Scale Production.
Selective inhibition of Leishmania donovani by
active extracts of wild mushrooms used by the
tribal population of India: an in vitro exploration
for new leads against parasitic protozoans.
Anti‐leishmanial Activities of Extracts and
Isolated Compounds from Drechslera rostrata
and Eurotium tonpholium.
[SA-36] SANTOS et al., 2014.
The semisynthetic landscape of aphidicolin:
inspiration towards leishmanicidal compounds.
[SA-37] MARINHO et al., 2013.
Active polyketides isolated from Penicillium
herquei.
[SA-38] GAMBOA-ANGULO et al.,
2013.
Antimycobacterial and antileishmanial effects of
microfungi isolated from tropical regions in
México.
116
[SA-39] LAI et al., 2012.
Leishmanicidal and anticandidal activity of
constituents of Indian edible mushroom Astraeus
hygrometricus.
[SA-40] VALADARES et al., 2012a.
Prophylactic or therapeutic administration of
Agaricus blazei Murill is effective in treatment of
murine visceral leishmaniasis.
[SA-41] VALADARES et al., 2012b.
Therapeutic efficacy induced by the oral
administration of Agaricus blazei Murill against
Leishmania amazonensis.
[SA-42] MARTÍNEZ-LUIS et al.,
2012.
Antiparasitic and anticancer constituents of the
endophytic fungus Aspergillus sp. strain F1544.
[SA-43] SANTIAGO et al., 2012.
Leishmanicidal and antitumoral activities of
endophytic fungi associated with the Antarctic
angiosperms Deschampsia antarctica Desv. and
Colobanthus quitensis (Kunth) Bartl.
[SA-44] MARTÍNEZ-LUIS et al.,
2011.
Screening and evaluation of antiparasitic and in
vitro anticancer activities of Panamanian
endophytic fungi.
[SA-45] MORENO et al., 2011.
Chemical constituents of the new endophytic
fungus Mycosphaerella sp. nov. and their antiparasitic activity.
[SA-46] VALADARES et al., 2011.
Leishmanicidal activity of the Agaricus blazei
Murill in different Leishmania species.
[SA-47] SOUZA-FAGUNDES et al.,
2010.
In vitro activity of hypnophilin from Lentinus
strigosus: a potential prototype for Chagas disease
and leishmaniasis chemotherapy.
[SA-48] ROSA et al., 2010.
[SA-49] YATAWARA et al., 2009.
[SA-50] ROSA et al., 2009.
[SA-51] CAMPOS et al., 2009.
Leishmanicidal, trypanocidal, and cytotoxic
activities of endophytic fungi associated with
bioactive plants in Brazil.
Aureobasidium-derived soluble branched (1, 3-1,
6) β-glucan (Sophy β-glucan) enhances natural
killer activity in Leishmania amazonensis-infected
mice.
Cytotoxic, immunosuppressive, trypanocidal and
antileishmanial activities of Basidiomycota fungi
present in Atlantic Rainforest in Brazil.
Correction: Leishmanicidal Metabolites from
Cochliobolus sp., an Endophytic Fungus Isolated
from Piptadenia adiantoides (Fabaceae).
117
[SA-52] PONTIUS et al., 2008.
Antiprotozoal activities of heterocyclic-substituted
xanthones from the marine-derived fungus
Chaetomium sp.
[SA-53] MARTÍNEZ-LUIS et al.,
2008.
Antileishmanial constituents of the Panamanian
endophytic fungus Edenia sp.
[SA-54] GUIMARÃES et al., 2008.
Biological activities from extracts of endophytic
fungi isolated from Viguiera arenaria and
Tithonia diversifolia.
[SA-55] SCHMEDA‐HIRSCHMANN A new antifungal and antiprotozoal depside from
et al., 2008.
the Andean lichen Protousnea poeppigii.
[SA-56] CORREA et al., 2006.
Leishmanicidal activity of Pycnoporus
sanguineus.
[SA-57] MARINHO et al., 2005.
Biologically active polyketides produced by
Penicillium janthinellum isolated as an endophytic
fungus from fruits of Melia azedarach.
[SA-58] NOLETO et al., 2002.
Effects of a lichen galactomannan and its vanadyl
(IV) complex on peritoneal macrophages and
leishmanicidal activity.
[SA-59] FOURNET et al., 1997.
Activity of compounds isolated from Chilean
lichens against experimental cutaneous
leishmaniasis.
118
SUPPLEMENTARY MATERIAL 3
Table with the main solvents used in the production of fungal extracts with leishmanicidal
activity.
Selected Article
[SA-2] OGAKI et al., 2020.
[SA-4] GOLIAS et al., 2019.
[SA-7] DE ALMEIDA et al., 2018.
[SA-15] CAMPOS et al., 2017.
[SA-27] CAMPOS et al., 2015.
[SA-38] GAMBOA-ANGULO et al., 2013.
[SA-44] MARTÍNEZ-LUIS et al., 2011.
[SA-48] ROSA et al., 2010.
[SA-54] GUIMARÃES et al., 2008.
[SA-50] ROSA et al., 2009.
Organic Solvents
Ethyl acetate
[SA-56] CORREA et al., 2006.
Acetone
[SA-11] PERETZ et al., 2018.
[SA-34] MALLICK et al., 2014.
[SA-40] VALADARES et al., 2012a.
[SA-46] VALADARES et al., 2011.
Water
[SA-3] DE MENEZES et al., 2020.
[SA-13] GOMES et al., 2018.
[SA-55] SCHMEDA‐HIRSCHMANN et al., 2008
Dichloromethane
[SA-1] LOPES et al., 2020
[SA-9] SULTANA, et al., 2018.
[SA-11] PERETZ et al., 2018.
[SA-34] MALLICK et al., 2014.
[SA-43] SANTIAGO et al., 2012.
[SA-50] ROSA et al., 2009.
Ethanol
[SA-56] CORREA et al., 2006.
Hexane
[SA-55] SCHMEDA‐HIRSCHMANN et al., 2008
Methanol
119
SUPPLEMENTARY MATERIAL 4
List of articles selected in the systematic review, with assays in amastigotes obtained by
different methods.
Selected Article
Leishmania
(amastigote)
Host cell / Axenic culture
[SA-1] LOPES et al., 2020
L. amazonensis
Macrophage cell lines J774
[SA-5] BRAUN et al., 2019.
L. amazonensis
Peritoneal macrophages from Balb/C
[SA-9] SULTANA, et al., 2018.
L. donovani
Peritoneal macrophages from Balb/C
[SA-10] ALVES et al., 2018.
L. amazonensis
[SA-12] COTA et al., 2018.
L. braziliensis
[SA-15] CAMPOS et al., 2017.
L. amazonensis
Axenic culture
[SA-19] LELIEBRE-LARA et al., 2016.
L. amazonensis
Peritoneal macrophages from Balb/C
[SA-26] MALLICK et al., 2015.
L. donovani
Bone marrow-derived macrophages from
BALB/c
[SA-27] CAMPOS et al., 2015.
L. amazonensis
Axenic culture
[SA-32] RODRIGUES et al., 2014.
L. amazonensis
Peritoneal macrophages from Balb/C
[SA-33] ORTEGA, et al., 2014.
L. donovani
Peritoneal macrophages from Balb/C
[SA-34] MALLICK et al., 2014.
L. donovani
Peritoneal macrophages from Balb/C
[SA-36] SANTOS et al., 2014.
L. braziliensis
Peritoneal macrophages from Balb/C
[SA-40] VALADARES et al., 2012a.
L. chagasi
Peritoneal macrophages from Balb/C
[SA-43] SANTIAGO et al., 2012.
L. amazonensis
Axenic culture
[SA-42] MARTÍNEZ-LUIS et al., 2012.
L. donovani
Axenic culture
[SA-44] MARTÍNEZ-LUIS et al., 2011.
L. donovani
Axenic culture
[SA-45] MORENO et al., 2011.
L. donovani
Axenic culture
[SA-46] VALADARES et al., 2011.
L. amazonensis
L. chagasi
L. major
Peritoneal macrophages from Balb/C
[SA-47] SOUZA-FAGUNDES et al., 2010.
L. amazonensis
Axenic culture
[SA-48] ROSA et al., 2010.
L. amazonensis
Axenic culture
[SA-50] ROSA et al., 2009.
L. amazonensis
Axenic culture
[SA-51] CAMPOS et al., 2009.
L. amazonensis
Axenic culture
[SA-52] PONTIUS et al., 2008
L. donovani
Peritoneal macrophages from Balb/C
[SA-53] MARTÍNEZ-LUIS et al., 2008.
L. donovani
Axenic culture
[SA-56] CORREA et al., 2006.
L. panamensis
Human promonocytes U937
[SA-57] MARINHO et al., 2005.
L. mexicana
Axenic culture
[SA-58] NOLETO et al., 2002.
L. amazonensis
Peritoneal macrophages from Swiss mice
Bone marrow-derived macrophages from
BALB/c
THP-1 (cell line derived from human
monocytes)
120
SUPPLEMENTARY MATERIAL 5
List of articles selected in the systematic review, summarized by bibliographic references and
periodicals in descending order of the year of publication.
Selected Article
Periodicals
[SA-1] LOPES et al., 2020.
Frontiers in Cellular and Infection
Microbiology
[SA-2] OGAKI et al., 2020.
Extremophiles
[SA-3] DE MENEZES et al., 2020.
Extremophiles
[SA-4] GOLIAS et al., 2019.
Brazilian Journal of Microbiology
[SA-5] BRAUN et al., 2019.
Natural Product Research
[SA-6] MALAK et al., 2018.
Journal of Natural Products
[SA-7] DE ALMEIDA et al., 2018.
Natural Product Research
[SA-8] MOTOSHIMA et al., 2018.
Carbohydrate Polymers
[SA-9] SULTANA, et al., 2018.
Experimental Parasitology
[SA-10] ALVES et al., 2018.
Plos One
[SA-11] PERETZ et al., 2018.
International Journal of Medicinal
Mushrooms
[SA-12] COTA et al., 2018.
Memórias do Instituto Oswaldo Cruz
[SA-13] GOMES et al., 2018.
Extremophiles
[SA-14] DERICI et al., 2018.
Biotech
[SA-15] CAMPOS et al., 2017.
Journal of Biosciences
[SA-16] BRISSOW et al., 2017.
Parasitology Research
[SA-17] DA SILVA et al., 2017.
World Journal of Microbiology and
Biotechnology
[SA-18] SIDDIQUI et al., 2017.
Plos One
[SA-19] LELIEBRE-LARA et al., 2016.
Molecules
[SA-20] IBRAHIM et al., 2016a.
Phytochemistry Letters
121
[SA-21] IBRAHIM et al., 2016b.
Fitoterapia
[SA-22] ELKHAYAT et al., 2016.
Natural Product Research
[SA-23] PARRA LIZARAZU et al.,
2016.
Revista Boliviana de Química
[SA-24] DO NASCIMENTO et al., 2015.
World Journal of Microbiology and
Biotechnology
[SA-25] MIKELL et al., 2015.
Chemical and Pharmaceutical Bulletin
[SA-26] MALLICK et al., 2015.
Future Microbiology
[SA-27] CAMPOS et al., 2015.
Memórias do Instituto Oswaldo Cruz
[SA-28] DA LUZ et al., 2015.
The Scientific World Journal
[SA-29] METWALY et al., 2015.
Der Pharma Chemica
[SA-30] MALAK et al., 2014.
Journal of Natural Products
[SA-31] BAYDOUN et al., 2014.
Steroids
[SA-32] RODRIGUES et al., 2014.
Plos One
[SA-33] ORTEGA, et al., 2014.
Natural Product Communications
[SA-34] MALLICK et al., 2014.
Experimental Parasitology
[SA-35] AWAAD et al., 2014.
Phytotherapy Research
[SA-36] SANTOS et al., 2014.
Journal of The Brazilian Chemical Society
[SA-37] MARINHO et al., 2013.
Anais da Academia Brasileira de Ciências
[SA-38] GAMBOA-ANGULO et al.,
2013.
Parasitology Research
[SA-39] LAI et al., 2012.
Chemistry & Biodiversity
[SA-40] VALADARES et al., 2012a.
Experimental Parasitology
[SA-41] VALADARES et al., 2012b.
Parasitology Research
[SA-42] MARTÍNEZ-LUIS et al., 2012.
Natural Product Communications
[SA-43] SANTIAGO et al., 2012.
Extremophiles
[SA-44] MARTÍNEZ-LUIS et al., 2011.
International Microbiology
122
[SA-45] MORENO et al., 2011.
Natural Product Communications
[SA-46] VALADARES et al., 2011.
Parasitology International
[SA-47] SOUZA-FAGUNDES et al.,
2010.
Brazilian Journal of Medical And Biological
Research
[SA-48] ROSA et al., 2010.
Brazilian Journal of Microbiology
[SA-49] YATAWARA et al., 2009.
The Korean Journal of Parasitology
[SA-50] ROSA et al., 2009.
Antonie Van Leeuwenhoek
[SA-51] CAMPOS et al., 2009.
Plos Neglected Tropical Diseases
[SA-52] PONTIUS et al., 2008.
Journal of Natural Products
[SA-53] MARTÍNEZ-LUIS et al., 2008.
Journal of Natural Products
[SA-54] GUIMARÃES et al., 2008.
Fems Immunology & Medical Microbiology
[SA-55] SCHMEDA‐HIRSCHMANN et
al., 2008.
Phytotherapy Research: An International
Journal Devoted to Pharmacological and
Toxicological Evaluation of Natural Product
Derivatives
[SA-56] CORREA et al., 2006.
Phytotherapy Research: An International
Journal Devoted to Pharmacological and
Toxicological Evaluation of Natural Product
Derivatives
[SA-57] MARINHO et al., 2005.
Journal of The Brazilian Chemical Society
[SA-58] NOLETO et al., 2002.
Molecular and Cellular Biochemistry
[SA-59] FOURNET et al., 1997.
Comparative Biochemistry and Physiology
Part C: Pharmacology, Toxicology and
Endocrinology
123
SUPPLEMENTARY MATERIAL 6
List of evaluated fungi present in the systematic review, divided by phyla and genera.
Filo
Genus
Selected Article
1
Ascomycota
Acremonium fusidioides
[SA-2] OGAKI et al., 2020.
2
Basidiomycota
Agaricus blazei Murill
Agaricus blazei Murill
Agaricus blazei Murill
[SA-40] VALADARES et al., 2012a.
[SA-46] VALADARES et al., 2011.
[SA-41] VALADARES et al., 2012b.
3
Basidiomycota
Agrocybe aegerita
[SA-8] MOTOSHIMA et al., 2018.
4
Ascomycota
Alternaria sp.
Alternaria sp.
[SA-43] SANTIAGO et al., 2012.
[SA-48] ROSA et al., 2010.
5
Ascomycota
Antarctomyces psychrotrophicus
[SA-43] SANTIAGO et al., 2012.
6
Ascomycota
Arthrinium sp.
[SA-48] ROSA et al., 2010.
Aspergillus sp.
Aspergillus sp.
Aspergillus sp.
Aspergillus terreus-F7
Aspergillus terréus
Aspergillus sp.
Astraeus hygrometricus
Astraeus hygrometricus
Astraeus hygrometricus
[SA-23] PARRA LIZARAZU et al., 2016.
[SA-32] RODRIGUES et al., 2014.
[SA-42] MARTÍNEZ-LUIS et al., 2012.
[SA-17] DA SILVA et al., 2017.
[SA-22] ELKHAYAT et al., 2016.
[SA-44] MARTÍNEZ-LUIS et al., 2011.
7
Ascomycota
8
Basidiomycota
9
Ascomycota
Aureobasidium pullulans
[SA-49] YATAWARA et al., 2009.
10
Ascomycota
Bipolaris sp. AZ26
Bipolaris sp. C36
[SA-7] DE ALMEIDA et al., 2018.
[SA-7] DE ALMEIDA et al., 2018.
11
Ascomycota
Cadophora luteo-olivacea
[SA-43] SANTIAGO et al., 2012.
12
Ascomycota
Chaetomium sp.
[SA-52] PONTIUS et al., 2008.
13
Ascomycota
Cladonia substellata Vainio
[SA-28] DA LUZ et al., 2015.
14
Ascomycota
Cochliobolus sativus P2-F3
Cochliobolus sp.
Cochliobolus sp.
Cochliobolus sp.
[SA-24] DO NASCIMENTO et al., 2015.
[SA-15] CAMPOS et al., 2017.
[SA-48] ROSA et al., 2010.
[SA-51] CAMPOS et al., 2009.
15
Ascomycota
Colletotrichum sp.
[SA-48] ROSA et al., 2010.
16
Traditional
Zygomycota
Cunninghamella blakesleeana + C.
echinulata
Cunninghamella blakesleeana + C.
echinulata
17
Ascomycota
Curvularia sp. P1-F1
[SA-24] DO NASCIMENTO et al., 2015.
18
Ascomycota
Davidiella tassiana
[SA-43] SANTIAGO et al., 2012.
Diaporthe phaseolorum
Diaporthe phaseolorum -92C
Diaporthe sp.
Diaporthe sp.
Dichotomophtora portulacae
Dichotomophtora boerhaaviae
[SA-54] GUIMARÃES et al., 2008.
[SA-16] BRISSOW et al., 2017.
[SA-44] MARTÍNEZ-LUIS et al., 2011.
[SA-44] MARTÍNEZ-LUIS et al., 2011.
[SA-26] MALLICK et al., 2015.
[SA-34] MALLICK et al., 2014.
[SA-39] LAI et al., 2012.
[SA-18] SIDDIQUI et al., 2017.
[SA-31] BAYDOUN et al., 2014
19
Ascomycota
20
Ascomycota
21
Ascomycota
Drechslera rostrata
[SA-35] AWAAD et al., 2014.
22
Ascomycota
Edenia sp.
Edenia sp.
[SA-53] MARTÍNEZ-LUIS et al., 2008.
[SA-33] ORTEGA, et al., 2014.
23
Ascomycota
Emericella nidulans
[SA-10] ALVES et al., 2018.
24
Ascomycota
Erioderma leylandii (Lichenized fungi)
[SA-59] FOURNET et al.,1997.
[SA-10] ALVES et al., 2018.
[SA-10] ALVES et al., 2018.
124
25
Ascomycota
Eurotium tonpholium
[SA-35] AWAAD et al., 2014.
Fusarium sp.
Fusarium sp.
Fusarium sp.
Fusarium sp.
Fusarium sp. TA50
Fusarium sp. TA54
Geosmithia langdonii
Geosmithia langdonii
[SA-20] IBRAHIM et al., 2016a.
[SA-21] IBRAHIM et al., 2016b.
[SA-27] CAMPOS et al., 2015.
[SA-48] ROSA et al., 2010.
[SA-38] GAMBOA-ANGULO et al., 2013.
[SA-38] GAMBOA-ANGULO et al., 2013.
26
Ascomycota
27
Ascomycota
28
Ascomycota
Gibberella sp.
[SA-48] ROSA et al., 2010.
29
Basidiomycota
Grifola frondosa
[SA-9] SULTANA, et al., 2018.
30
Basidiomycota
Gymnopilus cf. areolatus Murr.
[SA-50] ROSA et al., 2009.
31
Ascomycota
Helgardia sp.
[SA-43] SANTIAGO et al., 2012.
32
Ascomycota
Herpotrichia sp.
[SA-43] SANTIAGO et al., 2012.
33
Ascomycota
Hypocrea sp.
[SA-44] MARTÍNEZ-LUIS et al., 2011.
34
Basidiomycota
Irpex lacteus
[SA-50] ROSA et al., 2009.
35
Basidiomycota
Lentinus cf. strigosus
Lentinus strigosus
[SA-50] ROSA et al., 2009.
[SA-47] SOUZA-FAGUNDES et al., 2010.
36
Ascomycota
Macrophomina phaseolina
[SA-18] SIDDIQUI et al., 2017.
37
Ascomycota
Microdochium sp.
[SA-43] SANTIAGO et al., 2012.
38
Ascomycota
Morchella importuna
[SA-11] PERETZ et al., 2018.
39
Mortierella parvispora
[SA-13] GOMES et al., 2018.
40
Traditional
Zygomycota
Traditional
Zygomycota
Mucor ramannianus
[SA-25] MIKELL et al., 2015.
41
Ascomycota
[SA-44] MARTÍNEZ-LUIS et al., 2011.
[SA-45] MORENO et al., 2011.
42
Ascomycota
Mycosphaerella sp.
Mycosphaerella sp.
N. pseudotrichia
Nectria pseudotrichia
Nectria sp.
43
Ascomycota
Nigrospora sphaerica
[SA-36] SANTOS et al., 2014.
44
Basidiomycota
Nothopanus hygrophanus
[SA-50] ROSA et al., 2009.
45
Ascomycota
Oculimacula sp.
[SA-43] SANTIAGO et al., 2012.
46
Ascomycota
Paecilomyces sp.
[SA-5] BRAUN et al., 2019.
47
Ascomycota
48
Ascomycota
49
Ascomycota
50
Ascomycota
Penicillium allii-sativi
Penicillium chrysogenum
Penicillium chrysogenum
Penicillium chrysogenum
Penicillium herquei
Penicillium janthinellum
Penicillium palitans
Penicillium palitans
Penicillium solitum
Penicillium sp.
Penicillium sp.
Penicillium sp.
Phaeosphaeria herpotrichoides
Phaeosphaeria sp.
Phomopsis sp.
Phomopsis sp. P5-F1
Phyllosticta capitalensis
Phyllosticta sp. ou Guignardia mangiferae
[SA-30] MALAK et al., 2014.
[SA-6] MALAK et al., 2018.
[SA-27] CAMPOS et al., 2015.
[SA-12] COTA et al., 2018.
[SA-44] MARTÍNEZ-LUIS et al., 2011.
[SA-2] OGAKI et al., 2020.
[SA-2] OGAKI et al., 2020.
[SA-3] DE MENEZES et al., 2020.
[SA-13] GOMES et al., 2018.
[SA-37] MARINHO et al., 2013.
[SA-57] MARINHO et al., 2005.
[SA-2] OGAKI et al., 2020.
[SA-3] DE MENEZES et al., 2020.
[SA-2] OGAKI et al., 2020.
[SA-3] DE MENEZES et al., 2020.
[SA-44] MARTÍNEZ-LUIS et al., 2011.
[SA-48] ROSA et al., 2010.
[SA-43] SANTIAGO et al., 2012.
[SA-43] SANTIAGO et al., 2012.
[SA-54] GUIMARÃES et al., 2008.
[SA-24] DO NASCIMENTO et al., 2015.
[SA-4] GOLIAS et al., 2019.
[SA-54] GUIMARÃES et al., 2008.
125
Basidiomycota
Pleurotus flabellatus
[SA-50] ROSA et al., 2009.
52
Ascomycota
Protousnea malacea (Lichenized fungi)
Protousnea poeppigii (Lichenized fungi)
53
Ascomycota
Pseudogymnoascus destructans
Pseudogymnoascus verrucosus
[SA-59] FOURNET et al.,1997.
[SA-55] SCHMEDA-HIRSCHMANN et al.,
2008
[SA-13] GOMES et al., 2018.
[SA-2] OGAKI et al., 2020.
54
Ascomycota
Psoroma pallidum (Lichenized fungi)
[SA-59] FOURNET et al.,1997.
55
Basidiomycota
Pycnoporus sanguineus
[SA-56] CORREA et al., 2006.
56
Ascomycota
Ramalina celastri (Lichenized fungi)
[SA-58] NOLETO et al., 2002.
57
Basidiomycota
Russula albonigra
Russula delica
Russula laurocerasi
[SA-34] MALLICK et al., 2014.
[SA-34] MALLICK et al., 2014.
[SA-34] MALLICK et al., 2014.
58
Ascomycota
Stenocarpella sp.
[SA-44] MARTÍNEZ-LUIS et al., 2011.
59
Basidiomycota
Termitomyces eurhizus
[SA-34] MALLICK et al., 2014.
60
Basidiomycota
Trametes versicolor
[SA-19] LELIEBRE-LARA et al., 2016.
61
Ascomycota
Trichoderma asperelloides
[SA-1] LOPES et al., 2020.
62
Basidiomycota
Tricholoma giganteum
[SA-34] MALLICK et al., 2014.
63
Ascomycota
Trichosporum sp.
[SA-29] METWALY et al., 2015.
64
Ascomycota
Usnea florida (Lichenized fungi)
[SA-55] SCHMEDA-HIRSCHMANN et al.,
2008.
65
Ascomycota
Vermisporium-like
[SA-10] ALVES et al., 2018.
66
Ascomycota
Verticillium sp. TH28
[SA-38] GAMBOA-ANGULO et al., 2013.
67
Ascomycota
Xylaria sp.
Xylaria sp.
[SA-27] CAMPOS et al., 2015.
[SA-44] MARTÍNEZ-LUIS et al., 2011.
68
Ascomycota
Xylariaceae sp.
[SA-44] MARTÍNEZ-LUIS et al., 2011.
2TA2 strain
Basidiomycete
cepa F0194
Fungal endophyte UFMCB 914
Lichenized fungi
[SA-38] GAMBOA-ANGULO et al., 2013.
[SA-50] ROSA et al., 2009.
[SA-44] MARTÍNEZ-LUIS et al., 2011.
[SA-48] ROSA et al., 2010.
[SA-14] DERICI et al., 2018.
Not identified
51
126
SUPPLEMENTARY MATERIAL 7
List of chemical classes of isolated fungal compounds with leishmanicidal activity,
summarized in alphabetical order.
Chemical Class
Isolated Substance
Fungi
Selected
Article
1
Acids
10-acetyl trichoderonic acid A
Nectria pseudotrichia
[AS-12]
2
Acids
6'-acetoxy-piliformic acid
Nectria pseudotrichia
[AS-12]
3
Alcohols
4-[2′,4′-dihydroxy-6′-(hydroxymethyl)
Geosmithia langdonii
[SA-30]
4
Alcohols
(4S,5S)-4,5-dihydroxy-2methylcyclohex-2-enone
Geosmithia langdonii
[SA-30]
5
Alcohols
3-hydroxybenzyl alcohol
Geosmithia langdonii
[SA-30]
6
Alcohols
2,5-dihydroxybenzyl alcohol
Geosmithia langdonii
[SA-30]
Benzofurans
Usnic acid
Lichenized fungi (N.I.)
[SA-14]
Benzofurans
Usnic acid
Benzofurans
Usnic acid
Benzofurans
(+)Usnic acid
8
Butenolide
Terrein
9
Carbasugar
10
Carbasugar
11
Depsides
12
7
Cladonia substellata Vainio (Lichenized
fungi)
Usnea florida (Lichenized fungi)
Protousnea malacea (Stirt) Krog.
(Lichenized fungi)
[SA-28]
[SA-55]
[SA-59]
Aspergillus terreus - F7
[SA-17]
Geosmithia langdonii
[SA-6]
Geosmithia langdonii
[SA-6]
Divaricatinic acid
Usnea florida (Lichenized fungi)
[SA-55]
Depsides
Isodivaricatic acid
Protousnea poeppigii (Lichenized fungi)
[SA-55]
13
Depsides
Isodivaricatic acid diacetate
Protousnea poeppigii (Lichenized fungi)
[SA-55]
14
Depsides
1′-Chloropannarine
Erioderma leylandii (Lichenized fungi)
[SA-59]
15
Depsides
Pannarine
16
Enzymes
Preussomerin EG1
Edenia sp.
[SA-53]
17
Ergostanes
Trametenolic acid B
Trametes versicolor
[SA-19]
18
Flavanones
1,3-cis-1-Methoxy-1-(2,5dihydroxyphenyl)-3-hydroxy-3phenylpropane
Mucor ramannianus
[SA-25]
19
Lactones
Butyrolactone I
Aspergillus terreus - F7
[SA-17]
20
Lactones
Butyrolactone V
Aspergillus terreus - F7
[SA-17]
21
Lactones
Harzialactone A
Paecilomyces sp.
[SA-5]
(1S,2R,3R,4R,5R)-2,3,4-trihydroxy-5methylcyclohexyl-2′,5′dihydroxybenzoate
(1S,2S,3S,4R,5R)- 4-[(2′,5′dihydroxybenzyl)oxy]-5methylcyclohexane-1,2,3-triol
Psoroma pallidum Nyl. (Lichenized
fungi)
[SA-59]
127
22
Lactones
Terrenolide S
Aspergillus terreus
[SA-22]
23
Mycotoxins
18-des-hydroxy Cytochalasin H
Diaporthe phaseolorum -92C
[SA-16]
24
Naphthalenes
Palmarumycin CP18
Edenia sp.
[SA-33]
25
Naphthalenes
Palmarumycin CP2
Edenia sp.
[SA-53]
26
Naphthalenes
Palmarumycin CP17
Edenia sp.
[SA-53]
27
Naphthalenes
Palmarumycin CP18
Edenia sp.
[SA-53]
28
Oxygenated
cyclohexene
(+)-epiepoformin
Geosmithia langdonii
[SA-30]
29
Peptides
(6-S)-3-(1,3-dihydroxypropyl)-6-(2methylpropyl)piperazine-2,5-dione
Trichosporum sp.
[SA-29]
30
Phenalenes
Cercosporin
Mycosphaerella sp.
[SA-45]
31
Phenalenes
Cercosporin acetylate
Mycosphaerella sp.
[SA-45]
32
Phenols
benzyl]benzene-1,2-dio
Geosmithia langdonii
[SA-30]
33
Phenols
2,5-dihydroxybenzaldehyde
Geosmithia langdonii
[SA-30]
34
Phenols
3-hydroxytoluene
Geosmithia langdonii
[SA-30]
35
Phthalates
di-2-ethylhexyl phthalate
Drechslera rostrata
[SA-35]
36
Polyketides
Citreorosein
Penicillium herquei
[SA-37]
37
Polyketides
Emodin
Penicillium herquei
[SA-37]
38
Polyketides
Janthinone
Penicillium herquei
[SA-37]
39
Polyketides
Citrinin
Penicillium janthinellum
[SA-57]
40
Polysaccharides
Fucogalactan FG-Aa
Agrocybe aegerita
[SA-8]
41
Polysaccharides
GMPOLY
Ramalina celastri (Lichenized fungi)
SA-58]
42
Polysaccharides
GMPOLYVO
Ramalina celastri (Lichenized fungi)
SA-58]
43
Pyranone
Kojic acid (KA)
Aspergillus sp.
[SA-32]
44
Pyrrolidines
Pseurotin A
Aspergillus sp.
[SA-42]
45
Pyrrolidines
14-norpseurotin A
Aspergillus sp.
[SA-42]
46
Pyrrolidines
FD-838
Aspergillus sp.
[SA-42]
47
Pyrrolidines
Pseurotin D
Aspergillus sp.
[SA-42]
48
Quinones
2-hidroxifenilquinoline
Aspergillus sp.
[SA-23]
49
Quinones
1,8-dihydroxy-3-methoxy-6-methylanthraquinone
Eurotium tonpholium
[SA-35]
50
Quinones
Anhydrocochlioquinone A
Cochliobolus sp.
[SA-15]
51
Quinones
Cochlioquinone A + isocochlioquinone
Cochliobolus sativus P2-F3
[SA-24]
128
52
Quinones
Anhydrocochlioquinone A
Cochliobolus sativus P2-F3
[SA-24]
53
Quinones
Fumoquinone B
Aspergillus sp.
[SA-42]
54
Quinones
Cochlioquinone A
Cochliobolus sp.
[SA-51]
55
Quinones
Isocochlioquinone A
Cochliobolus sp.
[SA-51]
56
Quinones
CJ-12,371
Edenia sp.
[SA-53]
57
Steroids
Cunninghamella blakesleeana +
Cunninghamella echinulata
[SA-18]
58
Steroids
6β,17β-dihydroxy-7α,17α-dimethylestr4-en-3-one
11β,17β-dihydroxy-7α,17αdimethylestr-4-en-3-one
Macrophomina phaseolina
[SA-18]
59
Steroids
Ergosterol peroxide
Trametes versicolor
[SA-19]
60
Steroids
Nandrolone
61
Steroids
62
Steroids
63
Steroids
64
Steroids
65
Steroids
66
Steroids
67
10β,16α,17β-trihydroxy-19-nor-4androsten-3-one
6β,10β,17β-trihydroxy-19-nor-4androsten-3-one
10β,17β-dihydroxy-19-nor-4-androsten3-one
6β,17β-dihydroxy-19-nor-4-androsten3-one
10β-hydroxy-19-nor-4-androsten-3,17dione
16b,17b-Dihydroxy-19-nor-4-androsten3-one
Cunninghamella echinulata +
Cunninghamella blakesleeana
Cunninghamella echinulata +
Cunninghamella blakesleeana
Cunninghamella echinulata +
Cunninghamella blakesleeana
Cunninghamella echinulata +
Cunninghamella blakesleeana
Cunninghamella echinulata +
Cunninghamella blakesleeana
Cunninghamella echinulata +
Cunninghamella blakesleeana
Cunninghamella echinulata +
Cunninghamella blakesleeana
Terpenes
hydroheptelidic acid
Nectria pseudotrichia
[AS-12]
68
Terpenes
Aphidicolin
Nigrospora sphaerica
[SA-36]
69
Terpenes
3-deoxy-aphidicolin
Nigrospora sphaerica
[SA-36]
70
Terpenes
3-oxoaphidicolin
Nigrospora sphaerica
[SA-36]
71
Terpenes
3-oxime-aphidicolin
Nigrospora sphaerica
[SA-36]
72
Terpenes
Panepoxydone
Lentinus strigosus
[SA-47]
73
Terpenes
Hypnophilin
Lentinus strigosus
[SA-47]
Terpenes
Astrakurkurone
Astraeus hygrometricus
[SA-26]
Terpenes
Astrakurkurone
Astraeus hygrometricus
[SA-39]
75
Terpenes
(22E,24R)-stigmasta-5,7,22-trien-3-β-ol
Aspergillus terreus
[SA-22]
76
Terpenes
stigmast-4-ene-3-one
Aspergillus terreus
[SA-22]
77
Terpenes
Integracides H
Fusarium sp.
[SA-20]
78
Terpenes
Integracides J
Fusarium sp.
[SA-20]
79
Terpenes
Integracides F
Fusarium sp.
[SA-21]
80
Terpenes
Integracides G
Fusarium sp.
[SA-21]
[SA-31]
[SA-31]
[SA-31]
[SA-31]
[SA-31]
[SA-31]
[SA-31]
74
129
81
Vitamins
Ergosterol 5,8‐endoperoxide
Pycnoporus sanguineus
[SA-56]
82
Xanthones
Chaetoxanthone C1
Chaetomium sp.
[SA-52]
83
Xanthones
Chaetoxanthone C2
Chaetomium sp.
[SA-52]
84
Xanthones
Chaetoxanthone C3
Chaetomium sp.
[SA-52]
130
6 CONCLUSÕES
▪ O estudo experimental com extratos pigmentados obtidos de bactérias isoladas do ambiente
antártico, permitiu constatar a atividade leishmanicida in vitro desses metabolitos contra
formas promastigotas de L. (L.) chagasi, entretanto não foi observado atividade contra a
espécie L. (L.) amazonensis. Além disso o ensaio de viabilidade celular não mostrou efeito
deletério dos extratos para as células da linhagem J774.A1 nas mesmas concentrações
testadas nas promastigotas, evidenciando a toxicidade seletiva contra os parasitos.
▪ A revisão sistemática acerca da atividade leishmanicida de bioprodutos fúngicos mostrou
um panorama do atual dos esforços na procura de alternativas para a farmacoterapia da
leishmaniose explorando a biodiversidade de compostos naturais.
▪ Os resultados obtidos no estudo experimental, em conjunto com as evidências reportadas
pelas publicações reunidas na revisão sistemática, indicam na prospecção de produtos
microbianos um caminho promissor rumo ao desenvolvimento de novas entidades químicas
para o combate à leishmaniose.
131
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