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                    1

d

UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS
FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS

Lilyana Waleska Nunes Albuquerque

Prototipação de um novo método diagnóstico e avaliação in vitro de nova estratégia
terapêutica para a leishmaniose

Maceió
2023

1

LILYANA WALESKA NUNES ALBUQUERQUE

Prototipação de um novo método diagnóstico e avaliação in vitro de nova estratégia
terapêutica para a leishmaniose

Dissertação de Mestrado apresentado ao Programa de
Pós- graduação em Ciências Médicas da Universidade
Federal de Alagoas-UFAL, como parte das exigências
para a obtenção do título de Mestre em Ciências
Médicas.
Área de Concentração: Estudos Clínicos e Laboratoriais
em Ciências Médicas.
Orientador: Profa. Dra. Aline Cavalcanti de Queiroz
Coorientadores: Profa. Dra. Magna Suzana Alexandre
Moreira e Prof. Dr. Alysson Wagner Fernandes Duarte

Maceió
2023

Catalogação na Fonte
Universidade Federal de Alagoas
Biblioteca Central
Divisão de Tratamento Técnico
Bibliotecário: Marcelino de Carvalho Freitas Neto – CRB-4 – 1767
A345p

Albuquerque, Lilyana Waleska Nunes.
Prototipação de um novo método diagnóstico e avaliação in vitro de nova
estratégia terapêutica para a leishmaniose / Lilyana Waleska Nunes
Albuquerque. – 2023.
114 f. : il.
Orientadora: Aline Cavalcanti der Queiroz.
Co-orientadora: Magna Suzana Alexandre Moreira.
Co-orientador: Alysson Wagner Fernandes Duarte.
Dissertação (Mestrado em Ciências Médicas) – Universidade Federal de
Alagoas. Faculdade de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Ciências
Médicas. Maceió, 2023.
Inclui produto educacional.
Bibliografia: f. 106-114.
1. Leishmaniose. 2. Prospecção tecnológica. 3. Testes imunológicos. 4.
Acustofluídica. 5. Naftoquinonas. I. Título.
CDU: 616.928.5

FolhadeAprovação
Lilyana Waleska Nunes Albuquerque
Prototipação de um novo método diagnóstico e avaliação in vitro de nova estratégia
terapêutica para a leishmaniose

Dissertação submetida ao Programa
de Pós-Graduação em Ciências
Médicas da Universidade Federal de
Alagoas.
________________________________________________________________________________

Profa. Dra. Aline Cavalcanti deQueiroz
UFAL / Campus Arapiraca
Orientadora
________________________________________________________________________________

Profa. Dra. Magna Suzana Alexandre Moreira
UFAL/CampusA. C. Simões
Coorientadora
________________________________________________________________________________

Prof. Dr. Alysson Wagner Fernandes Duarte
UFAL/CampusArapiraca
Coorientador
BancaExaminadora:
________________________________________________________________________________

Profa. Dra. Juliana Célia de Farias Santos
UFAL/CampusA. C. Simões
Examinadora interna à UFAL e ao PPGCM
________________________________________________________________________________

Prof. Dr. Glauber José Ferreira Tomaz da Silva
UFAL/CampusA. C. Simões
Examinador interno à UFAL e externo ao PPGM
________________________________________________________________________________

Profa. Dra. Andressa Letícia Lopes da Silva
UNINASSAU
Examinadora externa à instituição

4
RESUMO

O diagnóstico não precoce e de baixa precisão diminui as chances de cura da leishmaniose,
visto que os tratamentos disponíveis são limitados, tóxicos e induzem resistência. O objetivo
deste trabalho é desenvolver um novo método de imunodiagnóstico para leishmaniose
tegumentar, utilizando técnicas acustofluídicas, bem como avaliar a atividade leishmanicida de
derivados 1,4-naftoquinonas in vitro. Assim, foi realizado uma prospecção tecnológica de
novos métodos de imunodiagnóstico para leishmaniose tegumentar. Por conseguinte, foram
produzidos antígenos de Leishmania amazonensis para aplicação nos testes de desempenho em
dispositivo acustofluídico, afim de avaliar a eficiência do imunoensaio co diferentes amostras
biológicas. Além disso, foi determinado a citotoxicidade e potencial leishmanicida de derivados
1,4-naftoquinonas e seu potencial leishmanicida contra formas promastigotas de diferentes
espécies de Leishmania spp.. A prospecção tecnológica reuniu 11 documentos de patentes, cuja
a maioria foram depositadas no Brasil. As patentes avaliadas trazem perspectivas diferentes na
utilização dos métodos já existentes. Quanto ao desenvolvimento do novo método diagnóstico,
os antígenos produzidos foram eficientemente aprisionados no dispositivo acustofluídico em
um intervalo de tempo de até 10 minutos e utilizando um baixo volume de amostra, 5 μL. O
padrão de imagem entre amostras negativas e positivas foi muito semelhante e revela uma
limitação que a técnica possui em fazer esta diferenciação, uma vez que o dispositivo aglomerou
os antígenos em todas as amostras. Nos estudos farmacológicos, os resultados indicaram que
todos os derivados de 1,4-naftoquinonas apresentaram potente atividade leishmanicida contra
L. chagasi e L. amazonensis, em especial o JN22 que apresentou IC50 de 1,64 μg/mL e 5,07
μg/mL, respectivamente, com seletividade superior ou equivalente à anfotericina B, sem causar
efeito deletério para os macrófagos. Desta forma, o trabalho trouxe abordagens inovadoras para
o desenvolvimento de novas estratégias para diagnóstico e tratamento da doença, porém há a
necessidade de continuação dos estudos para superar as limitações observadas nos testes de
imunoaglutinação, bem como para determinar a atividade anti-amastigota e o mecanismo de
ação do composto JN22.
Palavras-chave:

Leishmaniose.

Acustofluídica. Naftoquinonas.

Prospecção

tecnológica.

Imunodiagnóstico.

5
ABSTRACT

Early and low-precision diagnosis decreases the chances of curing leishmaniasis, since the
available treatments are limited, toxic and induce resistance. The objective of this work is to
develop a new method of immunodiagnosis for tegumentary leishmaniasis, utilizing
acustofluidic techniques, as well as to evaluate the leishmanicidal activity of 1,4naphthoquinone derivatives in vitro. Thus, a technological prospection of new methods of
immunodiagnosis for tegumentary leishmaniasis was conducted. Therefore, Leishmania
amazonensis antigens were produced for application in performance tests in acustofluidic
device, in order to evaluate the efficiency of the immunoassay with different biological
samples. Furthermore, the cytotoxicity and leishmanicidal potential of 1,4-naphthoquinone
derivatives and their leishmanicidal potential against promastigotes of different species of
Leishmania spp. were determined. The technological prospection brought together 11 patent
documents, most of which were deposited in Brazil. The evaluated patents presented different
perspectives in the use of existing methods. As for the development of the new diagnostic
method, the produced antigens were efficiently trapped in the acustofluidic device in a time
interval of up to 10 minutes and using a low sample volume, 5 μL. The image pattern between
negative and positive samples was very similar and reveals a limitation that the technique has
in making this differentiation, since the device agglomerated the antigens in all samples. In
the pharmacological studies, the results indicated that all 1,4-naphthoquinone derivatives
showed potent leishmanicidal activity against L. chagasi and L. amazonensis, especially JN22,
which showed an IC50 of 1.64 μg/mL and 5.07 μg/ mL, respectively, with selectivity superior
or equivalent to amphotericin B, without causing a deleterious effect on macrophages. In this
way, the present research brought innovative approaches for the development of new strategies
for diagnosis and treatment of the disease, but there is a need for further studies to overcome
the limitations observed in immunoagglutination tests, as well as to determine the antiamastigote activity and the mechanism of action of the compound JN22.
Keywords: Leishmaniasis. Technological prospecting. Immunodiagnosis. Acoustofluidics.
naphthoquinones.

6
LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1- Fatores determinantes da saúde................................................................................ 14
Figura 2 - Intervenções de saúde pública recomendadas para o manejo das DNs...................15
Figura 3 – Flebotomíneo (hospedeiro invertebrado dos parasitos de Leishmania
spp.)...........................................................................................................................................16
Figura 4 - Formas evolutivas: promastigotas (A e C) e amastigotas (B e D)..........................18
Figura 5 - Ciclo de vida da Leishmania spp.............................................................................19
Figura 6 - Mecanismos imunológicos na leishmaniose.................................................. .........22
Figura 7 - Leishmaniose cutânea: localizada (A), mucocutânea (B) e difusa (C)......... ..........23
Figura 8 - Leishmaniose visceral

....................................................................................24

Figura 9 - Situação de endemicidade da leishmaniose visceral no mundo, 2020 ....................24
Figura 10 - Situação de endemicidade da leishmaniose cutânea no mundo, 2020 ..................25
Figura 11 - Esfregaço por escarificação para demonstração direta do parasito .......................26
Figura 12 - Abordagens diagnósticas para leishmaniose .........................................................29
Figura 13 - Funcionamento do dispositivo de acustofluídica. (a) Esquemático do dispositivo
de acustofluídica. (b) Bio-partículas dentro da microcavidade. (c) Biopartículas concentradadas
com o dispositivo ligado............................................................................................................30
Figura 14 - Naftoquinonas clássicas: lapachol e β-lapachol.......................................... .........36
Figura 15 - Planejamento estrutural de derivados 1,4-naftoquinônicos...................................37
Figura 16 – Ensaio de viabilidade celular.................................................................................41

7
LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Taxonomia do gênero Leishmania spp........................................................

17

Quadro 2 - Fármacos leishmanicidas mecanismo de ação, regime terapêutico, eficácia clínica,
toxicidade e custo ......................................................................................................................32

8
SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO...............................................................................................................10
2 OBJETIVOS....................................................................................................................12
2.1 Objetivo geral...............................................................................................................12
2.2 Objetivos específicos.....................................................................................................12
3 REVISÃO DE LITERATURA.......................................................................................13
3.1 Doenças negligenciadas (DNs).....................................................................................13
3.2 Leishmaniose.................................................................................................................16
3.2.1 Ciclo de vida de Leishmania spp............................................................................18
3.2.2 Imunopatogênese da leishmaniose..........................................................................20
3.2.3 Classificação e manifestações clínicas...................................................................22
3.2.4 Situação epidemiológica.........................................................................................24
3.3 Diagnóstico da leishmaniose........................................................................................26
3.3.1 Pesquisa e desenvolvimento de novos métodos de diagnóstico.............................27
3.3.2 Potencial da tecnologia acustofluídica para o desenvolvimento de novos métodos
de diagnóstico..................................................................................................................29
3.3 Tratamento farmacológico da leishmaniose..............................................................31
3.3.1 Potencial leishmanicida das naftoquinonas............................................................35
4 METODOLOGIA...........................................................................................................38
4.1

Prospecção

tecnológica

de

novos

métodos

de

imunodiagnóstico

para

leishmaniose tegumentar...........................................................................................38
4.2 Desenvolvimento de um novo método de diagnóstico, utilizando tecnologia
acustofluídica para diagnóstico da leishmaniose tegumentar...............................38
4.2.1 Planejamento e fabricação do dispositivo acustofluídico.......................................38
4.2.2 Manutenção da cepa de L. amazonensis.................................................................38
4.2.3 Preparação de antígenos de promastigotas de L. amazonensis...............................39
4.2.4 Coloração de antígenos de promastigotas de L. amazonensis................................39
4.2.5 Armadilhamento de antígenos de promastigotas de L. amazonensis......................39
4.2.6 Avaliação da eficiência do ensaio de imunoaglutinação direta em aparelho
acustofluídico, utilizando amostras de saliva, urina, sangue total, soro e plasma...........40

9
4.3

Estudo

da

avaliação

do

potencial

leishmanicida

de

derivados

de

naftoquinonas..............................................................................................................40
4.3.1 Obtenção das substâncias........................................................................................40
4.3.2 Manutenção de linhagem de macrófagos.................................................................40
4.3.3 Determinação da viabilidade celular........................................................................41
4.3.4 Ensaio de viabilidade de promastigotas de Leishmania spp....................................41
4.3.5 Análise estatística.....................................................................................................42
5 PRODUTOS......................................................................................................................43
5.1 Produto 1........................................................................................................................44
5.2 Produto 2........................................................................................................................69
5.3 Produto 3........................................................................................................................89
6 CONCLUSÕES................................................................................................................103
REFERÊNCIAS................................................................................................................104

10
1 INTRODUÇÃO

Denomina-se leishmaniose o complexo de doenças causadas por protozoários
pertencentes ao gênero Leishmania, da família Tripanossomatidae. Esses protozoários podem
causar uma complexidade de manifestações e formas clínicas, que inclui a leishmaniose cutânea
(LC), leishmaniose mucocutânea (LMC) e leishmaniose visceral (LV) (WHO, 2022). O ciclo
de vida desses parasitos é complexo, sendo parte no inseto vetor da doença, o flebotomíneo e
outra parte no seu hospedeiro vertebrado, humanos e outros animais mamíferos, o que
caracteriza a leishmaniose como uma importante zoonose (EFSTATHIOU; SMIRUS, 2021).
No ano de 2019 a leishmaniose passou a ser endêmica em 102 países e territórios,
causando a morte de 20 a 30 mil pessoas por ano. Cerca de 1 bilhão de pessoas vivem em áreas
de alto risco de infecção, especialmente em zonas rurais, sendo classificada pela OMS como
uma das cinco maiores doenças parasitárias do mundo (WHO, 2022; OPAS, 2019). Apesar de
primariamente rurais, as leishmanioses estão em constante processo de expansão, afetando
também áreas urbanas, muito em função do êxodo rural (VON PHILIPSBORN et al., 2015). A
migração de pessoas infectadas para áreas de pouca transmissão ou a mobilidade de pessoas
não imunes a regiões endêmicas é um fator crucial na transmissibilidade das leishmanioses
(MITRA; MAWSO, 2017; WHO, 2022).
Os fatores geográficos, sociais e econômicos estão fortemente associados às
leishmanioses, afetando principalmente populações pobres e com poucos recursos de saúde, o
que classifica as leishmanioses como doenças negligenciadas (DNs) (WHO, 2022). O
diagnóstico precoce e o tratamento adequado são a chave para o seu controle no mundo,
entretanto, possuem limitações e desvantagens que favorecem a manutenção dos parasitos
circulantes. A pesquisa para o desenvolvimento de novos métodos de diagnóstico e novos
tratamentos é também limitada, pois apresenta pouco ou nenhum lucro para a indústria
farmacêutica, dificultando ainda mais a erradicação dos parasitos (EFSTATHIOU; SMIRUS,
2021).
Os fármacos atualmente disponíveis são limitados em número, além de tóxicos, com
eficácia variável, caros, induzem resistência parasitária e possuem dificuldade na
administração. Os fármacos à base de antimônio foram os primeiros fármacos utilizados no
tratamento das leishmanioses e seguem até hoje como tratamento de primeira linha. A
anfotericina B, paramomicina e miltefosina são fármacos de segunda escolha , mas possuem os
mesmos problemas dos antimoniais (ULIANA; TRINCONI; COELHO, 2018). A síntese de
novos derivados a partir de moléculas conhecidamente ativas contra os parasitos de Leishmania

11
spp., constituem uma das principais alternativas na descoberta de novos fármacos. As
naftoquinonas e seus derivados possuem um alto potencial farmacológico, com atividade
antiparasitária, antitumoral e antibacteriana conhecida, indicando uma opção assertiva para
estudos da atividade leishmanicida (MERRITT et al., 2014).
Assim como o tratamento, o diagnóstico da leishmaniose é restringido a poucas
alternativas. Baseia-se em métodos de visualização direta dos parasitos por meio da biópsia ou
punção aspirativa dos órgãos acometidos, todavia, é uma técnica de elevado custo e bastante
invasiva, além de requererem pessoal especializado e aparato hospitalar (BURZA; CROFT;
BOELAERT, 2018). O diagnóstico sorológico a partir da imunoaglutinação direta, ELISA e
imunofluorescência possui baixa sensibilidade e especificidade, portanto, dificilmente pode ser
adotado como uma boa ferramenta diagnóstica (MONTEIRO; MACHADO; ROCHA-SILVA,
2018).
Embora haja diversas técnicas para o diagnóstico, ainda não se tem uma que facilite o
seu uso na rotina, havendo a necessidade de desenvolver um método mais rápido, eficaz, seguro,
de fácil execução e de baixo custo. O diagnóstico utilizando técnicas microfluídicas é uma
ferramenta inovadora e capaz de minimizar os problemas que os métodos diagnósticos para
leishmaniose possuem. A principal função do dispositivo microfluídico é aumentar a
probabilidade do encontro entre antígenos e anticorpos por meio da aglutinação proporcionada
por ondas ultrassônicas, o que pode aumentar a sensibilidade e especificidade do diagnóstico
(WIKLUND; RADEL; HAWKES, 2013).
Com isto, o objetivo deste trabalho é realizar testes em um protótipo de um novo método
imunodiagnóstico para leishmaniose tegumentar, utilizando pela primeira vez tecnologia
acustofluídica. Além disso, avaliar a atividade leishmanicida de novos derivados
naftoquinônicos, que possam constituir novas opções terapêuticas mais seguras e eficazes para
o tratamento das leishmanioses.

12
2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral
Desenvolver um protótipo para método diagnóstico utilizando tecnologia acustofluídica
para leishmaniose tegumentar e avaliar a atividade leishmanicida de novos derivados
naftoquinônicos.

2.2 Objetivos específicos

▪

Realizar uma revisão patentária acerca de novos métodos de imunodiagnóstico para
leishmaniose tegumentar na última década;

▪

Produzir antígenos de promastigotas fragmentadas de L. amazonensis;

▪

Realizar testes de desempenho utilizando os antígenos produzidos em dispositivo
acustofluídico;

▪

Avaliar a eficiência do imunoensaio de imunoaglutinação direta em dispositivo
acustofluídico para se diagnosticar as leishmanioses, utilizando amostras de saliva, urina,
sangue total, soro e plasma.

▪

Determinar a citotoxicidade dos compostos sintéticos;

▪

Investigar a atividade dos derivados sintéticos sobre formas promastigotas extracelulares
de L. amazonensis e L. chagasi em ensaio in vitro;

▪

Identificar a seletividade dos compostos para diferentes espécies do gênero Leishmania
spp.;

13
3 REVISÃO DE LITERATURA

3.1 Doenças negligenciadas (DNs)

As doenças negligenciadas (DNs) se referem às patologias que afetam populações
economicamente desfavoráveis e marginalizadas, suscitando um grave problema de saúde
pública mundial. De acordo com os critérios estabelecidos pela Organização Mundial da Saúde
(OMS), as DNs são classificadas como causadoras de altos índices de morbimortalidade,
afetando especialmente populações residentes em regiões tropicais e subtropicais (OMS, 2021).
Essas doenças podem ser prevenidas ou até mesmo controladas por intermédio de ações de
serviços de saúde, entretanto, a negligência dos órgãos públicos de saúde, a escassez de
investimento pela pesquisa científica e a falta de financiamento do setor público e privado,
silenciam a dor de milhares de pessoas expostas em ambientes propícios para o aparecimento
dessas doenças (CASULLI, 2021).
As DNs podem ser divididas em diferentes categorias, como: infecções parasitárias,
helmínticas, bacterianas, virais, fúngicas, ectoparasitárias ou intoxicação por veneno. Cerca de
um bilhão de pessoas no mundo são afetadas pelas doenças negligenciadas parasitárias,
especialmente indivíduos vulneráveis, do ponto de vista econômico, social e imunológico
(ROGERS et al., 2021). O comportamento e as particularidades dessas doenças prestam um
papel importante como indicadores de desenvolvimento das regiões afetadas. A problemática
das DNs envolve desde a exposição dos indivíduos a fatores de risco para a transmissão até o
tratamento inadequado ou inexistente. A ocorrência de DNs são diretamente influenciadas pelos
determinantes sociais da saúde (Figura 1) (DE SOUZA et al., 2020; WELD et al., 2022).

Figura 1- Fatores determinantes da saúde

14

Figura SEQ Figura \* ARABIC 2 - Intervenções
de saúde pública recomendadas para o manejo
das DNsFigura SEQ Figura \* ARABIC 3Fatores determinantes da saúde

Figura SEQ Figura \* ARABIC 4 - Intervenções
de saúde pública recomendadas para o manejo
das DNs

Figura
SEQ Figura \* ARABIC 5 FlebotomíneoFigura SEQ Figura \* ARABIC 6
- Intervenções de saúde pública recomendadas
para o manejo das DNsFigura SEQ Figura \*
Fonte: Modeloda
de Dahlgren
ARABIC 7- Fatores determinantes
saúde e Whitehead (1991).
Os fatores socioeconômicos exercem papel fundamental para a manutenção das DNs
Figura SEQ Figura \* ARABIC 8 - Intervenções
parasitárias,
especialmente
as leishmanioses,
uma vez que a pobreza aumenta o risco dessa
de
saúde pública
recomendadas
para o manejo
das
DNsFigura
SEQ Figura
\* condições
ARABICprecárias
9doença,
pois está diretamente
ligada às
de habitação e a falta de saneamento
Fatores determinantes da saúde
básico, gerando lugares propícios para a reprodução dos flebotomíneos, vetores invertebrados
dos parasitos de Leishmania spp. Além disso, hábitos como deitar no chão ou no ar livre
Figura
SEQ Figura \* ARABIC 10 também
aumentam
o riscopública
de infecção
por leishmaniose; a pobreza gera um estado de
Intervenções de saúde
recomendadas
para
o manejo
das DNs aumentando o risco de infecção e a escassez de nutrientes e minerais
desnutrição
nos indivíduos,
acabam depletando o sistema de defesa desses indivíduos que acabam progredindo para a
infecção, de SEQ
fato, estabelecida
(WHO,
2022). 11 Figura
Figura \*
ARABIC
FlebotomíneoFigura
SEQ de
Figura
\* ARABIC
É urgente a necessidade
pesquisa
e desenvolvimento na área de DNs. Gerenciar essas
12 - Intervenções de saúde pública
doenças
garantiria
controle
da transmissão,
diagnóstico precoce e tratamento adequado,
recomendadas
para
o manejo
das DNs
todavia, há falta de infraestrutura e recursos em todas essas etapas. Os programas de assistência
àFigura
saúde dos
indivíduos
não dispõem
SEQ
Figura doentes
\* ARABIC
13 - de material adequado para a coleta,
Flebotomíneo
armazenamento e transporte, ou ainda não possuem pessoal qualificado (MIGUEL et al., 2021).
Além disso, há escassez de métodos diagnósticos e opções farmacológicas efetivas e
de baixo custo.
Os esforços
atuais
aquém do
Quadro
SEQ
Quadro
\* estão
ARABIC
1 que
- seria justo e equitativo para solucionar
Taxonomia
dodas
gênero
LeishmaniaFigura
SEQ nas áreas endêmicas para as DNs acabou
a problemática
DNs. A
pandemia da COVID-19
Figura \* ARABIC 14 - FlebotomíneoFigura
comprometendo
mais estes
tanto
SEQ
Figura \* ainda
ARABIC
15 - progressos,
Intervenções
deem função da estagnação dos serviços de
saúde
pública
recomendadas
para
o
manejo
saúde no combate às DNs, como do risco de co-infecção entre o coronavírus e patógenos
das DNs
associados (BAĞCI, 2021).
As doenças tropicais negligenciadas parasitárias (DTNs) afetam mais de um bilhão de
Figura
SEQ Figura \* ARABIC 16 FlebotomíneoFigura SEQ Figura \* ARABIC
17 - Intervenções de saúde pública
recomendadas para o manejo das DNsFigura
SEQ Figura \* ARABIC 18- Fatores

15
pessoas em todo o mundo, com indivíduos de comunidades pobres sendo os mais vulneráveis
e os que mais sofrem (OMS, 2021). Os programas de gerenciamento de doenças são
prejudicados pela falta de infraestrutura e recursos para coleta, armazenamento e transporte de
amostras clínicas e pela escassez de métodos diagnósticos sensíveis, baratos e precisos.
Associado a isto, os fatores ambientais, como o desmatamento, mudanças na temperatura e
umidade, implicam diretamente no comportamento dos vetores e no desenvolvimento dos
parasitos (VON PHILIPSBORN et al., 2015; CASULLI, 2021; WELD et al., 2022).
A OMS adota uma estratégia comum para combater as DNs por meio de cinco
instrumentos fundamentais no setor de saúde pública. Rápidas soluções médicas, como a gestão
de doenças e o tratamento preventivo em larga escala, além de ferramentas úteis na prevenção
da transmissão, como o acesso à água, saneamento básico e higiene, manejo integrado de
vetores e saúde pública veterinária (Figura 2). O conjunto dessas intervenções causam um
impacto significativo na prevenção, controle e até erradicação dessas doenças (ENGELS;
ZHOU et al., 2020).

Figura 2 - Intervenções de saúde pública recomendadas para o manejo das DNs

Figura SEQ Figura \* ARABIC 28 - FlebotomíneoFigura SEQ Figura \* ARABIC
29 - Intervenções de saúde pública recomendadas para o manejo das DNs

Figura SEQ Figura \* ARABIC 30 - Flebotomíneo

Quadro SEQ Quadro \* ARABIC 2 - Taxonomia do gênero LeishmaniaFigura
SEQ Figura \* ARABIC 31 - FlebotomíneoFigura SEQ Figura \* ARABIC 32 Intervenções de saúde pública recomendadas para o manejo das DNs

Figura SEQ Figura \* ARABIC 33 - FlebotomíneoFigura SEQ Figura \* ARABIC
34 - Intervenções de saúde pública recomendadas para o manejo das DNs

Figura SEQ Figura \* ARABIC 35 - Flebotomíneo
Fonte: Adaptado de Engels e Zhou, 2020.

Quadro SEQ Quadro \* ARABIC 3 - Taxonomia do gênero LeishmaniaFigura
SEQ Figura \* ARABIC 36 - Flebotomíneo

Quadro SEQ Quadro \* ARABIC 4 - Taxonomia do gênero Leishmania

16
3.2 Leishmaniose

As leishmanioses fazem parte de um conjunto de doenças parasitárias e infecciosas
causadas por protozoários do gênero Leishmania, pertencentes à ordem Kinetoplastida e família
Trypanosomatidae. Mais de 22 espécies de Leishmania são conhecidas no mundo, com
característica heteroxênica, onde realizam parte do ciclo de vida em vertebrados e outra parte
em invertebrados (HAMILTON et al., 2015; OPAS, 2017).
Os parasitos de Leishmania são transmitidos aos seus hospedeiros vertebrados através
da picada de um pequeno vetor de 2 a 3 mm de comprimento, denominado flebotomíneo. Os
flebotomíneos são popularmente conhecidos como mosquito palha, birigui, cangalhinha e
pertencem à classe Insecta, da ordem Diptera, família Psychodidae e subfamília Phlebotominae
(Figura 3).
As leishmanioses são antropozoonoses, logo, infectam seres humanos e também
animais. Aproximadamente 70 animais já foram identificados como reservatórios naturais para
a manutenção dos parasitos, dificultando a erradicação da doença (OPAS, 2019; TOEPP;
PETERSEN, 2020; WHO, 2022).

Figura 3 – Flebotomíneo (hospedeiro invertebrado dos parasitos de Leishmania
spp.)

Quadro SEQ Quadro \* ARABIC 8 - Taxonomia do gênero
LeishmaniaFigura SEQ Figura \* ARABIC 49 - Flebotomíneo

Quadro SEQ Quadro \* ARABIC 9 - Taxonomia do gênero Leishmania

Figura SEQ Figura \* ARABIC 50 - Formas evolutivas: promastigotas (A) e
amastigotas (B)Quadro SEQ Quadro \* ARABIC 10 - Taxonomia do gênero
LeishmaniaFigura SEQ Figura \* ARABIC 51 - Flebotomíneo
Fonte: ECDE, 2022.

Quadro SEQ
Quadro
\* ARABIC
11de- Taxonomia
do gênero
A leishmaniose
pode
se manifestar
a partir
três formas distintas
da doença: a forma
LeishmaniaFigura SEQ Figura \* ARABIC 52 - Flebotomíneo
mais comum, a leishmaniose cutânea (LC), a sua variante conhecida como leishmaniose
mucocutânea (LMC) e a forma mais fatal, a leishmaniose visceral (LC). Apesar de não serem
Quadro SEQ Quadro \* ARABIC 12 - Taxonomia do gênero Leishmania
totalmente elucidados, a cepa e espécies envolvidas na infecção, a resposta imune do hospedeiro
mamífero e as variações genéticas do parasito e hospedeiros, são fatores importantes neste
Figura SEQ Figura \* ARABIC 53 - Formas evolutivas: promastigotas (A) e
amastigotas (B)Quadro SEQ Quadro \* ARABIC 13 - Taxonomia do gênero
Leishmania

17
contexto (KAYE; SCOTT, 2011; WHO, 2022).
O gênero Leishmania se divide em dois subgêneros: Viannia e Leishmania. O subgênero
Leishmania é comumente encontrado em países e territórios do velho e novo mundo e abrange
os complexos Leishmania donovani, Leishmania tropica, Leishmania major, Leishmania
aethiopica, Leishmania mexicana e outros não patogênicos em humanos. As espécies
pertencentes ao subgênero Leishmania se desenvolvem aderidas à parede do intestino posterior
na região do piloro do flebotomíneo. Já as espécies pertencentes ao subgênero Viannia se
desenvolvem no intestino anterior e médio do inseto e abrange os complexos Leishmania
braziliensis, Leishmania lansoni e Leishmania guyanensis, presentes nos países do velho
mundo, conforme mostrado no Quadro 1 (LAISON; SHAW, 1987; AKHOUNDI et al., 2016;
OPAS, 2019).

Quadro 1 - Taxonomia do gênero Leishmania spp.

Figura SEQ Figura \* ARABIC 62 - Formas evolutivas: promastigotas (A) e amastigotas
(B)Quadro SEQ Quadro \* ARABIC 21 - Taxonomia do gênero Leishmania

Figura SEQ Figura \* ARABIC 63 - Formas evolutivas: promastigotas (A) e
amastigotas (B)

Figura 5 - Ciclo de vida da Leishmania spp.Figura SEQ Figura \* ARABIC 64 Formas evolutivas: promastigotas (A) e amastigotas (B)Quadro SEQ Quadro \*
ARABIC
22Adaptado
- Taxonomia
gênero
Fonte:
de OPAS,do
2019
e WHO,Leishmania
2010.
As espécies
de Leishmania
apresentam
pleomorfismo,
sua forma
Figura
SEQ Figura
\* ARABIC
65 - Formas
evolutivas:alterando
promastigotas
(A) eentre
amastigotas
(B)Quadro
SEQ Quadro
\* ARABIC
23 encontrada
- Taxonomia
gênero um
hospedeiro
vertebrado
e invertebrado.
Nos mamíferos
a forma
é a do
amastigota,
Leishmania
parasito intracelular obrigatório, que infecta células fagocitárias, como neutrófilos, macrófagos
e células dendríticas, abrigando-se em vacúolos parasitóforos . Esta forma possui um
Figura SEQ Figura \* ARABIC 66 - Formas evolutivas: promastigotas (A) e
comprimento de 3 a 7 µm de comprimento,
sem flagelo
amastigotas
(B) livre que se mantém na bolsa flagelar,
núcleo grande e cinetoplasto pequeno em forma de bastonete (Figura 4 – B e D) (MORAES et
al., 2018; FERREIRA et al., 2022).
Figura 5 - Ciclo de vida da Leishmania spp.Figura SEQ Figura \* ARABIC 67 No trato intestinal
do flebotomíneo
são encontradas
formas flageladas
Formas evolutivas:
promastigotas
(A) easamastigotas
(B) do parasito, as
promastigotas, que medem cerca de 10 a 20 µm de comprimento, com flagelo emergente a partir
da bolsa flagelar, possibilitando
destes
(Figura
Figura 5 a- motilidade
Ciclo de vida
da parasitos
Leishmania
spp.4 – A e C) (RAI et al.,

Figura 6 - Mecanismos imunológicos na leishmanioseFigura 5 - Ciclo de vida da
Leishmania spp.Figura SEQ Figura \* ARABIC 68 - Formas evolutivas:

18
2017; CARFAGNA et al., 2020; WHO, 2022).

Figura 4 - Formas evolutivas: promastigotas (A e C) e amastigotas (B e D)

A 5 - Ciclo de vida da Leishmania
B spp.Figura SEQ Figura \*
Figura
ARABIC 75 - Formas evolutivas: promastigotas (A) e amastigotas (B)

Figura 5 - Ciclo de vida da Leishmania spp.

Figura 6 - Mecanismos imunológicos na leishmanioseFigura 5 - Ciclo de
vida da Leishmania spp.Figura SEQ Figura \* ARABIC 76 - Formas
C
D e amastigotas (B)
evolutivas: promastigotas (A)

Figura 5 - Ciclo de vida da Leishmania spp.Figura SEQ Figura \*
ARABIC 77 - Formas evolutivas: promastigotas (A) e amastigotas (B)

Figura 5 - Ciclo de vida da Leishmania spp.

Figura 6 - Mecanismos imunológicos na leishmanioseFigura 5 - Ciclo de
vida da Leishmania spp.

Figura 6 - Mecanismos
imunológicos
na leishmaniose
Fonte: Adaptado de
Teixeira et al., 2013
e Granato, 2018;
3.2.1 Ciclo de vida de Leishmania spp.
Figura SEQ Figura \* ARABIC 78 - Leishmaniose cutânea: localizada
(A), mucocutânea (B) e difusa (C)Figura 6 - Mecanismos imunológicos na
leishmanioseFigura 5 - Ciclo de vida da Leishmania spp.
Os protozoários do gênero Leishmania spp. são parasitos intracelulares obrigatório,
vivem no interior de células mieloides, como monócitos, células dendríticas, neutrófilos e nos
Figura 6 - Mecanismos
imunológicos
na leishmanioseFigura
- Ciclocontra
de a invasão
macrófagos,
deflagrando mecanismos
imunológicos
na tentativa de5defesa
vida da Leishmania spp.Figura SEQ Figura \* ARABIC 79 - Formas
desses parasitos.
No insetopromastigotas
vetor são encontradas
as formas extracelular
desses parasitos, as
evolutivas:
(A) e amastigotas
(B)
promastigotas. Os flebotomíneos são hematófagos e, durante o repasto sanguíneo, as fêmeas
infectadas
as promastigotas
metacíclicas
nos hospedeiros
que ganham
a corrente
Figuraregurgitam
5 - Ciclo de
vida da Leishmania
spp.Figura
SEQ Figura
\*
ARABIC
80 -fagocitadas
Formas evolutivas:
(A) e amastigotas
(B)
sanguínea
e são
por célulaspromastigotas
do sistema monocítico
fagocitário, especialmente
por
macrófagos, abrigando-se no interior dessas células em vacúolos parasitóforos. Por fatores
físico-químicos Figura
do ambiente
intracelular,
formas promastigotas
se convertem em
5 - Ciclo
de vida daas
Leishmania
spp.

Figura 6 - Mecanismos imunológicos na leishmanioseFigura 5 - Ciclo de
vida da Leishmania spp.Figura SEQ Figura \* ARABIC 81 - Formas

19
amastigotas, que crescem e se multiplicam até que a membrana celular se rompa, liberando as
formas amastigotas na corrente sanguínea para infectar novas células ou serem ingeridas por
outro insetos vetores, reiniciando o ciclo de vida da Leishmania spp. (JARA et al., 2017).
No intestino médio abdominal do inseto vetor, as amastigotas formam um “ninho de
células” e se diferenciam em promastigotas procíclicas. Ao se ligarem no epitélio abdominal
do vetor, as promastigotas se transformam em formas metacíclicas infecciosas, reiniciando o
ciclo biológico do parasito, conforme mostra a Figura 5 (TEIXEIRA et al., 2013; PIMENTA et
al., 2018).

Figura 5 - Ciclo de vida da Leishmania spp.

Figura 6 - Mecanismos imunológicos na
leishmanioseFigura 5 - Ciclo de vida da
Leishmania spp.

Figura 6 - Mecanismos imunológicos na
leishmaniose

Figura SEQ Figura \* ARABIC 83 Leishmaniose cutânea: localizada (A),
mucocutânea (B) e difusa (C)Figura 6 Mecanismos imunológicos na
leishmanioseFigura 5 - Ciclo de vida da
Leishmania spp.

Figura 6 - Mecanismos imunológicos na
leishmanioseFigura 5 - Ciclo de vida da
Leishmania spp.

Figura 6 - Mecanismos imunológicos na
leishmaniose

Figura SEQ Figura \* ARABIC 84 Leishmaniose cutânea: localizada (A),
mucocutânea (B) e difusa (C)Figura 6 Mecanismos imunológicos na leishmaniose

(A)Fixação de um promastigota à superfície do macrófago. (B) Fagocitose da promastigota. (C) Formação do
vacúolo parasitóforo e conversão da promastigota em amastigota. (D) Recrutamento e a fusão dos lisossomos do

Figura SEQ Figura \* ARABIC 85 Leishmaniose cutânea: localizada (A),
mucocutânea (B) e difusa (C)

20
macrófago e o vacúolo. (E) Divisão binária dos parasitos. (F–G) A multiplicação intensa gera várias centenas de
amastigotas. (H) A célula hospedeira estoura e os parasitas ganham a corrente sanguínea. (I) Vista esquemática de
flebotomíneo fêmea mostrando o trato digestivo. (J) Durante a hematofagia, o flebotomíneo ingere macrófagos
infectados com formas amastigotas. (K) Amastigotas formam “ninhos de células” no intestino médio abdominal.
(L) Conversão de amastigotas em promastigotas procíclicas. (M) Promastigotas se multiplicam e se ligam ao
epitélio do intestino médio. (N) Os parasitas migram para o intestino médio anterior, retomam a replicação e
começam a produzir gel secretor promastigota (PSG). (O) As promastigotas transformam-se em promastigotas
metacíclicas infecciosas. (P) As promastigotas metacíclicas infectam um novo hospedeiro mamífero durante o
repasto sanguíneo.
Fonte: TEIXEIRA et al., 2013.

Estudos sugerem dois modos de transmissão através de flebotomíneos, que irão
determinar a gravidade dos sintomas. Flebotomíneos que se alimentam de mamíferos infectados
com baixa carga parasitária, acabam transmitindo doenças leves ou assintomáticas. Quando os
flebotomíneos se infectam a partir de doentes com alta carga parasitária, acabam desenvolvendo
uma alta frequência de promastigotas metacíclicas. A continuação desse ciclo de vida, acaba
gerando hospedeiros vertebrados com doenças e sintomas mais graves (COURTENAY et al.,
2017).

3.2.2 Imunopatogênese da leishmaniose

Os primeiros instantes da infecção são cruciais para determinar a sobrevivência dos
parasitos, estando intimamente relacionada ao controle imunológico desempenhado pelos
hospedeiros, via mecanismos inatos e adquiridos. Como garantia de sobrevivência, os parasitos
se beneficiam da própria saliva do inseto vetor, que possui propriedade anticoagulante,
antiagregante plaquetária, vasodilatadora, imunomoduladora, suprimindo parte da resposta
imune do hospedeiro (ROGERS et al., 2010; ROSSI; FASEL, 2017). A substância gelatinosa
(PSG) também regurgitada pelo flebotomíneo exacerba a infecção e promove o recrutamento
de células fagocitárias e o estímulo da atividade da arginase, promovendo o catabolismo da Larginina e a síntese de poliaminas, cruciais para a replicação dos parasitos

(TOEPP;

PETERSEN, 2020).
Além disso, os neutrófilos desempenham um papel fundamental no início da infecção,
pois fazem parte da primeira resposta imunológica. Estas células chegam primeiro no local da
infecção, fagocitam os parasitos e recrutam macrófagos para também destruírem os invasores,
por um mecanismo imunológico inato (ALMEIDA et al., 2013; TOEPP; PETERSEN, 2020).

21
Alguns receptores estabelecem a internalização dos parasitos nos macrófagos, como o
receptor do tipo 3 do complemento (CR3), receptor do tipo 1 do complemento (CR1), receptor
de manose (MR), receptor de fibronectina (FnR), receptor para porção Fc de IgG (FcR) e outros
(BLACKWELL et al., 1985; WILSON; PEARSON 1988; UENO; WILSON, 2012). Dentro
dos macrófagos, as promastigotas se diferenciam em amastigotas e abrigam-se em vacúolos
parasitóforos. Os macrófagos são ativados e liberam espécies reativas de oxigênio (EROs) na
tentativa de suprimir a replicação parasitária e o avançar da doença (SCORZA; CARVALHO;
WILSON, 2017).
O controle imune é determinado pelo tipo de resposta que o hospedeiro irá desenvolver
frente a infecção por parasitos de Leishmania spp., que requer um equilíbrio entre respostas
inflamatórias e reguladoras, conforme esquema mostrado na Figura 6. Este equilíbrio é mediado
especificamente por células T CD4+. O perfil de resistência ou sensibilidade à infecção é
determinado pela polarização de linfócitos T CD4+ em células Th1, Th2, Th17 ou Treg
(SCOTT; NOVAIS, 2016; JAWED; DUTTA; MAJUMDAR, 2019).
A resposta mediada por células Th1 envolve um padrão de citocinas específicas pró
inflamatórias, como a IL-2, IL-12, TNF-α e IFN-γ, que estão relacionadas a um perfil de
resistência à infecção por Leishmania. Essa resposta ativa os macrófagos e estimulam a
produção de EROs, em especial o óxido nítrico (NO), gerando uma resposta protetora (ROSSI;
FASEL, 2017; TOMIOTTO-PELLISSIER et al., 2018; KUMAR et al. , 2020). As células do
tipo Th17 também modulam uma resposta imune inflamatória a partir da liberação de
interleucina-17 (IL-17), que recruta neutrófilos e macrófagos para o local da infecção
(TRAJANO-SILVA et al., 2017).
A resposta mediada por células Th2 determina um perfil de suscetibilidade à
Leishmania, com a expressão de fatores anti inflamatórios, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13 e
TGF-β. Esse perfil imunológico aumenta a expressão de arginases que competem com a cascata
das EROs, levando ao sucesso da infecção e agravamento do quadro infeccioso (ROSSI;
FASEL, 2017; MUXEL et al., 2018; SANZ et al., 2021).

22

Figura 6 - Mecanismos imunológicos na leishmaniose

Figura SEQ Figura \* ARABIC 90 - Leishmaniose cutânea: localizada (A),
mucocutânea (B) e difusa (C)Figura 6 - Mecanismos imunológicos na leishmaniose

Figura SEQ Figura \* ARABIC 91 - Leishmaniose cutânea: localizada (A),
mucocutânea (B) e difusa (C)

Figura SEQ Figura \* ARABIC 92 - Leishmaniose visceralFigura SEQ Figura \*
ARABIC 93 - Leishmaniose cutânea: localizada (A), mucocutânea (B) e difusa
(C)Figura 6 - Mecanismos imunológicos na leishmaniose

Figura SEQ Figura \* ARABIC 94 - Leishmaniose cutânea: localizada (A),
mucocutânea (B) e difusa (C)Figura 6 - Mecanismos imunológicos na leishmaniose

Figura SEQ Figura \* ARABIC 95 - Leishmaniose cutânea: localizada (A),
mucocutânea (B) e difusa (C)
Fonte: DOS SANTOS MEIRA; GEDAMU, 2019.

Figura SEQ Figura \* ARABIC 96 - Leishmaniose visceralFigura SEQ Figura \*
ARABIC 97 - Leishmaniose cutânea: localizada (A), mucocutânea (B) e difusa (C)
3.2.3 Classificação e manifestações clínicas
Figura SEQ Figura \* ARABIC 98 - Leishmaniose visceral
Grande parte dos indivíduos infectados por parasitos de Leishmania spp. não
Figura
9 – sintomatologia
Situação de endemicidade
da leishmaniose
visceral
no mundo,
apresentam
alguma. O termo
leishmaniose está
relacionado
ao processo de
2020Figura SEQ Figura \* ARABIC 99 - Leishmaniose visceralFigura SEQ Figura
adoecimento,
incluindo
o aparecimento
de sinais
e sintomas
característicos(B)
daedoença.
As
\* ARABIC 100
- Leishmaniose
cutânea:
localizada
(A), mucocutânea
difusa (C)
leishmanioses se apresentam de diversas formas, podendo apresentar infecções leves, formas
graves
até mesmo
desfigurantes.
forma
de apresentação
dos sintomas SEQ
depende
muito\*da
Figurae SEQ
Figura
\* ARABIC A
101
- Leishmaniose
visceralFigura
Figura
ARABIC
102 - Leishmaniose
localizada
mucocutânea
(B) e difusa
espécie causadora
da infecção e dacutânea:
susceptibilidade
dos (A),
indivíduos
(HASHIGUCHI
et al., 2016;
(C)Figura 6 - Mecanismos imunológicos na leishmaniose
WHO, 2022).
A forma mais comum da doença é a leishmaniose cutânea (LC) e suas variações,
Figura
SEQ cutânea
Figura \*
ARABIC(LCL)
103 - Leishmaniose
cutânea: localizada
(A), (LMC)
leishmaniose
localizada
(Figura 7-A), leishmaniose
mucocutânea
mucocutânea (B) e difusa (C)Figura 6 - Mecanismos imunológicos na leishmaniose
(Figura 7-B) e leishmaniose cutânea difusa ou disseminada (LCD) (Figura 7-C) (DO
NASCIMENTO; 2019; ARAMAYO et al., 2021). Os indivíduos acometidos por esta doença
Figura SEQ Figura \* ARABIC 104 - Leishmaniose cutânea: localizada (A),
apresentam
lesões
nodifusa
tecido(C)
cutâneo ou nas mucosas, podendo apresentar lesão única ou
mucocutânea
(B) e

Figura SEQ Figura \* ARABIC 105 - Leishmaniose visceralFigura SEQ Figura \*
ARABIC 106 - Leishmaniose cutânea: localizada (A), mucocutânea (B) e difusa

23
múltiplas, às vezes até 200 lesões, que aparecem no local da picada do inseto vetor. Estas lesões
são bem arredondadas, com aspecto ulceroso, indolor, com bordas elevadas e delimitadas e
fundo granuloso. Nas lesões pode ser observado um infiltrado inflamatório, contendo células
linfocitárias e macrófagos, além da presença dos parasitos. O acometimento da mucosa, a super
disseminação das lesões e as cicatrizes permanentes acabam gerando estigmatização e exclusão
social dos indivíduos acometidos (REBOUÇAS et al., 2021; WHO, 2022).

Figura 7 - Leishmaniose cutânea: localizada (A), mucocutânea (B) e difusa (C)

Figura SEQ Figura \* ARABIC 109 - Leishmaniose visceralFigura SEQ
Figura \* ARABIC 110 - Leishmaniose cutânea: localizada (A),
mucocutânea (B) e difusa (C)

7

Figura SEQ Figura \* ARABIC 111 - Leishmaniose visceral
Fonte: BRASIL, 2017.

Figura 9 – Situação de endemicidade da leishmaniose visceral no mundo,
2020Figura SEQ Figura \* ARABIC 112 - Leishmaniose visceralFigura
A Figura
leishmaniose
visceral
(LV)
(Figura 8) é cutânea:
o espectrolocalizada
mais grave
SEQ
\* ARABIC
113
- Leishmaniose
(A),da doença e se
mucocutânea
(B) eem
difusa
(C)como fígado, baço e medula óssea,
caracteriza pela disseminação
dos parasitos
órgãos
causando um grave quadro de anorexia, febre duradoura, astenia, hepatoesplenomegalia e
Figura SEQ
Figura como
\* ARABIC
114 e- Leishmaniose
visceralFigura
SEQ ainda mais
discrasias
sanguíneas,
a anemia
neutropenia, tornando
os indivíduos
Figura \* ARABIC 115 - Leishmaniose cutânea: localizada (A),
suscetíveis a outras infecções,
especialmente
de origem
mucocutânea
(B) easdifusa
(C) bacteriana (WHO, 2022).
Se não tratada, a LV pode causar 100% de óbitos em até 2 anos. Também há uma
variação da LV, denominada leishmaniose dérmica pós-calazar (LDPC). É uma complicação
Figura SEQ Figura \* ARABIC 116 - Leishmaniose visceral
tardia da LV, caracterizada por erupção cutânea hipopigmentada em pacientes que se
recuperaram da LV. Sistemicamente, os pacientes com LDPC não são afetados, podendo
Figura 9 – Situação de endemicidade da leishmaniose visceral no mundo,
permanecer
por muito
tempo
sem tratamento,
constituem importantes
2020Figura
SEQ
Figura
\* ARABICentretanto,
117 - Leishmaniose
visceral reservatórios,
mantendo a transmissão dos parasitos nos ciclos epidêmicos (COSTA-MADEIRA et al., 2022;
WHO, 2022).
Figura 9 – Situação de endemicidade da leishmaniose visceral no mundo,
2020

Figura 10 - Situação de endemicidade da leishmaniose cutânea no
mundo, 2020Figura 9 – Situação de endemicidade da leishmaniose
visceral no mundo, 2020Figura SEQ Figura \* ARABIC 118 Leishmaniose visceral

Figura 9 – Situação de endemicidade da leishmaniose visceral no mundo,
2020Figura SEQ Figura \* ARABIC 119 - Leishmaniose visceralFigura

24
Figura 8 - Leishmaniose visceral

Figura 9 – Situação de endemicidade da leishmaniose visceral
no mundo, 2020Figura SEQ Figura \* ARABIC 129 Leishmaniose visceral

Figura 9 – Situação de endemicidade da leishmaniose visceral
no mundo, 2020
Fonte: BRASIL, 2017.

Figura 10 - Situação de endemicidade da leishmaniose cutânea
no mundo, 2020Figura 9 – Situação de endemicidade da
3.2.4 Situação epidemiológica
leishmaniose visceral no mundo, 2020Figura SEQ Figura \*
ARABIC 130 - Leishmaniose visceral
Segundo a OMS (2022), mais de 1 bilhão de pessoas vivem em áreas endêmicas para
Figura 9 – Situação
endemicidade
leishmaniose
leishmaniose,
com altode
risco
de infecção.da
Grande
parte do visceral
globo, cerca de 102 países e
no mundo, 2020Figura SEQ Figura \* ARABIC 131 territórios são afetados ou
endêmicos e segundo
Leishmaniose
visceral a análise global, anualmente ocorrem cerca de
20 a 30 mil mortes por leishmaniose, fora os números de incapacitação que a doença pode
causar. Em 2020, mais de 5 mil casos de LV foram reportados no Brasil, Sudão, Etiópia,
Figura 9 – Situação de endemicidade da leishmaniose visceral
Eritreia, Quênia e Índia, conforme
mostra
a Figura 9.
no mundo,
2020

Figura
– Situação
de de
endemicidade
da leishmaniose
visceral
no mundo, 2020
Figura910
- Situação
endemicidade
da leishmaniose
cutânea
no mundo, 2020Figura 9 – Situação de endemicidade da
leishmaniose visceral no mundo, 2020
Figura 10 - Situação de endemicidade da leishmaniose cutânea no mundo,
2020Figura 9 – Situação de endemicidade da leishmaniose visceral no
mundo,da
2020
Figura 10 - Situação de endemicidade
leishmaniose cutânea
no mundo, 2020
Figura 10 - Situação de endemicidade da leishmaniose cutânea no mundo,
2020
Figura SEQ Figura \* ARABIC
132 - Esfregaço por
escarificaçãoFigura 10 - Situação de endemicidade da
leishmaniose cutânea no mundo, 2020Figura 9 – Situação de
endemicidade
da\*leishmaniose
no mundo,
2020
Figura
SEQ Figura
ARABIC 137visceral
- Esfregaço
por escarificaçãoFigura
10 Situação de endemicidade da leishmaniose cutânea no mundo, 2020Figura 9
– Situação de endemicidade da leishmaniose visceral no mundo, 2020
Figura 10 - Situação de endemicidade da leishmaniose cutânea
no mundo, 2020Figura 9 – Situação de endemicidade da
leishmaniose
visceralde
noendemicidade
mundo, 2020Figura
SEQ Figura
\* no mundo,
Figura
10 - Situação
da leishmaniose
cutânea
ARABIC
133
Leishmaniose
visceral
2020Figura 9 – Situação de endemicidade da leishmaniose visceral no
mundo, 2020
Figura 9 – Situação de endemicidade da leishmaniose visceral
no mundo,
2020Figura
SEQ Figura
ARABIC 134cutânea
Figura
10 - Situação
de endemicidade
da\*leishmaniose
no mundo,
Leishmaniose visceral
2020

25
Fonte:WHO, 2022.

Cerca de 30 mil novos casos de LV são reportados anualmente no mundo. Os casos de
LV no Brasil representam 96% do total de casos de LV nas Américas. Além da LV humana, a
LV canina também é endêmica no Brasil, com uma taxa de infecção canina nas regiões
endêmicas de até 20%. Sem o diagnóstico precoce e tratamento adequado, a LV pode ser fatal
em até 95% dos casos (OPAS, 2022).
Apesar da baixa letalidade em relação a LV, a LC é o espectro clínico mais comum da
leishmaniose. Estima-se que 95% dos casos de LC estejam concentrados nas Américas, no
Oriente Médio, Ásia Central e na bacia do Mediterrâneo. Em 2020, o Brasil, Colômbia, Argélia,
Afeganistão, Paquistão, Iraque e Síria foram os países que mais notificaram casos de LC no
mundo (Figura 10). Só no Brasil mais de 15 mil novos casos foram confirmados. Estes casos
estão geograficamente distribuídos nas regiões brasileiras, em especial nas regiões norte e
nordeste do país. Destes casos, 5,3% foram notificados como sendo a forma mucocutânea da
doença. Em ambos os espectros clínicos, os mais afetados são adultos jovens do sexo masculino
(OPAS, 2019; WHO, 2022).

Figura 10 - Situação de endemicidade da leishmaniose cutânea no mundo, 2020

Figura SEQ Figura \* ARABIC 144 - Esfregaço por escarificaçãoFigura 10 Situação de endemicidade da leishmaniose cutânea no mundo, 2020

Figura SEQ Figura \* ARABIC 145 - Esfregaço por escarificação

Figura SEQ Figura \* ARABIC 146 - Abordagens diagnósticas para
leishmanioseFigura SEQ Figura \* ARABIC 147 - Esfregaço por
escarificaçãoFigura 10 - Situação de endemicidade da leishmaniose cutânea
no mundo, 2020

Figura SEQ Figura \* ARABIC 148 - Esfregaço por escarificaçãoFigura 10 Situação de endemicidade da leishmaniose cutânea no mundo, 2020

Figura SEQ Figura \* ARABIC 149 - Esfregaço por escarificação
Fonte: WHO, 2022.

Figura SEQ Figura \* ARABIC 150 - Abordagens diagnósticas para
leishmanioseFigura SEQ Figura \* ARABIC 151 - Esfregaço por escarificação

26
3.3 Diagnóstico da leishmaniose

O diagnóstico precoce e preciso é de extrema importância para a completa recuperação
do paciente. Para o diagnóstico de LC e suas variações, a pesquisa sorológica é bastante
limitada, pois não são testes considerados padrão ouro devido à baixa precisão (GOMES et al.,
2014). Sendo assim, a LC conta apenas com o diagnóstico parasitológico, por meio da
microscopia direta, histopatologia ou cultivo do parasito; o diagnóstico molecular, que permite
a caracterização taxonômica da Leishmania (PCR convencional e não convencional); e o
presuntivo, feito a partir de dados clínicos do paciente, epidemiológicos e exames laboratoriais.
Além disso, o diagnóstico diferencial é crucial, pois as manifestações clínicas da LC podem
ser semelhantes a outras doenças cutâneas, como hanseníase, queloide, câncer de pele,
tuberculose e micoses de pele (GOMES et al., 2014; PRADA et al., 2021; WHO, 2022).
Na presença de uma suspeita diagnóstica de LC, a história epidemiológica do paciente
é de grande importância, pois permite avaliar o potencial risco de infecção por Leishmania.
Para a demonstração direta dos parasitos em paciente com LC, amostras das lesões são retiradas
com o auxílio de uma lâmina por escarificação (Figura 11), aposição ou esfregaço da linfa e
coradas para a visualização no microscópio. Em pacientes com LCL, a sensibilidade de exames
parasitológicos direto pode variar entre 60 a 95% em culturas e esfregaço, já em pacientes com
LCD, a sensibilidade pode chegar a 100% (MAGALHÃES; MOURA, 2015; BRASIL, 2017;
OPAS, 2019).
Figura 11 - Esfregaço por escarificação para demonstração direta do parasito

Figura SEQ Figura \* ARABIC 164 - Abordagens diagnósticas para
leishmanioseFigura SEQ Figura \* ARABIC 165 - Esfregaço por escarificação

Figura SEQ Figura \* ARABIC 166 - Abordagens diagnósticas para
leishmaniose

Figura SEQ Figura \* ARABIC 167 - Naftoquinonas clássicas: lapachol e βlapacholFigura SEQ Figura \* ARABIC 168 - Abordagens diagnósticas para
leishmanioseFigura SEQ Figura \* ARABIC 169 - Esfregaço por escarificação

Figura SEQ Figura \* ARABIC
170 - Abordagens diagnósticas para
Fonte: OPAS, 2019.
leishmanioseFigura SEQ Figura \* ARABIC 171 - Esfregaço por escarificação

Figura SEQ Figura \* ARABIC 172 - Abordagens diagnósticas para
leishmaniose

27

Os exames parasitológicos de demonstração direta do parasito ou isolamento em cultura
são considerados padrão ouro no diagnóstico de LV. A visualização do parasito geralmente é
feita através de material de biópsia ou punção aspirativa da medula óssea posto em lâmina para
visualização de amastigotas no microscópio, após coloração. No entanto, para evitar técnicas
invasivas, testes sorológicos e imunológicos apresentam-se como alternativas, uma vez que na
LV há grande produção de anticorpos. Os principais testes utilizados, são: ELISA, aglutinação
direta, reação de imunofluorescência indireta (RIFI), reação de fixação do complemento (RFC)
e teste rápido imunocromatográfico (BRASIL, 2014; OPAS, 2019).
Embora seja considerado menos invasivo para obter amostras do que métodos
parasitológicos, esses ensaios apresentam sensibilidade e/ou especificidade variável,
dependendo do antígeno usado, o estado clínico dos pacientes, a coexistência de reações
cruzadas com outras doenças, entre outras variáveis (COSTA et al., 2016; LIMA; COSTA;
DUARTE, 2017).
Os testes imunocromatográficos rápidos são amplamente utilizados no Brasil, porém
têm as mesmas limitações que outros testes sorológicos, devendo ser interpretados de acordo
com um contexto clínico, além de apresentar alta variação com relação à sensibilidade,
apresentando performance moderada na América Lática e fraca no continente Africano
(MUKHTAR et al., 2015; SOUZA-FILHO; BARBOSA; FIGUEIREDO et al. 2016). Além
disso, o diagnóstico da leishmaniose canina também apresenta as mesmas limitações do
diagnóstico humano, sendo o cão um importante reservatório da leishmaniose visceral
(MAURELLI; BOSCO; MANZILLO et al., 2020).

3.3.1 Pesquisa e desenvolvimento de novos métodos de diagnóstico

Apesar do contexto epidemiológico que as leishmanioses estão inseridas, a falta de
diagnóstico de fácil execução, baixo custo, menos invasivos, e alta especificidade e
sensibilidade, constituem fatores importantes no aumento da mortalidade e incapacidade nos
indivíduos acometidos pela doença. Assim como o tratamento, o diagnóstico é um grande
desafio mundial para erradicação da doença, uma vez que o diagnóstico inicial simples, robusto
e preciso é decisivo na escolha do tratamento mais adequado (WENG; CHEN; WAND, 2018;
REIMÃO et al., 2020).
Embora o diagnóstico da leishmaniose possa contar com metodologias parasitológicas,

28
imunológicas e moleculares (Figura 12), nenhuma delas provou ser o modelo ideal e preciso
para o diagnóstico, devido ao vasto espectro que a doença possui e a variedade de espécies
causadoras da infecção, a semelhança com outras doenças e o aumento de casos de co-infecção.
Com isto, novas abordagens diagnósticas estão sendo desenvolvidas para melhorar a qualidade
do diagnóstico das leishmaniose (REIMÃO et al., 2020; DE BRITO et al., 2020; KUMARI et
al., 2021).
Realizar uma pesquisa estratégica acerca das tecnologias emergentes no campo do
diagnóstico da leishmaniose é o primeiro passo para a identificação das potencialidades desse
processo de inovação. A prospecção de patentes relacionadas ao desenvolvimento de novos
métodos diagnósticos para leishmaniose pode predizer e identificar as oportunidades
tecnológicas futuras, antecipando e entendendo o percurso dessas novas tecnologias, uma que
vez que, através disso é possível identificar as demandas sociais e econômicas que envolvem a
justificativa dessa nova tecnologia e as necessidades mais relevantes para pesquisas futuras,
além de subsidiar e orientar o processo de tomada de decisão para o delineamento de novos
diagnósticos que estejam sendo propostos (TEIXEIRA, 2013).
A citometria de fluxo constitui uma recente abordagem diagnóstica/sorológica para as
leishmanioses, através da avaliação da expressão de proteínas específicas, viabilidade celular,
apoptose e outras análises que podem ser empregadas. A detecção de IgG por citometria de
fluxo demonstrou 100% de sensibilidade, mas com baixa especificidade quando comparado ao
teste sorológico convencional, o ELISA (PEDRAL-SAMPAIO et al., 2016). Uma outra técnica
promissora no campo do diagnóstico para leishmaniose é o uso da nanotecnologia. Martins et
al. (2020) imobilizaram antígenos de L. infantum em uma superfície com nanopartículas de
ouro, o que permitiu o reconhecimento de um epítopo específico no soro de pacientes com
leishmaniose.
Os métodos moleculares também passaram por avanços a partir do aprimoramento de
técnicas já existentes e de novas técnicas moleculares. Como a amplificação isotérmica mediada
por loop (LAMP), cujo método é baseado em condições isotérmicas, no qual fragmentos
amplificados são visualizados a partir da mudança de coloração, turbidez e fluorescência,
demonstrando uma sensibilidade de 92,3% e especificidade de 100%. No entanto, possui
limitações na formação de estruturas secundárias de DNA e a necessidade de temperatura
adequada (BEZERRA et al., 2020; SRIWORARAT et al., 2015; AKHOUNDI et al., 2017).
Outras técnicas moleculares foram descobertas, como a eletroforese enzimática multilocus e a
tipagem de sequência multilocus, embora apresentem alta sensibilidade e especificidade, são
técnicas caras e inviáveis no contexto de negligência que a leishmaniose está inserida

29
(CECCARELLI et al., 2018; LAUTHIER et al., 2020).

Figura 12 - Abordagens diagnósticas para leishmaniose

Figura SEQ Figura \* ARABIC 189 - Naftoquinonas clássicas: lapachol e βlapacholFigura SEQ Figura \* ARABIC 190 - Abordagens diagnósticas para
leishmaniose

Figura SEQ Figura \* ARABIC 191 - Naftoquinonas clássicas: lapachol e βlapacholFigura SEQ Figura \* ARABIC 192 - Abordagens diagnósticas para
leishmaniose

Figura SEQ Figura \* ARABIC 193 - Naftoquinonas clássicas: lapachol e βlapacholFigura SEQ Figura \* ARABIC 194 - Abordagens diagnósticas para
leishmaniose

Figura SEQ Figura \* ARABIC 195 - Naftoquinonas clássicas: lapachol e βlapacholFigura SEQ Figura \* ARABIC 196 - Abordagens diagnósticas para
leishmaniose

Figura SEQ Figura \* ARABIC 197 - Naftoquinonas clássicas: lapachol e βlapacholFigura SEQ Figura \* ARABIC 198 - Abordagens diagnósticas para
Fonte: Adaptado de Kumari et al., 2020.
leishmaniose

Figura
SEQ Figura
\* ARABIC
199 - Naftoquinonas
clássicas: lapachol
β3.3.2 Potencial
da tecnologia
acustofluídica
para o desenvolvimento
de novose métodos
de
lapacholFigura SEQ Figura \* ARABIC 200 - Abordagens diagnósticas para
diagnóstico
leishmaniose

microfluídica
é uma
área recente
vem ganhando
espaço nolapachol
campo biotecnológico,
FiguraASEQ
Figura \*
ARABIC
201 - que
Naftoquinonas
clássicas:
e βlapacholFigura
SEQ
Figura \*biologia,
ARABICfísica,
202 -dinâmica
Abordagens
diagnósticas
para
reunindo princípios
da química,
dos fluidos
e outros.
A partir da
leishmaniose
microfluídica, dispositivos miniaturizados podem ser feitos, contendo canais na faixa de
microescala, podendo ser empregados na separação e isolamento de bio partículas,
desenvolvimento de nanopartículas, entrega e direcionamento de fármacos, diagnóstico e
cultura de células (NICULESCU et al., 2021).
A acustofluídica é a fusão da acústica e da microfluídica. As ondas acústicas são de
origem mecânica, logo, têm pouco prejuízo nas células ou biomoléculas, quando utilizadas na

30
frequência e na potência adequada Normalmente, a manipulação de amostras em dispositivos
acustofluídicos tem caráter não destrutivo e possui biocompatibilidade ideal para a manipulação
de amostras biológicas (DING et al., 2013; BARANI et al., 2016; CHEN et al., 2016; LI;
HUANG, 2018).
Para o diagnóstico de doenças, os dispositivos microfluídicos permitem a utilização de
diversas amostras biológicas, como: sangue, urina, saliva, soro, plasma, ou tecidos celulares.
Através desses sistemas, objetos minúsculos podem ser endereçados, com o máximo grau de
controle possível, desde células humanas, até microrganismos patogênicos, como bactérias e
até mesmo vírus (NICULESCU et al., 2013; JADHAV et al., 2021).
Uma das vantagens da utilização de dispositivos microfluídicos para o diagnóstico é a
necessidade de volumes pequenos, de maneira muito precisa, automatizada e controlada
(SCHELER; POSTEK; GARSTECKI, 2019). Uma outra vantagem, é que a capacidade desses
sistemas de atingir células únicas em amostras contendo milhares delas, evita a “perda” da
célula durante as investigações biológicas, como ocorre em outros testes, como no ELISA,
western blots e PCR (HEYRIES et al., 2011). Na figura 13, é apresentado uma (a) representação
esquemática do dispositivo de acustofluidica, (b) bio-partículas dentro da microcavidade e (c)
bio-partículas concentradas na região central da microcavidade por efeitos da força de radiação
do ultrassom.
Figura 13 - Funcionamento do dispositivo de acustofluídica. (a) Esquemático do
dispositivo de acustofluídica. (b) Bio-partículas dentro da microcavidade. (c)
Biopartículas concentradadas com o dispositivo ligado.

Figura SEQ Figura \* ARABIC 189 - Naftoquinonas clássicas: lapachol e βlapacholFigura SEQ Figura \* ARABIC 190 - Abordagens diagnósticas para
leishmaniose

Figura SEQ Figura \* ARABIC 191 - Naftoquinonas clássicas: lapachol e βlapacholFigura SEQ Figura \* ARABIC 192 - Abordagens diagnósticas para
leishmaniose

Figura SEQ Figura \* ARABIC 193 - Naftoquinonas clássicas: lapachol e βlapacholFigura SEQ Figura \* ARABIC 194 - Abordagens diagnósticas para
leishmaniose
Fonte: SANTOS et al., 2021.

Figura SEQ Figura \* ARABIC 195 - Naftoquinonas clássicas: lapachol e βlapacholFigura SEQ Figura \* ARABIC 196 - Abordagens diagnósticas para
leishmaniose

31
Há pouquíssimos estudos sobre leishmaniose descritos na literatura utilizando
dispositivos acustofluídicos. Jiménez et al. (2022) estudaram o movimento parasitário de
promastigotas e amastigotas de Leishmania durante a exposição a ondas estacionárias
ultrassônicas, utilizando para tanto, um dispositivo acustofluídico. Os autores observaram que
as duas formas evolutivas de Leishmania foram aprisionadas no nó de pressão localizado no
centro do canal, apresentando formas e condições de objetivdade distintas entre as duas formas
evolutivas.

3.3 Tratamento farmacológico da leishmaniose

O tratamento imediato reduz significativamente a prevalência das leishmanioses,
prevenindo o risco de incapacidades e morte. Além disso, ajuda a reduzir a transmissão da
doença pela diminuição de reservatórios existentes (WHO, 2022). Atualmente existem
medicamentos leishmanicida, embora possam ser difíceis de usar, pois a eficácia das drogas
acaba variando a depender do sistema imunológico do hospedeiro e também da localização
geográfica de onde a infecção foi adquirida, uma vez que muitas regiões possuem cepas de
Leishmania spp. resistentes aos fármacos atuais. O acesso a medicamentos também constitui
um problema de limitação da farmacoterapia da leishmaniose, entretanto, melhorou
significativamente graças a um esquema de preços negociado pela OMS e a um programa de
doação de medicamentos por meio da OMS (VAN-GRIENSVEN; DIRO, 2019; WHO, 2022).
Há décadas o tratamento das leishmanioses baseia-se no uso de antimoniais
pentavalentes, antimoniato de meglumina, anfotericina B e pentamidina, entretanto, estas
drogas são tóxicas e podem causar efeitos adversos graves. Estes fármacos são comercializados
até hoje e possuem estruturas químicas distintas atuando por diferentes mecanismos de ação,
conforme mostra o Quadro 2 (BRUNTON; HILALDANDAN; KNOLLMANN, 2018).

32
Quadro 2 - Fármacos leishmanicidas, mecanismo de ação, regime terapêutico, eficácia
clínica, toxicidade e custo

Fármaco e
mecanismo de
ação
Antimoninais
pentavalentes –
mecanismo
praticamente
desconhecido;
inibição de
várias
vias
metabólicas
prejudicado
DNA, RNA e a
sintese
de
proteínas.
Desoxicolato de
Anfotericina B
– Inibição da
membrana
plasmática

Anfotericina B
Lipossomal Inibição
da
membrana
plasmática;
Melhor
distribuição nos
tecidos,
meia-vida maior
e
menor
toxicidade
Miltefosina
Inibe vias de
sinalização

Regime
terapêutico

Eficácia
clínica

Toxicidade

Custo

Frequente,
potencialmente
grave; toxicidade
cardíaca,
pancreatite, nefro
e hepatotoxicidade

Genérico:
$64,5

0,75–1 mg/kg > 97% todas
iv por 15–20 as regiões
doses
(diariamente
ou
dias
alternados)

Genérico:
$21

10–30 mg/kg
de dose total
iv; geralmente
3-5
mg/kg/dose.
Dose única (10
mg/kg)
na
Índia

Frequentes
reações
relacionadas
à
infusão,
nefrotoxicidade,
hipocalemia
(necessita
de
internação
hospitalar)
Europa
e Incomum e leve;
Ásia:
Nefrotoxicidade.
> 95%; mais
baixo
na
África
Oriental
e Brasil
(dose maior
requerida)

Preço
preferencial:
$378
(21
mg/kg
dose total)

Ásia: > 90%,
mas taxa de
recaída
aumentando.

Preço
preferencial:
$ 80,49

20 mg/kg iv ou 35%–95%
im diariamente (dependendo
por 28-30 dias da
área
geográfica)

2–2,5 mg/kg/d
por via oral
diariamente
durante 28 dias

Comum,
geralmente
leve e
transitório;

Marca:
$85,6

Comercial:
10x

33
intracelular
membrana

e (somente
Índia)

África: 93% gastrointestinal
em pacientes (20%–55%),
não HIV.
Nefro e
Hepatotoxicidade
Possivelmente
teratogênico
Sulfato
de 15 mg/kg IM
Ásia: 95% Incomum
paramomicina - diariamente
(Índia)
Nefrotoxicidade
medicamento
por 21 dias
África:
15 Ototoxicidade
aminoglicosídeo, (somente
mg/kg:
Hepatotoxicidade
Inibidor
da Índia)
64% (Sudão Injeções dolorosas
síntese proteica.
<50%)
20
mg/kg:
80%
(Sudão)
Fonte: Adaptado de Van-Griensven e Diro, 2019.

~ $23.

O tratamento da leishmaniose foi inicialmente proposto por Gaspar de Oliveira Vianna,
em 1912, médico brasileiro que utilizou o antimonial trivalente tártaro emético para tratar LC,
constituindo por muitos anos o único fármaco para o tratamento da doença (VIANNA; 1912).
No entanto, devido a toxicidade atribuída ao tártaro emético, Brahmachari em 1925,
desenvolveu o antimonial pentavalente que até então tem sido utilizado como primeira escolha
no tratamento da leishmaniose, devido a melhor eficácia e segurança em relação ao tártaro
emético (BRAHMACHARI, 1928).
Os antimoniais pentavalentes, estibogluconato de sódio (Pentostan®) e antimoniato de
meglumina (Glucantime®), são os principais fármacos utilizados no mundo para o tratamento
das leishmanioses, sendo somente este último comercializado no Brasil e distribuído
gratuitamente pela rede pública de saúde, sendo úteis em todas as formas clínicas da doença,
embora as formas mucosas possam apresentar uma resposta mais lenta e uma maior
probabilidade de recidiva (FERREIRA, 2017; BRASIL; 2017). O antimonial pentavalente é um
pró-fármaco, sendo reduzido a sua forma trivalente capaz de inibir a glicólise e a oxidação dos
ácidos graxos, reduzindo a síntese de ATP e GTP, interferindo, portanto, na bioenergética do
parasito intracelular (CROFT; SUNDAR; FAIRLAMB, 2006; FRÉZARD; DEMICHELI;
RIBEIRO, 2009).
Os efeitos adversos dos antimoniais podem incluir artralgia, mialgia, anorexia, náuseas,
vômitos, plenitude gástrica, epigastralgia, pirose, dor abdominal, pancreatite, prurido, febre,
fraqueza, cefaléia, tontura, palpitação, insônia, nervosismo, choque pirogênico, edema e

34
insuficiência renal aguda (BRASIL, 2017).
Um outro fármaco de escolha para o tratamento das leishmaniose é a anfotericina B,
convencional ou lipossomal, da classe dos antibióticos poliênicos. A forma lipossomal da
anfotericina B foi desenvolvida com o intuito de reduzir a toxicidade do fármaco original e
aumentar a eficácia do mesmo, porém, o alto custo desse fármaco dificulta a possibilidade de
sua aplicação em países pobres na rotina médica. A anfotericina B atua em um componente
essencial da membrana do parasito, o ergosterol, gerando um desequilíbrio osmótico, pela
abertura de poros na sua membrana. Os efeitos adversos da anfotericina B incluem febre,
calafrios, hipocalemia, miocardite e nefrotoxicidade (STONE et al., 2016; BRASIL, 2017;
RODRIGO et al., 2018).
A miltefosina é um éster de fosforilcolina de hexadecanol, sendo o único medicamento
oral disponível no mercado farmacêutico para o tratamento das leishmanioses. Originalmente,
a miltefosina foi idealizada para o tratamento do câncer, mas acabou sendo reposicionada como
antiparasitário, com taxas de cura superiores a 94%. O mecanismo leishmanicida da miltefosina
está na interferência na biossíntese de fosfolipídios e indução da despolarização mitocondrial
dos parasitos. Entretanto, a indução à resistência é um problema que acompanha o uso
ampliado da miltefosina, em função do longo tempo de meia vida droga, além do efeito
teratogênico associado, o que acaba limitando seu uso (PONTE-SUCRE et al., 2017; SUNDAR
et al., 2012; DORLO et al., 2014).
Estudos sugerem que a utilização de monoterapia e o mesmo regime de dose podem
influenciar no insucesso do tratamento das leishmanioses, a depender da região geográfica e
das características genéticas e imunológicas de cada indivíduo, surgindo assim a grande
necessidade de terapias inovadoras, que se enquadrem nos diversos contextos geográficos com
alta sensibilidade e especificidade, de fácil administração, preferencialmente por via oral e curta
duração (ALVES et al., 2018).
A prospecção de novos alvos terapêuticos consiste numa alternativa interessante para a
descoberta de novas terapias para leishmaniose. Algumas vias têm chamado atenção dentro da
pesquisa de novos tratamentos para leishmaniose, como alvos terapêuticos promissores:
alteração nas vias metabólicas do parasito (glicólise, metabolismo do ácido graxo e esterol, do
folato, das poliaminas, dos nucleotídeos e antioxidantes), modulação de peptídeos
antimicrobianos expressos durante a infecção, inibição do proteassoma, inibição de proteínas
secretoras do parasito e inibição enzimática, especialmente da cisteíno-protease que
desempenha um papel crucial na sobrevida dos parasitos, por interferir na sua virulência,
manutenção da viabilidade e da morfologia, invasão do sistema fagocítico mononuclear do

35
hospedeiro e na modulação da resposta imune (SUNDAR; SINGH, 2018; SILVA et al., 2021).
3.3.1 Potencial leishmanicida das naftoquinonas

As quinonas são um grupo de compostos orgânicos aromáticos, geralmente coloridos e
semivoláteis. Esse grupo químico é abundante na natureza e possui dois grupos orgânicos nas
posições 1,2 (orto), ou 1,4 (para), em um de seus anéis aromáticos. As quinonas podem ser
classificadas de acordo com seu sistema aromático como benzoquinonas, fenantraquinonas,
antraquinonas e naftoquinonas. As quinonas possuem propriedades químicas interessantes,
agindo como agentes oxidantes e desidrogenantes em função do sistema aromáticos de suas
moléculas (G DE PAIVA et al., 2015; SOUSA; LOPES; ANDRADE, 2016; FERREIRA et al.,
2022).
As moléculas derivadas da classe das quinonas são muito promissoras no desenho de
compostos bioativos, especialmente as naftoquinonas. As naftoquinonas são um subgrupo das
quinonas, com propriedades antibacterianas, antifúngicas e antiprotozoárias bem relatadas na
literatura. Além disso, as naftoquinonas são utilizadas como scaffold para obtenção de novas
moléculas com alto potencial farmacológico, principalmente compostos contra doenças
parasitárias (ORTIZ-PÉREZ et al., 2021; MENDONÇA et al., 2022).
O lapachol e β-lapachol (Figura 14) são derivados clássicos da naftoquinona extraídos
de árvores pertencentes ao gênero Tabebuia. Popularmente, os indígenas utilizam essas plantas
para tratar infecções de origem parasitária (SILVA et al., 2022). Pertencentes ao grupo 1,4naftoquinonas, o lapachol e seus derivados apresentam atividade contra tripanossomatídeos,
entretanto, apresentam citotoxicidade significativa limitando seu potencial na cadeia de
desenvolvimento de novos fármacos antiparasitários (OLIVEIRA et al., 2018).

36
Figura 14 - Naftoquinonas clássicas: lapachol e β-lapachol

Lapachol

β-lapachol

Fonte: SALAS et al., 2008.

Os compostos naftoquinônicos podem interagir com os sistemas biológicos por
diferentes mecanismos; através de transferências de elétrons, gerando EROs, como o
superóxido e peróxido de hidrogênio, contribuindo para o aumento do estresse oxidativo ou
ainda podem reagir como eletrófilos, gerando ligações covalentes com moléculas biológicas,
alterando o funcionamento das mesmas (KUMAGAI et al., 2012).
As principais limitações das naftoquinonas estão relacionadas às características
farmacocinéticas, especialmente, a baixa biodisponibilidade; a toxicidade para células
mamíferas também constitui um fator limitante, todavia, modificações estruturais nas moléculas
podem melhorar a atividade, bem como diminuir o risco de efeitos tóxicos. Além disso, a
utilização de sistemas de entregas de drogas, como o uso de sistemas coloidais, lipossomais ou
ainda nanopartículas também podem ser úteis nesse contexto (ROCHA et al., 2013;
ELLENDORFF et al., 2015; FRANCISCO FERREIRA et al., 2016).
Diante dessa conjuntura, o presente trabalho se propôs a avaliar a atividade
leishmanicida de uma série de 1,4-naftoquinonas (Figura 15), que foram planejadas como
inibidores de cisteíno protease de tripanosomatídeos, sendo comprovado previamente o seu
efeito inibitório contra cruzaína e rodesaína, enzimas presentes no Trypanosoma cruzi e
Trypanosoma brucei, respectivamente (SILVA et al., 2021).

37
Figura 15 – Planejamento estrutural de derivados 1,4-naftoquinônicos

Fonte: SILVA et al., 2021.

No presente estudo, foram avaliados quanto a atividade leishmanicida três derivados
naftoquinônicos: JN-16, JN-17 e JN-22. Como pode ser visto na Figura 15, o derivado JN-22
fora obtido a partir do composto 2-hidroxinaftoquinona (2-OH-NPQ), através da substituição
do oxigênio carbonílico ligado ao carbono C1. Substituintes nitrogenados foram inseridos no
carbono C2 no precursor 2-OH-NPQ para obtenção dos demais derivados da série JN, entre
estes os derivados JN-16, que possui um grupamento fenil-metilamina em C2 e JN-17, que
possui grupamento metoxila inserido no radical Z.

38
4 METODOLOGIA

4.1 Prospecção tecnológica de novos métodos de imunodiagnóstico para
leishmaniose tegumentar

Foi produzida uma revisão patentária acerca de novos métodos imunodiagnósticos
para leishmaniose tegumentar nos últimos 10 anos. Para tanto, dados de depósitos e
concessões de patentes foram consultados através das bases tecnológicas, Google Patents,
European Patent Office (EPO), United States Patent and Trademark Office (USPTO),
World Intellectual Organization de Propriedade (WIPO), Instituto Nacional de
Propriedade Industrial (INPI), The LENS e Patent Inspiration (PI). A busca foi realizada
entre agosto e setembro de 2021. Foram utilizadas nove combinações de descritores em
inglês e português. O operador booleano escolhido foi “AND/E”. A pesquisa teve como
critérios de inclusão: documentos de patentes que apontaram novos métodos de
imunodiagnóstico para leishmaniose tegumentar humana nos últimos 10 anos (20112021). Os critérios de exclusão foram documentos que abordassem o desenvolvimento de
patentes de leishmaniose visceral, leishmaniose visceral canina, leishmaniose tegumentar
canina, métodos de diagnóstico parasitológico, patentes de adição e patentes repetidas.

4.2 Desenvolvimento de um novo método de diagnóstico, utilizando tecnologia
acustofluídica para diagnóstico da leishmaniose tegumentar

4.2.1 Planejamento e fabricação do dispositivo acustofluídico

O dispositivo acustofluídico foi planejado e fabricado pelo Grupo de Acústica
Física, coordenado pelo Prof. Dr. Glauber José Ferreira Tomaz Silva.

4.2.2 Manutenção da cepa de L. amazonensis
As formas promastigotas da espécie L. amazonensis (MHOM/BR/77/LTB0016)
foram obtidas através do Dr. Eduardo Caio Torres dos Santos (Instituto Oswaldo Cruz Fiocruz/RJ). Estas formas extracelulares do parasito foram mantidas in vitro em meio
Schneider, suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (SFB) e 2% de urina humana à

39
26ºC em incubadora de Demanda Bioquímica de Oxigênio (DBO).

4.2.3 Preparação de antígenos de promastigotas de L. amazonensis

A preparação dos antígenos foi realizada seguindo o protocolo para obtenção de
promastigotas morfologicamente fragmentadas, a fim de observar o comportamento dos
antígenos quanto à concentração e agregação nas microcavidades do dispositivo.
Resumidamente, promastigotas de L. amazonensis na fase estacionária de terceira
passagem foram reunidas por centrifugação (3.500 rpm) a 4ºC durante 10 minutos,
lavadas em PBS (Phosphate Buffered Saline) frio e ressuspensas em tampão Tris HCl
5mM frio (pH 7,6). A suspensão foi submetida a agitação mecânica em vórtex durante
dois minutos e resfriada em gelo por 10 minutos, este processo foi repetido seis vezes.
Em seguida, a suspensão foi centrifugada por 10 minutos a 2.300 g. O pellet bruto
formado foi ressuspenso em 5 mL do tampão Tris e sonicado durante 30 minutos em
ultrassom em PBS, obtendo-se antígenos de membrana de promastigotas, conforme a
metodologia adaptada descrita previamente (ASAD et al., 2015). Ao término do
processamento, os antígenos foram diluídos em concentrações de 1:1, 1:2 e 1:3.

4.2.4 Coloração de antígenos de promastigotas de L. amazonensis

Após a obtenção dos antígenos fragmentados, uma solução de 0,1% de azul de
coomassie R250 foi adicionado por 90 minutos e agitado em temperatura ambiente.
Posteriormente, a suspensão corada foi lavada por centrifugação e ressuspensão (5900 g)
várias vezes até o sobrenadante ficar incolor. O sobrenadante foi descartado e uma
solução de BSA (Bovine Serum Albumin) a 0,1% foi adicionado. Os antígenos corados
foram armazenados no congelador até o momento do uso.

4.2.5 Armadilhamento de antígenos de promastigotas de L. amazonensis

Para o armadilhamento dos antígenos de promastigotas de L. amazonensis no
dispositivo acustofluídico, foram injetados 10 uL da suspensão antigênica com o auxílio
de uma pipeta no poço localizado no dispositivo. Posteriormente, a suspensão antigênica

40
foi submetida a uma frequência de ondas de ultrassom de 3.319 MHz e tensão de pk-pk
menos que 5 volts, de maneira que os antígenos foram aprisionados na zona de
aprisionamento do dispositivo.
4.2.6 Avaliação da eficiência do ensaio de imunoaglutinação direta em aparelho
acustofluídico, utilizando amostras de saliva, urina, sangue total, soro e plasma

Amostras biológicas (saliva, urina, sangue total, soro e plasma) de um indivíduo
positivo e negativo para leishmaniose cutânea foram coletadas, processadas e
armazenadas até o momento do uso. Para avaliar a eficácia do aparelho, 10 µL de cada
amostra coletada foram adicionados a 10 µL da suspensão antigênica, as amostras foram
homogeneizadas e inseridas no aparelho acustofluídico para visualização no microscópio
conectado ao aparelho acustofluídico. A análise foi realizada por 30 minutos com o
aparelho ligado e 10 minutos com o aparelho desligado. As imagens foram capturadas a
cada 5 minutos: T0, T5, T10, T15, T20, T25, T30, T35 e T40, para cada amostra analisada.

4.3 Estudo da avaliação do potencial leishmanicida de derivados de naftoquinonas

4.3.1 Obtenção das substâncias

A série de derivados naftoquinônicos foi sintetizada e fornecida pela Profa. Dra.
Sílvia Helena Cardoso, do Laboratório de Síntese Orgânica e Medicinal da
UFAL/Campus Arapiraca.

4.3.2 Manutenção de linhagem de macrófagos

Os macrófagos da linhagem J774.A1 foram conservados em garrafas de cultura
em 10 ml de meio RPMI (Roswell Park Memorial Institute-1640) suplementado com 10%
de Soro Fetal Bovino (SFB), L-glutamina, piruvato e aminoácidos não essenciais,
mantidas em estufa a 37ºC com 95% de umidade e 5% de CO2. No momento da utilização,
as células foram centrifugadas por 5 minutos, em 1500 rpm a 4°C e contadas em câmara
de Neubauer e, posteriormente, ajustadas em meio RPMI suplementado com SFB na
concentração de 1 x 105 células/mL, no qual foram lançados 200 μL dessa suspensão em

41
placa de 96 poços (Nunc, Denmark).

4.3.3 Determinação da viabilidade celular

Macrófagos da linhagem J774.A1 foram previamente cultivados em triplicatas em
placas de 96 poços, na concentração de 3 x 104 células/poço e incubadas em estufa a 37
ºC com atmosfera úmida contendo 57% de CO2 por 24 horas, para que houvesse a adesão
das células no fundo dos poços. Em seguida, os poços foram lavados para a remoção dos
macrófagos não aderentes e acrescentados em cada poço 200 μL dos compostos sintéticos
previamente diluídos em meio RPMI nas concentrações de 30, 10, 3, 1, 0,3 e 0,1 mg/mL.
Nos poços controles, as células foram cultivadas apenas com meio de cultura e no diluente
dos compostos, o dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma). A viabilidade celular foi
determinada através do ensaio de redução de MTT (Figura 16) (MOSMANN, 1983). A
viabilidade das células tratadas com os compostos foi comparada ao padrão de morte
obtido nas culturas controle.

Figura 16 - Ensaio de viabilidade celular

Fonte: Autora, 2023.

4.3.4 Ensaio de viabilidade de promastigotas de Leishmania spp.

As formas promastigotas de L. chagasi e L. amazonensis foram centrifugadas e
resuspensas em meio Schneider suplementado com 10% de SFB, 2 mM de L-glutamina
e 2% de urina humana, para obter uma concentração de 1x105 parasitos/mL. Em seguida,
alíquotas de 100μL dessa suspensão foram distribuídas em placa de 96 poços. Os poços
receberam o tratamento com as substâncias sintéticas em diferentes concentrações (30,
10, 1, 3, 0,3 e 0,1 mg/mL) e anfotericina b (100 a 0,001 μM), como também o controle
de veículo DMSO (0,2%) preparadas em meio Schneider suplementado, para alcançar um

42
volume final de 200μL por poço. A placa então foi incubada em estufa BOD a 27 oC por
um período de 48 horas. O número de parasitos foi determinado utilizando câmara de
Neubauer, em microscópio óptico. A inibição causada por cada substância foi expressa
como uma porcentagem em relação às células cultivadas apenas na presença do veículo
DMSO.

4.3.5 Análise estatística
A tabulação dos dados foi realizada no software GeaphPad Prisma® (GraphPad
Software, San Diego, CA, USA Statistical), onde avaliou-se os níveis de significância
entre os grupos experimentais e controles positivos ou negativos, utilizando-se a análise
de variança ANOVA, seguido do pós-teste de Dunnett. Os valores foram considerados
significativos quando *p < 0,05, **p <0,01 e ***p <0,001 e expressos como média ±
erro padrão da média.

43
5 PRODUTOS

1.

NEW

IMMUNODIAGNOSTIC

FOR

HUMAN

TEGUMENTARY

LEISHMANIASIS IN THE LAST 10 YEARS: TECHNOLOGICAL PROSPECTING,
submetido na revista “Acta Tropica”, que possui Qualis (2017-2020) A2 para área de
Medicina 1;

2. DEVELOPMENT OF A NEW DIAGNOSTIC METHOD FOR LEISHMANIASIS
USING ACUSTOFLUIDICS, a ser submetido na revista “Analyst”, que possui Qualis
(2017-2020) A1 para área de Medicina 1;

3.

EVALUATION

OF

THE

LEISHMANICIDAL

POTENTIAL

OF

NAPHTHOQUINONE DERIVATIVES, a ser submetido na revista “Experimental
Parasitology”, que possui Qualis (2017-2020) A4 para área de Medicina 1.

44
5.1 Produto 1

New immunodiagnostic methods for human tegumentary leishmaniasis
in the last 10 years: Technological Prospecting

Lilyana Waleska Nunes Albuquerque1,2, Shakira Cavalcante de Albuquerque Ferreira2,
Márcio Thomaz dos Santos Varjão2, Amanda Evelyn da Silva3, Alysson Wagner
Fernandes Duarte4, Glauber T. Silva3,5, Magna Suzana Alexandre-Moreira2*, Aline
Cavalcanti de Queiroz2,4,*

1Programa

de Pós-Graduação em Ciências Médicas, Faculdade de Medicina,
Universidade Federal de Alagoas – UFAL / Campus A.C. Simões, Maceió, AL, Brasil.
2Laboratório de Farmacologia e Imunologia, Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde,

Universidade Federal de Alagoas - UFAL / Campus A.C. Simões, Maceió, AL, Brasil.
3

IntacLab - Integrated Acoustofluidics Laboratory Ltda, Maceió, AL, Brasil.

4Laboratório de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia, Centro de Ciências Médicas

e de Enfermagem, Universidade Federal de Alagoas - UFAL / Campus Arapiraca,
Arapiraca, AL, Brasil.
5Grupo de Acústica Física, Instituto de Física, Universidade Federal de Alagoas - UFAL

/ Campus A. C. Simões, Maceió, AL, Brasil.

*Corresponding Author

Aline Cavalcanti de Queiroz, aline.queiroz@arapiraca.ufal.br
Magna Suzana Alexandre-Moreira, suzana.magna@gmail.com
Glauber T. Silva, gtomaz@fis.ufal.br

45
Highlights
This study is a patent prospection of immunodiagnostic methods for human tegumentary
leishmaniasis in the last 10 years.
Eleven patents satisfied our search criteria, where six of them were registered in 2017.
Ten patents were registered in Brazil.
The most of the patents included in the study refer to the use of peptides or proteins
isolated from the parasites to produce an immunodiagnostic kit.

.

46

GRAPHICAL ABSTRACT

47
ABSTRACT

Leishmaniasis is a neglected disease and more than 1 billion people live in endemic areas
with the risk of infection worldwide. Although it is an important epidemiological issue,
the gold standard method of diagnosis requires invasive sample collection and is
accompanied by a high level of sensitivity variation in results. The present study aims to
conduct a patent prospection of immunodiagnostic methods for human tegumentary
leishmaniasis in the last 10 years, focused on those with high sensitivity and specificity,
and simple usability. We searched seven patent databases: The LENS, WIPO, EPO,
USPTO, Patent Inspiration, Google patents, and INPI. Eleven patents were found that
satisfy our search criteria, with six of them being registered in 2017. Most patents were
registered in Brazil. The information obtained here covers the main characteristics of the
immunodiagnostic methods evaluated. Moreover, our prospective study reveals the latest
biotechnological advancements achieved in the immunodiagnosis of tegumentary
leishmaniasis, especially in Brazil, which holds the majority of patents in this subject.
However, no patent for immunodiagnostic methods was found in the last three years,
which raises concerns about the present and future trends of leishmaniasis diagnosis.

Keywords: Cutaneous leishmaniasis.
prospecting.

Immunodiagnosis. Patents. Technological

48
1.

Introduction

Leishmaniasis is a neglected tropical disease of great importance in global public
health, caused by intracellular protozoa of the Trypanosomatidae family andgenus
Leishmania. The literature describes about 20 species of Leishmania that are transmitted
through the blood meal of infected females of the Phlebotomus insect in the Old World,
and Lutzomyia in the New World (Gabriel et al, 2019). According to data from the World
Health Organization, 1.3 million new cases of leishmaniasis have been recorded and
several deaths that vary between 20,000 and 30,000 per year (OPAS, 2019).
The variety of species is related to different clinical manifestations. Leishmaniasis
is divided into two large groups: visceral leishmaniasis (VL) and tegumentary
leishmaniasis (LT) (WHO, 2022). The tegumentary form of the disease is the most
common clinical spectrum of leishmaniasis and can present in three different forms:
cutaneous leishmaniasis (CL), mucocutaneous leishmaniasis (ML) and diffuse cutaneous
leishmaniasis (DCL) (Aronson; Joya, 2019). LC is characterized by the formation of a
papule in the region of inoculation of the parasite's promastigotes. This papule is usually
found on exposed areas of the body, such as the face, arms and legs. Later, it may progress
to a plaque or nodule state (Gabriel et al., 2019; Prada et al., 2021).
The parasite can spread through the bloodstream or the lymphatic system and,
consequently, reach the patient's mucous membranes, causing the mucocutaneous form.
LM can occur simultaneously with the localized form or approximately one year after the
first lesions. The most affected regions are the nasal and oral mucosa (Scorza; Carvalho;
Wilson, 2017; Abadías-Granado et al, 2021). The most common species that causes LCD
is L. amazonensis, a rare and serious condition, especially due to the resistance to
treatment associated with this manifestation (Volpedo et al., 2021).
The absence or difficulty in adhering to treatment significantly contributes to the
maintenance of parasitic reservoirs, increasing the transmission of infection. Thus, early
diagnosis and adequate treatment are essential components for disease control (Anversa
et al., 2018; Van-Griensven e Diro, 2018). Direct parasitological diagnosis is considered
the gold standard for LT, as it allows visualization of the parasite by means of skin
scraping from the lesion, isolation in culture of the parasites in a sterile environment and
inoculation in animals (Skraba et al 2014; Santos et al., 2019). Although methods of direct
demonstration of the parasite are considered the gold standard, they have variable

49
sensitivity, between 60 and 95% in cultures and smears (Kassa et al., 2020; Duthie et al.,
2018; OPAS, 2019). Molecular diagnosis has also been performed, its main advantage
being the ability to taxonomically characterize Leishmania, but it uses expensive
techniques and requires a specialized laboratory structure (Boni et al., 2017; Barçante et
al., 2019).
Several serological assays are available for the diagnosis of TL, indirect
immunofluorescence, western blot and the most common one, the ELISA test. Although
considered less invasive for obtaining samples than parasitological methods, these assays
have variable sensitivity and/or specificity, depending on the antigen used, the clinical
status of the patients and the coexistence of cross-reactions with other diseases (Maia et
al., 2012 ; Gomes et al., 2014).
Conducting strategic research on emerging technologies in the immunodiagnosis of
TL is the first step towards identifying the potential of this innovation process, as it can
predict and identify future technological opportunities, anticipating and understanding the
course of these new technologies (Teixeira, 2013). The present study aims to conduct a
technological prospection of patents related to new immunodiagnostic methods for
human tegumentary leishmaniasis in the last 10 years, which contribute to the early
diagnosis of this parasitosis, that high sensitivity and specificity, using non-invasive
methods, of easy and fast execution.

2. Search methodology

The prospection was carried out between August to September 2021 and, for this
purpose, data from patent deposits and grants made available in the following
technological bases were used: Google Patents, European Patent Office (EPO), United
States Patent and Trademark Office (USPTO), World Intellectual Organização de
Propriedade (WIPO), Instituto Nacional de Propriedade Industrial (INPI), The LENS and
Patent Inspiration (PI). In the Brazilian base INPI, combination terms in Portuguese
language were used, while in the others the combination terms were used in English.
To this end, the research method cited by Kumar et al (2016) was used through
combinations of keywords in order to investigate bibliographic data and abstracts in the
first stage of the research and, in a second stage, the full text. This excludes patent losses
due to classification errors. For descriptor combinations terms, the Boolean operator

50
chosen was “and”. Nine combination terms were used, however, due to the large number
of patents found and the perception that many of them were outside the scope of the
research, combinations terms 5, 6 and 7 were excluded from the second stage of the
research. The keywords and combinations terms used are shown in Table 1.

Table 1
Flow chart illustrating the selection process of the patents in databases.
Number

keyword 1

Boolean operator

Keyword 2

1

“Tegumentary leishmaniasis”

and

“immunodiagnostic”

2

“Tegumentary leishmaniasis”

and

“diagnostic”

3

“Tegumentary leishmaniasis”

and

“immunoassay”

4

“Leishmaniasis”

and

“immunodiagnostic”

5

“Leishmaniasis”

and

“diagnostic”

6

“Leishmania”

and

“immunodiagnostic”

7

“Leishmania amazonensis”

and

“immunodiagnostic”

8

“Leishmania braziliensis"

and

“immunodiagnostic”

9

“Leishmania guyanensis”

and

“immunodiagnostic”

Eligibility criteria for the selection of patents were defined. Inclusion criteria were
patent documents pointing out new immunodiagnostic methods for human tegumentary
leishmaniasis in the last 10 years (2011-2021). The exclusion criteria were patent
documents related to visceral leishmaniasis, canine visceral leishmaniasis, canine
tegumentary leishmaniasis, parasitological diagnostic methods, and addition or repeated
patents.
Subsequently, repeated patents were analyzed and discarded in the same database
and in different databases. In addition to the distribution of

patents per database, the

temporal distribution of patents and their distribution of ownership by countries, the main
applicants and inventors were evaluated. The International Patent Classification (IPCs)
described for each document was also evaluated and the most frequent subclasses and

51
groups were listed (Fig. 1.).

Fig. 1.Flow chart illustrating the selection process of the patents in databases.

3. Results

3.1. Patents found in the databases

In the first stage of the research, all the descriptors and combinations listed below
were used (Table 2). However, due to the large number of patents found outside the scope
of the research, only six combination terms were considered in the second stage of the
research. In total, 73,707 patent documents were found, of which 630 went on to the next
step that selected the eligible patent documents according to the pre-established criteria.
Google Patents was the database that presented the largest number of documents found,
followed by WIPO and The LENS, respectively.

52

Table 2
Number of patent documents granted and deposited by databases, according to the
combination terms and descriptors, in the period from 2011 to 2021.
Search terms

INPI

Google
patents

WIPO

The
LENS

EPO

USPTO

PI

TOTAL

Tegumentary
leishmaniasis

AND 2

43

0

0

6

0

0

51

AND 1

99

21

22

20

5

7

175

AND 0

41

8

6

8

1

2

66

8

679

10

203

118

54

15

1.088

13

52.768

9.440

5.250

1.697

1.432

67

70.667

3

738

274

183

68

43

7

1.322

AND 0

85

13

3

6

0

1

108

159

37

15

9

0

1

221

1

0

5

2

0

1

9

54.613

9.803

5.687

1.934

1.535

101

73.707

immunodiagnostic
Tegumentary
leishmaniasis
diagnostic
Tegumentary
leishmaniasis
immunoassay
Leishmaniasis

AND

immunodiagnostic *
Leishmaniasis

AND

diagnostic *
Leishmania

AND

immunodiagnostic *
Leishmania
amazonensis

immunodiagnostic
Leishmania
braziliensis

AND 0

immunodiagnostic
Leishmania
guyanensis

AND 0

immunodiagnostic
TOTAL

27

* Combination of descriptors excluded in the second search step.

53
3.2. Patents selected from the search in the databases

Após refinamento e exclusão de patentes duplicadas, 630 documentos de patentes
foram obtidos das bases de dados, dos quais 11 documentos atenderam aos critérios
estabelecidos no estudo. As patentes selecionadas foram identificadas por seu número de
acordo com o ano de publicação, conforme tabela 3. In several studies (10/11), the
principle of the technique used was the identification/isolation of synthetic peptides or
recombinant proteins for the detection of antibodies, through widely used serological
methods, such as ELISA, Western-blot or immunochromatography. In the 11 documents,
the Leishmania species most used in the tests was L. braziliensis. The evaluated patent
documents did not make it clear or did not mention the sample size used, nor the reference
standard test. As for diagnostic performance, four patents registered maximum specificity
and sensitivity (100%).

Table 3
Characteristics of patent documents included in the patent review.

54
Patent Number

Title

WO2011153602A2

Recombinant E-ntpdases,
use in the production of
diagnostic kit for detection
of antibodies in
leishmaniasis caused by
species of the genus
Leishmania

Ipc

C12N 9/16
C12N 15/30
C12N 15/52

A61K 39/008

WO2014091463A1

WO2015097654A1

Process for the production
of recombinant proteins of
leishmania and use in kit
for diagnosis and vaccine
against leishmaniasis

Synthetic peptides, method
and kit for
immunodiagnosis of canine
visceral leishmaniasis and
human tegumentary and
visceral leishmaniasis

A61P 33/02
C12N 15/30
C12N 15/10
G01N 33/549

C07K 7/06
G01N 33/569

Principle
Diagnostic kit using of
recombinant E-NTPDASES
of three species of
Leishmania (L. major, L.
braziliensis, L. infantum)
homologous to its natural
protein for detection of antiLeishmania antibodies.
Diagnostic kit against
leishmaniasis for humans
and/or dogs, using
recombinant antigens HSP
83-1, MAPK and MAPK3,
from proteins present in
protozoa of the genus
Leishmania, which were
selected through
bioinformatic analysis.
Diagnostic method and a
diagnostic kit using
conserved and polymorphic
peptides, were identified
among the different species
of the genus Leishmania,
derived from B cell epitopes
for the identification of
individuals and animals
infected by visceral and
tegumentary leishmaniasis

Method

Species

Diagnostic
Performance

Country
of
Origin

Inventors
(Publication
year)

Brazil

Fietto et al.
(2011)

Brazil

Fujiwara et al.
(2014).

Brazil

Bartholomeu et
al. (2015)

L. major
ELISA assay

90.3% specificity
L. braziliensis

Western-blot

44.1% sensitivity
L. infantum

L. braziliensis
ELISA assay

94.23 to 100.0%
specificity

L. major
L. mexicana

96.15 to 100.0%
sensitivity

L. braziliensis

100.0% specificity

L. major

100.0% sensitivity

ELISA assay

55

EP2827148A4

BR102016005090A2

Differential diagnostic
method and kit for
infectious and parasitic
diseases, using flow
cytometry

Peptide, method and kit for
leishmaniosis
immunodiagnosistegumenta
ry and use

G01N 33/569
G01N 15/14
G01N 21/64
G01N 33/58

C07K 14/44
C07K 7/06
C07K 7/08
G01N 33/569

Diagnostic method by flow
cytometry for the
simultaneous diagnosis of
Chagas’ disease, visceral
and cutaneous leishmaniasis
using preparations of
biological agents stained
with a fluorescent substance
(Trypanosoma cruzi, L.
chagasi, L. amazonensis or
L. braziliensis) for the
simultaneous investigation
of the reactivity profile of
IgGl antibodies present in
the serum of patients.
Serological test from
antigens described as very
immunogenic found in
patients who have the
tegumentary form of
leishmaniasis. The
immunodiagnostic kit
consists of one or more
peptides and/or one or more
metallopeptidase proteins,
Clan MA(E), an M3 family
protein and the hypothetical
conserved protein
gi|134063939 that allow the
serological diagnosis of
cutaneous leishmaniasis.

Trypanosoma cruzi
Flow cytometry

L. chagasi
L. amazonensis or
L. braziliensis

Using 77 serum
samples, including
negative controls
and patients with
Chagas’ disease,
visceral
leishmaniasis and
cutaneous
leishmaniasis, it was
possible to identify
the high
performance of the
method, with 98.7%
(75/76) correct
results, in the first
and second batches
of parasites

Brazil

Martins-Filho et
al. (2015).

¿¿¿¿

Brazil

Monteiro de
Andrade et al.
(2017).

ELISA assay
Western-blot
immunochromato
graphy

L. amazonensis
L. braziliensis

56

WO2017109763A1

WO2017103909A1

Synthetic peptides, method
and kit for diagnosing
human mucosal
leishmaniasis, and use
thereof

Synthetic peptides, method
and kit for the diagnosis of
human cutaneous
leishmaniasis, and use

A61K 39/008
C07K 7/06
C07K 16/42
G01N 33/543

A61K 39/008
C07K 16/42
C07K 7/06
G01N 33/543

Kit for mucosal
leishmaniasis with six
synthetic peptides, isolated
or associated, or
bacteriophage clones
containing these peptides.
The peptides used in the kit
are as follows: ASFLKNR,
SSPFLFS, RSMEIDR,
LEKVFSP, KFTLKAR,
MKFTLNA (SEQ ID Nº 1
to 6).
Kit for cutaneous
leishmaniasis with six
synthetic peptides, isolated
or associated, or
bacteriophage clones
containing these peptides.
The peptides used in the kit
are as follows: KQEDKPI,
YLLCISP, HLFLSSF,
SVMIPQK, SFINSHG,
PGIGSIY (SEQ ID Nº 1 to
6).

100.0% specificity
ELISA assay

L. braziliensis

Brazil

Coelho et al.
(2017).

Brazil

Coelho et al.
(2017).

100.0% sensitivity

100.0% specificity
ELISA assay

L. braziliensis
100.0% sensitivity

57

C07K 14/44
BR102015010519A2

Kit for serological diagnosis
of leishmaniasis, based on
immunoproteomics and use

C12N 15/30
G01N 33/543
G01N 33/569

BR102015032494A2

Synthetic peptides, method
and diagnostic kit for
human mucosal
leishmaniasis, and use

A61K 39/008
C07K 7/06
G01N 33/543
G01N 33/569

Serological kit that contains
at least one of the nineteen
proteins isolated from the
parasite Leishmania
braziliensis (SEQ ID No. 1
to 19). The kit is composed
of a solid support that can
be formed of nitrocellulose,
nylon or latex, one or more
polypeptides consisting of
the sequence of amino acids
from 1 to 19, isolated or in
association, secondary
antibody or protein,
conjugated to enzyme or
marker and a reagent to
detect
Kit for mucosal
leishmaniasis with six
synthetic peptides, isolated
or associated, or
bacteriophage clones
containing these peptides.
The peptides used in the kit
are as follows: ASFLKNR,
SSPFLFS, RSMEIDR,
LEKVFSP, KFTLKAR,
MKFTLNA (SEQ ID Nº 1
to 6).

ELISA assay

L. braziliensis

ELISA assay

L. braziliensis

¿¿¿¿

100.0% specificity
100.0% sensitivity

Brazil

Coelho et al.
(2018).

Brazil

Beatriz et al.
(2018).

58

EP3017305B1

BR102014013193A2

Peptides and methods for
the detection of
leishmaniasis

Method and Kit for
Diagnosing Leishmaniasis
Using Synthetic Peptides
Derived from the MitogenActivated Protein Kinase 3
Encoding Gene (Putative)

G01N 33/569

C07K 16/20
C07K 7/06
G01N 33/569

Diagnostic kit comprising
the two peptides from L.
infantum consisting of SEQ.
ID. N°9 and of SEQ. ID.
N°67, said kit being useful
for detecting antileishmanial antibodies
present in the serum of
patient suffering from
cutaneous Leishmaniasis or
muco-cutaneous
Leishmaniasis provoked by
infestation of South
American Leishmania strain
kit for diagnosing visceral
and tegumentary
leishmaniasis, using
synthetic peptides derived
from the gene coding for
protein kinase activated by
mitogen 3 (putative) of T.
cruzi, which is conserved
among different species of
the genus Leishmania, and
polymorphic in relation to
hosts humans and canines.

L. braziliensis
L. Mexicana

ELISA assay

L. major

>88% specificity

L. amazonensis or
L. infantum

>88% sensitivity

Peru

Arevalo et al.
(2018).

Brazil

Souza et al.
(2019).

American
Tegumentary
Leishmaniasis

68.5 to 95.717%
specificity
ELISA assay

L. braziliensis

70.77 to 98.46%
sensitivity

59

3.3. Temporal distribution of patents on new diagnostic methods for human cutaneous
leishmaniasis

Fig. 2 shows the temporal evolution of the number of patent deposits that support
new immunodiagnostic methods for human TL, published between the years 2011 to
2021. In 2012, 2013, 2016, 2020 and 2021 no patent documents were published in the
search for according to the criteria established in the study. There is a non-linear
progression in the number of patents published between 2015 and 2018. In 2017 and 2018
there is a peak of published patent documents, with 3 publications each year (54.5% of
the total registered).
However, patent publications fall in 2019 and in 2020 and 2021 patent documents
related to the topic were no longer published. From the temporal analysis of the
publication of patents, it is inferred that the drop in the registration of new patents in the
last two years may be associated with the pandemic of the new coronavirus, since it was
necessary to comply with social isolation and the studies turned to the the search for a
vaccine and medication against the virus, and research into neglected diseases became
even more precarious.

Fig. 2. Number of patents filed on new immunodiagnostic methods for human cutaneous leishmaniasis
per year.

60

3.4. Geographic distribution of patents on new immunodiagnostic methods for human
cutaneous leishmaniasis

The analysis of documents deposited by country shows a preponderant role of
Brazil, with 10 documents, representing 90.9% of the records. Only one patent was
published abroad, in Peru, another representant of South America. The search for
Intellectual Property is an area that has been growing a lot in recent years, with patents
being one of the ways to achieve this objective, in addition to representing indicators of
the technological development of a country or region (WIPO, 2019; Thomaz-Soccol et
al., 2018). When comparing data on patent applications by country, in 1997 about 88%
of patent applications belonged to high-income countries such as the United States.
Twenty years later, the distribution of patent filings between high- and middle-income
countries is almost equal, such as Brazil and India (WIPO, 2019).

3.5. International Patent Classification (IPC) Codes

The International Patent Classification (IPC) is an important tool for classifying
patents and patent applications, used by intellectual property agencies around the world.
This classification aims to: assist the search and retrieval of patent documents, orderly
organize the documents and serve as a basis for the preparation of statistics on intellectual
property (WIPO, 2021). The most frequently found IPC subclasses in the 11 selected
patent documents are listed in Table 4.
The most cited subclasses G01N and C07K were the most prevalent in the
classification of the patents selected in the study, with 40.5% and 29.7% of participation,
respectively. The G01N subclass deals with the investigation or analysis of materials to
determine physicochemical properties and the C07K subclass comprises the use of
peptides. Patents were also associated with the C12N subclass (16.2% of citations), which
deals with microorganisms or enzymes and their uses in the area of biotechnology;
subclass A61K (10.8% of citations), which deals with preparations for medical purposes;
and the A61P subclass (2.7%) with regard to the therapeutic activity of chemical
substances or medicinal formulations (WIPO, 2021).

61

Table 4
Description of the main subclasses of the International Patent Classification (IPC)
associated with the patent documents selected in the study
IPC

Number of

Subclasses

citations

G01N

15 (40.5%)

Description

Investigate or analyze materials, determining their
physical properties or determining.
Microorganisms or enzymes; of the same compositions;

C12N

6 (16.2%)

propagating, preserving or maintaining microorganisms;
genetic change or engineering; culture mediums.

C07K

11 (29.7%)

Peptides.

A61K

4 (10.8%)

Medical, engineered or toilet fin preparations.

A61P

1 (2.7%)

Specific therapeutic activity of chemical products or
medicinal preparations.

According to the most frequent IPC groups, which were associated with the selected
patents, G01N 33/569 (07 patents), the most abundant of them, is related to investigation
or analysis of materials by specific methods for microorganisms, for example, protozoa,
bacteria, viruses, this being a group of great interest in the scope of this research (WIPO,
2021).
Another abundant group, C07K 7/06 (mentioned in 06 patents), deals with peptides
containing 5 to 11 amino acids, whose use was for the production of antigens in the
proposed tests. Group G01N 33/543 (04 patents) deals with immunoassays with insoluble
carrier for immobilization of immunochemicals. Group A61K 39/008 (04 patents) is
linked to Leishmania antigens. The C12N 15/30, C07K 14/44 and C07K 16/42 groups
were cited in 03 patents and deal, respectively, with genes encoding protozoan proteins,
protozoan peptides and peptides against immunoglobulins (anti-idiotypic antibodies).
Other codes associated with only 01 patent were C12N 9/16, C07K16/20, C07K 7/08,

62

C12N 15/10, G01N 33/549, A61P 02/33, G01N 15/14 G01N 21/64 and G01N 33/58
(WIPO, 2021), as shown in Fig. 3.

Fig. 3. Groups and subgroups of technological areas.

4. Discussion

TL is a serious public health problem worldwide. There are an estimated 600,000
to 1 million new cases occurring annually, but only 200,000 cases are reported to the
WHO (WHO, 2022). Early diagnosis considerably increases the chances of therapeutic
success, however current diagnostic methods for TL have some disadvantages and
limitations, mainly in relation to sensitivity and specificity, due to the variety of clinical
forms and species causing the infection and the occurrence of cross-reactions with other
pathogens, making it difficult to correctly diagnose the patient (Lage et al., 2019; Pena et
al., 2020). In this scenario, there is an urgent need to develop new diagnostic
methodologies for TL.
The patent documents selected in the present study demonstrate new methods of
immunodiagnosis for TL, developed between 2011 and 2021, however, about 50% were
published in 2018 and 2019, with Brazil being the predominant country in the deposit of
these patents. According to the World Intellectual Property Indicators (2019), in 2018,
there was a strong increase in patent filing activity in Brazil, around 9.8%. Brazil's
preponderant role in the technological mapping in this area stems from the interest in
seeking new technologies that facilitate the diagnosis of TL, since this clinical form is the

63

most common in the Americas. In 2016, Brazil, Peru and Colombia accounted for 15%
of all TL cases in the world. From 2001 to 2017, more than 940,000 new cases of CL and
CML were reported by 17 of the 18 endemic countries in the Americas (WHO, 2022;
OPAS, 2019).
The high performance of these new immunodiagnostic methods for TL,
demonstrated by their high sensitivity and specificity, mainly in the inventions
WO2015097654A1, WO2017109763A1, WO2017103909A1 and BR102015032494A2
whose performance of the diagnostic technique was equal to 100%, seems to be a good
alternative to improve the quality of the existing serological tests, as they are based on
the production of more selective antigens for detecting antibodies in TL, since patients
with this condition produce low levels of anti-Leishmania antibodies, especially those
who develop CL (Freire et al., 2021; Vale et al., 2022).
For antibody detection using the evaluated antigenic targets, all patent documents
considered the use of the ELISA test to be more viable. The main advantages compared
to the ELISA test are mainly related to the method being less invasive in the collection of
biological material, the ability to perform the test with several samples at the same time,
easy execution and medium cost compared to other immunological methods (Carvalho et
al., 2017; Pena et al., 2020).
Although these results are encouraging, the inventions have important limitations
from the methodological point of view, constituting barriers that hinder the
implementation of these new serological methods in the routine of TL. The main
limitations observed were: non-existence or non-citing of the gold standard method as a
diagnostic reference, reduced sample size or not cited in the document, non-inclusion of
patients with clinical signs that resemble TL (sporotrichosis, paracoccidioidomycosis,
leprosy, syphilis and other tegumentary diseases) and not distinguishing the stage of
infection and the clinical form of the disease (Freire et al., 2021).

4. Conclusion

In conclusion, the present prospective study indicated the biotechnological
advances in the immunodiagnosis of TL in the last decade, especially in Brazil, the

64

country that holds the largest number of patents. Although it is observed that the patents
identified potential antigenic targets for the detection of anti-Leishmania antibodies, the
detection techniques used bring little novelty and are already used in routine, such as
ELISA, flow cytometry and western blot. The studies are still preliminary and have
decreased in the last three years, despite the epidemiological importance that
leishmaniasis has in the field of parasitic diseases.

Declaration of Competing Interest

The authors declare that they have no known competing financial interests or personal
relationships that could have appeared to influence the work reported in this paper.
The authors declare the following financial interests/personal relationships which may be
considered as potential competing interests.

Acknowledgments

The authors would also like to thank CAPES, CNPq, INCT-INOFAR, MCTI,
Decit-SCTIE-MS, SESAU-AL, FAPEAL and the various colleagues working at UFAL for
constructive criticism and assistance with this project.

65

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69

5.2 Produto 2

Development of a new diagnostic method for leishmaniasis using
acustofluidics
Giclênio Cavalcantea¶, Lilyana Waleska Nunes Albuquerqueb¶, Ana Maria Torres da
Silvaa#, Harrisson David Assis Santosa#, Shakira Cavalcante de Albuquerque Ferreirab#,
Amanda Evelyn da Silvab#, Alysson Wagner Fernandes Duartec#, Magna Suzana
Alexandre-Moreirab&, Aline Cavalcanti de Queiroz*b,c&, Glauber José Ferreira Tomaz
Silva*a&

b

Grupo de Acústica Física, Instituto de Física - Universidade Federal de Alagoas,
Campus A. C. Simões, CEP: 57072-970, Maceió-AL, Brasil

a

Laboratório de Farmacologia e Imunologia- Universidade Federal de Alagoas,
Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde, Av. Lourival Melo Mota, s/n, Tabuleiro do
Martins, CEP:57072-900, Maceió – AL, Brasil
c

Laboratório de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia - Universidade Federal de
Alagoas, Campus Arapiraca, Centro de Ciências Médicas e de Enfermagem, Av.
Manoel Severino Barbosa, Bom Sucesso, CEP: 57309-005, Arapiraca-AL, Brasil

*Address for correspondence: Grupo de Acústica Física, Instituto de Física, Universidade
Federal de Alagoas, Av. Lourival Melo Mota, s/n, Cidade Universitária, Maceió, AL,
CEP: 57072-900, Brazil.
Tel: +55 82 32141527.
*Corresponding Author
Glauber T. Silva, gtomaz@fis.ufal.br
Aline Cavalcanti de Queiroz, aline.queiroz@arapiraca.ufal.br
¶

These authors contributed equally to this work.
These authors contributed equally to this work.
&
These authors also contributed equally to this work.
Declarations of interest: none
#

70

Development of a new diagnostic method for leishmaniasis using
acustofluidics

Abstract
Leishmaniasis is a neglected disease that, despite its epidemiological importance, still has
limitations in terms of diagnosis, either because the gold standard uses an invasive method
of collecting biological samples, or due to variation in sensitivity, requirement for
laboratory structure, highly qualified technicians or high cost of other methods used. For
this purpose, an acustofluidic device with 3D printing technology was designed and
manufactured to perform ultrasound-enhanced direct agglutination tests. Antigen
production was standardized, and antigens were obtained with morphologically
fragmented promastigotes which were then stained. Samples containing Leishmania
amazonensis antigens were successfully trapped within the apparatus by ultrasound force
in a volume of less than 10 microliters. Then, the antigens were diluted in biological
samples (saliva, urine, plasma, serum and whole blood) from positive and negative
individuals for cutaneous leishmaniasis, in order to evaluate the efficiency of the method.
The particle agglomeration pattern seems to change according to the type of biological
sample and between negative and positive samples, but for a qualitative evaluation the
results are inconclusive and require further studies to determine the conditions to avoid
the agglomeration of antigens in the samples. negatives. Improvement studies must be
carried out and the results obtained here do not rule out the possibility of developing a
new diagnostic method to be used in the screening and diagnosis of this neglected disease.

Keywords: Leishmaniasis. Direct agglutination test. Devices for acustofluidics.

71

Introduction

Leishmaniasis is characterized by being a set of anthropozoonosis with a variety
of clinical manifestations due to infection with parasites of the genus Leishmania, being
classified into two main clinical forms: the tegumentary form, in which there is the
appearance of lesions on the skin and mucous membranes, being caused by dermotropic
species of Leishmania; and the visceral form, which presents as etiological agents,
mainly, the species Leishmania donovani and Leishmania infantum chagasi, which
generate a systemic infection characterized by fever, anemia, pancytopenia,
hepatosplenomegaly, and can be fatal in patients not treated properly (1, 2).
This neglected disease is endemic in 98 countries in temperate and tropical regions
with 1 billion people living in areas at risk for developing one of the many forms of the
disease. The estimated global annual prevalence of all forms of leishmaniasis is almost
12 million, the annual incidence is 1 million new cases, in addition to having more than
30,000 annual deaths (3). Brazil is responsible for 90% of reported cases in the Americas
and is the third largest focus of global visceral leishmaniasis, still constituting a major
public health problem for the country (3, 4).
As untreated patients with leishmaniasis constitute reservoirs of the parasites and,
therefore, contribute to the transmission of the disease, early diagnosis and treatment are
considered an essential component in disease control (1, 5). The parasitological diagnosis
is the gold standard for the diagnosis of tegumentary and visceral leishmaniasis, using as
samples the biopsy of the tegumentary lesion or the bone marrow aspirate, respectively
(1, 6). However, this method has variable sensitivity and involves invasive sample
collection procedures, especially in patients with the visceral form. Consequently,
infected hosts may remain untreated and develop symptomatic disease (7).
For the etiological diagnosis, alternatives include molecular approaches for the
detection of Leishmania spp. through confidential methods based on the polymerase chain
reaction (PCR), which can detect the Leishmania genus to confirm leishmaniasis (as with
other parasitological methods) or identify the Leishmania species (8). Although there has
been a substantial increase in the application of molecular biology techniques for the
identification of Leishmania species, their widespread use in diagnosis is still hampered

72

by the high cost of execution, as well as the requirement of substantial laboratory
infrastructure and domain of technical knowledge, being limited to well-established
reference laboratories (9, 10).
Several serological assays are available, including direct agglutination test,
ELISA and immunofluorescence (2). Although considered less invasive to obtain samples
than parasitological methods, these assays have variable sensitivity and/or specificity,
depending on the antigen used, the clinical status of the patients, the coexistence of crossreactions with other diseases, among others (11, 12). Furthermore, several of these assays
are too complicated for use in endemic areas (2). Rapid immunochromatographic tests
are widely used in Brazil, but they have the same limitations as other serological tests,
and must be interpreted according to a clinical context, in addition to presenting high
variation in relation to sensitivity, presenting moderate performance in Latin America and
weak in the African continent (13, 14). In addition, the diagnosis of canine leishmaniasis
also has the same limitations as the human diagnosis, with the dog being an important
reservoir of visceral leishmaniasis (15).
Therefore, there is a pressing need to develop a highly standardized, sensitive,
specific, easy and fast diagnostic method to detect leishmaniasis, especially in Brazil’s
rural region. In this context, this study sought to develop a new rapid and specific
diagnostic method for cutaneous leishmaniasis, non-invasive, easy to perform, based on
the use of varied patient samples (serum, peripheral blood, urine and saliva), based on the
principle of beginning of immunoagglutination, using an acustofluidics device. The main
action of the device is to increase the probability of antigen and antibody collisions
through the agglutination and concentration of these bio-particles, using ultrasound
standing waves (16). The objective of the present work is to develop a new method of
diagnosis for leishmaniasis, from the immunoagglutination technique, using an
acustofluidic device, which is more efficient (with greater selectivity and specificity), low
cost and without the need for laboratory facilities.

73

Material and methods

Planning and fabrication of the acustofluidic device

The device used to carry out this work was designed to manipulate the parasite
that causes leishmaniasis through Autocad design, Comsol simulations and injection and
separation modules of biological samples, as well as to carry out the immunoassay.
Therefore, we used parameters such as dimensions and physical properties of this
parasite, to simulate an acoustic microcavity with a resonance pattern conducive to the
desired entrapment. From computer simulations, we obtained a 3D model, in a computeraided design (CAD) file, suitable for 3D printing. We use a 3D resin printer, with digital
light processing (DLP) technology, to print the CAD file. We couple these devices with
microfluidics, an ultrasonic element, allowing the parasites, when injected into the device,
to levitate so that they are not influenced by the walls and the substrate. The configuration
consists of a cylindrical microcavity, sealed with a glass slide, two microchannels, “inlet”
and “outlet”, are used to access the cavity, the ultrasound is obtained by a piezoelectric
element with resonance at a frequency of 3.4 MHz.
Observations of agglomerates and evolutions inside the cavity were carried out
through cameras coupled to optical microscopes. To carry out the analyses, we first
sterilize the device by applying 70% alcohol through the inlet channel, this process also
helps to eliminate any residue that is inside the device and prevents the emergence of air
bubbles inside the cavity, then we use distilled water to remove any volume of alcohol
present, finally we inject it with PBS to leave the cavity environment conducive to the
manipulation of microorganisms.
With the device clean, we connected it to a function generator operating at a
frequency close to 3.319 MHz and an amplitude of 5 Vpp. This frequency can be adjusted
according to the samples used and the need for the tests being carried out, it is also
possible to accelerate the agglomeration process by increasing the signal power, limited
to a maximum of 10 Vpp, an oscilloscope was used to monitor the signal. Data acquisition
took place through the proprietary software Cellsens Entry, which provides connection to
the DLP used in the optical microscope, initial evaluations are performed from the visual

74

evaluation of these results.

Maintenance of the L. amazonensis strain
The

promastigote

forms

of

the

Leishmania

amazonensis

species

(MHOM/BR/77/LTB0016) were obtained from Dr. Eduardo Caio Torres dos Santos
(Oswaldo Cruz Institute - Fiocruz/RJ). These extracellular forms of the parasite were
maintained in vitro in Schneider medium, supplemented with 10% Fetal Bovine Serum
(FBS) and 2% human urine at 26ºC in a Biochemical Oxygen Demand (BOD) incubator.

Preparation of L. amazonensis promastigote antigens

Antigen preparation was carried out following the protocol for obtaining
morphologically fragmented promastigotes, in order to observe the behavior of the
antigens in terms of concentration and aggregation in the microcavities of the device.
Briefly, third-pass stationary phase L. amazonensis promastigotes were pooled by
centrifugation (3500 rpm) at 4°C for 10 minutes, washed in cold PBS and resuspended in
cold 5 mM Tris HCl buffer (pH 7.6). The suspension was vortexed mechanically for two
minutes and cooled on ice for 10 minutes, this process was repeated six times. Then, the
suspension was centrifuged for 10 minutes at 2.300 g. The formed crude pellet was
resuspended in 5 ml of Tris buffer and sonicated for 30 minutes under ultrasound in PBS,
obtaining promastigote membrane antigens, according to the adapted methodology
described previously (17). At the end of processing, the antigens were diluted in
concentrations of 1:1, 1:2 and 1:3.

Staining of L. amazonensis promastigote antigens

After obtaining the intact and fragmented antigens, a 0.1% solution of coomassie
blue R250 was added for 90 minutes and stirred at room temperature. Subsequently, the
stained suspension was washed by centrifugation and resuspension (5.900g) several times
until the supernatant became colorless. The supernatant was discarded and a 0.1% BSA

75

solution was added. The stained antigens were stored in the freezer until use.

Trapping of L. amazonensis promastigote antigens

For the trapping of L. amazonensis promastigote antigens in the acustofluidic
device, 10 uL of the antigenic suspension were injected with the aid of a pipette in the
well located in the device. Subsequently, the antigenic suspension was subjected to an
ultrasound wave frequency of 3319 MHz and a pk-pk voltage of less than 5 volts, so that
the antigens were trapped in the entrapment zone of the device. Images were captured
every 5 minutes: T0, T5, T10, T15, T20, T25, T30, T35 and T40, for each analyzed sample.

Evaluation of the efficiency of the direct immunoagglutination assay in an acustofluidic
device, using samples of saliva, urine, whole blood, serum and plasma

Biological samples (saliva, urine, whole blood, serum and plasma) from a positive
and negative individual for cutaneous leishmaniasis were collected, processed and stored
until the moment of use. To evaluate the effectiveness of the device, 10 µL of each sample
collected was added to 10 µL of the antigenic suspension, the samples were homogenized
and inserted into the acustofluidic device for visualization in the microscope connected
to the acustofluidic device. The analysis was performed for 30 minutes with the device
turned on and 10 minutes with the device turned off. Images were captured every 5
minutes: T0, T5, T10, T15, T20, T25, T30, T35 and T40, for each analyzed sample.

76

Results

To demonstrate the capture capacity of the acoustofluidic device, samples of
fragmented L. amazonensis antigens were produced and injected into the cavity of the
device (bioreactor), which has dimensions of the order of millimeters. Inside the cavity,
the antigens were subjected to wave frequency and the entrapment of the antigenic
particles was verified from the optical microscope view, as shown in Figure 1.

a

b

c

d

e

f

77

g

h

Figure 1. Antigens of stained L. amazonensis fragmented promastigotes being trapped
in an acustofluidics device at T0 (a), T5 (b), T10 (c), T15 (d), T20 (e), T25 (f), T30 (g) e T40
(h).

According to the tests carried out, the capture was remarkably performed,
however, factors related to the density and concentration of antigenic particles seem to
influence the capture start time. The more concentrated antigenic suspension was more
easily captured than the more diluted suspension (1:3). In studies carried out with antigens
from fragmented L. amazonensis promastigotes, entrapment began as soon as the
suspension was injected into the device cavity, as shown in Figure 1. Once injected, the
antigens are slightly concentrated in the capture region and soon after the first 5 minutes,
it is possible to visualize a cluster of antigens in formation under the microscope.
In a continuous process, and while the ultrasound remains on, the antigenic
particles continue to be attracted to the trapping zone. The results of the antigen capture
time provide important data for the research, because to be considered a rapid test, the
results must be produced in a maximum of 30 minutes. As shown in Figure 1 (h), when
the acustofluidic device is turned off, the antigens seem to remain attracted, however,
they fall on the levitation plane and the trapping zone is blurred under the microscope.
The figures below (Figures 2, 3, 4, 5 and 6) show fragmented L. amazonensis
antigens (FLA) diluted (1:1) with the following samples collected from the leishmaniasispositive and leishmaniasis-negative patient: saliva, urine, plasma , serum and whole
blood, respectively. Visualization was performed on the device's camera at different
analysis times: (a) Initial time (T0 min) and final time (T30 min).

78

In Figure 2, it is possible to observe some difference in the agglomeration pattern
obtained between the sample of positive and negative individuals for leishmaniasis. In
Figure 2-b the clustering pattern appears to be more intense than in the negative sample
(Figure 2-d). This different agglomeration pattern in saliva can be influenced by saliva
density, since when inserted into the device, the sample presented a certain resistance
when passing through the microcavity.

a

b

c

d

Figure 2. FLA + saliva from a positive individual in (a) T0 and (b) T30 and FLA + saliva
from a negative individual in (c) T0 and (d) T30

Figure 3 shows a pattern of antigen trapping that is different from the pattern
observed in the saliva sample. In the sample from an individual positive for leishmaniasis
(Figure 3-b) there is formation of two trapping zones and the particles seem more united
than in the previous sample. However, when compared with the urine sample of the
individual negative for leishmaniasis (Figure 3-d), the trapping pattern was very similar,
however with the formation of a single trapping zone.

79

a

b

c

d

Figure 3. FLA + urine from a positive individual in (a) T0 and (b) T30 and FLA + urine
from a negative individual in (c) T0 and (d) T30

In Figure 4 it is possible to observe the difference in the trapping pattern between
the plasma of the positive and negative individual for leishmaniasis. Comparing the initial
trapping time, it is possible to observe that the positive sample (Figure 4-a) seems to
cluster faster than the negative sample (Figure 4-b). However, at the final time (Figures
4 – b and d) both samples had their particles agglomerated in the device.

a

b

80

c

d

Figure 4. FLA + plasma from a positive individual at (a) T0 and (b) T30 and FLA +
plasma from a negative individual at (c) T0 and (d) T30
Figure 5 shows the trap pattern of serum samples from positive and negative
individuals for leishmaniasis. The initial time (Figures 5 – a and c) is very similar in both
samples, but in the final time the positive sample has two trapping zones and the negative
sample only one trapping zone. However, for both samples the device trapped the
particles, demonstrating a similar agglomeration pattern between the evaluated samples.

a

b

c

d

81

Figura 5. FLA + soro de indivíduo positivo em (a) T0 e (b) T30 e FLA + soro de
indivíduo negativo em (c) T0 e (d) T30
In samples containing whole blood, trapping showed a different pattern than the
other samples. It is believed that, due to the presence of many red blood cells, the trapping
of antigens is not as pronounced as in the other samples. After a period of 30 minutes, it
is possible to observe an agglomeration of red cells next to the antigens, which was more
visible in the sample from the positive individual than in the sample from the negative
individual for leishmaniasis.

a

b

c

d

Figura 6. FLA + sangue total de indivíduo positivo em (a) T0 e (b) T30 e FLAD +
sangue total de indivíduo negativo em (c) T0 e (d) T30

82

It is worth mentioning that a common characteristic of all the evaluated samples
is the aggregation of antigenic particles with a tendency to form a very similar geometric
arrangement, especially among the positive samples, in a honeycomb or spiral format,
evidencing the acoustic movement produced by the device, as shown in the figure below
(Figure 7).

Figure 7. Geometric honeycomb arrangement

Discussion
Although there are studies on new diagnoses for leishmaniasis, there is still no
technique available that facilitates its routine use, and there is a need to develop a faster,
more effective, safer, simpler and less expensive diagnostic method, in addition to being
innocuous and reliable, essential conditions to make it accessible, scalable and universal.
Cases, the discovery of new useful diagnostic methods, especially leishmaniasis,
represent a greater facility in the national health sector, allowing a greater ease of
monitoring the methods of the disease.
Several serological tests have been developed to detect antibodies to Leishmania

83

spp. in blood or serum, being a method commonly used in direct agglutination tests
(DATs). DATs use antigens prepared from dead promastigotes and linked to blue markers
to read the assay (21). In this context, the combination of DATs with acustofluidic
technology is of particular importance for the diagnosis of diseases, since when the
mixture between antigens and the patient's sample is injected into the acustofluidic device,
ultrasound increases the probability of collisions between antigens and antibodies. Thus,
increasing the interaction between them and decreasing the reaction time for the
formation of the antigen-antibody complex (16).
The results of the preliminary analyzes were promising, demonstrating that
through acustofluidics the device showed the capacity to capture fragmented antigens of
L. amazonensis, which are crucial elements of the diagnostic test proposed here.

The

literature describes the study of microfluidics in parasitic diseases for diagnostic and
therapeutic purposes, but this is the first time that a prototype acustofluidic device has
been used for diagnostic purposes for cutaneous leishmaniasis, using the principle of
immunoagglutination (24, 25).
The parasitic movement of promastigotes and amastigotes of Leishmania spp.
exposure to ultrasonic standing waves were studied using an acustofluidic device. The
authors observed that the two evolutionary forms of Leishmania spp. were trapped in the
pressure node located in the center of the channel, presenting different forms and stability
conditions between the two evolutionary forms (22). The acoustic entrapment of
macrophages was also evaluated, considering that they are cells commonly used in assays
of infection by L. amazonensis for the purpose of discovering new drugs for the treatment
of leishmaniasis. The authors confirm the advantages of using acustofluidic devices, as
they have a simple manufacturing process, using low-cost materials and simple handling.
and the formation of stable cell clusters, with a fast and satisfactory response time,
therefore, they have great potential for diagnostic and therapeutic purposes (23).
The improvement of immunoassays using ultrasonic waves is a recent technology
and has been studied for two types of immunoassays: agglutination and fluorescence. For
this purpose, polystyrene particles functionalized with antibodies are used to attract and
concentrate antigens. The ultrasound then serves to increase the probability of collision
of these particles, trapping them in the pressure nodes of the standing wave.

84

Consequently, the speed rate and sensitivity of the test is increased (13).
In the present study, after the first analyzes of the functioning of the device, it was
possible to observe that the acoustic force in the device ends up agglomerating the
antigens in both positive and negative samples. Although there are no significant
differences from the point of view of qualitative analysis between positive and negative
samples, there are numerous predicted possibilities that can be better studied and better
understood, according to these first observations.
Changes to the device, such as voltage and amplitude, can bring better results and
do not rule out the possibility of the proposed device becoming a general-purpose
platform, with a variety of applications for life sciences, diagnostic medicine and
biotechnology. Determining the conditions to avoid this agglomeration in samples from
individuals without the disease is a challenge to be considered, and an image standard
must be established that can more clearly define a positive sample from a negative sample.
Immunoagglutination assays using acustofluidic devices still have great potential and
appear to be very suitable for implementation in the lob-on-a-chip format (13).

Conclusions

The results demonstrated here reinforce the capture capacity of the acustofluidic
device, now capturing and levitating antigens quickly and using a low sample volume of
L. amazonensis antigens, produced from fragmented promastigotes. The initial evaluation
of the efficiency of the device for application in the rapid immunoagglutination test for
cutaneous leishmaniasis is still inconclusive. The image pattern between negative and
positive samples is very similar and reveals a limitation that the technique has, but which
can be remedied by modifying the device and continuing the study. Acoustofluidic
technology is a new methodology and has great potential and applicability in the
development and improvement of diagnostic tests.
Conflicts of interest

There are no conflicts to declare.

85

Acknowledgments

The authors would like to thank Dr. Eduardo Caio Torres dos Santos for kindly
providing the promastigotes of L. amazonensis (MHOM/BR/77/LTB0016). The authors
would also like to thank the CAPES, CNPq, INCT-INOFAR, MCTC, FINEP, and
FAPEAL. Moreover, the authors would like to thank several colleagues working at the
UFAL for constructive criticism of and assistance with this project.

Funding
This work was supported by the Institutional Program for Scientific Initiation
Scholarships (CNPq, FAPEA and Federal University of Alagoas), and Decit/SCTIE/MS,
CNPq, FAPEAL e da SESAU-AL (PPSUS 06/2020, Nº 60030.0000000194/2021).

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89

5.3 Produto 3

Evaluation of the leishmanicidal activity of naphthoquinone derivatives

Lilyana Waleska Nunes Albuquerquea¶, Silvia Helena Cardosob¶, Alysson Wagner Fernandes
Duartec#, Magna Suzana Alexandre-Moreiraa&, Aline Cavalcanti de Queiroza,c&*

a

Laboratório de Farmacologia e Imunologia- Universidade Federal de Alagoas, Instituto de
Ciências Biológicas e da Saúde, Av. Lourival Melo Mota, s/n, Tabuleiro do Martins,
CEP:57072-900, Maceió – AL, Brasil
b

Laboratório de Química Orgânica e Síntese Medicinal - - Universidade Federal de
Alagoas, Campus Arapiraca, Núcleo de Ciências Exatas, Av. Manoel Severino Barbosa, Bom
Sucesso, CEP: 57309-005, Arapiraca-AL, Brasil
c

Laboratório de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia - Universidade Federal de
Alagoas, Campus Arapiraca, Centro de Ciências Médicas e de Enfermagem, Av. Manoel
Severino Barbosa, Bom Sucesso, CEP: 57309-005, Arapiraca-AL, Brasil

*Address for correspondence: Laboratório de Farmacologia e Imunidade, Setor de Fisiologia e
Farmacologia, Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Federal de Alagoas,
Av. Lourival Melo Mota, s/n, Cidade Universitária, Maceió, AL, CEP: 57072-900, Brazil.
Tel: +55 82 32141527.
*Corresponding Author:
Aline Cavalcanti de Queiroz, aline.queiroz@arapiraca.ufal.br
Magna Suzana Alexandre-Moreira, suzana.magna@gmail.com

These authors contributed equally to this work.
These authors contributed equally to this work.
These authors also contributed equally to this work.
Declarations of interest: none
¶

#

&

90

Evaluation of the leishmanicidal activity of naphthoquinone derivatives

Abstract

Leishmaniasis is an endemic parasitosis in 102 countries and territories, caused by a protozoan
of the genus Leishmania and transmitted by the bite of a sandfly during a blood meal. The
disease has different clinical forms, from cutaneous lesions to systemic involvement. The
therapeutic arsenal for the treatment is quite limited, due to low safety and high levels of
resistance. Faced with the need to develop new, more efficient and safer leishmanicidal drugs,
this work proposed to investigate the leishmanicidal activity of three 1,4-naphthoquinone
derivatives, planned as cysteine protease inhibitors, a crucial enzyme for parasite survival.
Therefore, the cytotoxic potential of the derivatives was evaluated through the cell viability
assay, using MTT (3-[4,5-dimethyl-thiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide). The
results of the in vitro cell viability assay showed that the JN16 and JN17 derivatives induced a
cytotoxic effect in the host cell, while the JN22 derivatives did not show a cytotoxic effect up
to the maximum concentration tested, 30 μg/mL. The derivatives were active against the
promastigotes forms of L. chagasi and L. amazonensis, especially the compound JN22, which
showed IC50, maximum effect and selectivity index with results superior to the standard drug.
New studies must be carried out to prove the leishmanicidal effect of the compounds via
inhibition of cysteine proteases of Leishmania spp parasites.

Keywords: Leishmanicidal. Naphthoquinones. Leishmania. Cysteine protease.

91

1. Introduction

Leishmaniasis is affected by protozoa of the Trypanosomatidae family, of the genus
Leishmania. Currently, more than 20 species of Leishmania are known to be transmitted
through the bite of infected sandflies. Leishmaniasis is divided into three main types: visceral
leishmaniasis (VL), cutaneous leishmaniasis (CL) and mucocutaneous leishmaniasis (CML)
(WHO, 2022). In 2019, leishmaniasis became endemic in 102 countries and territories, causing
the death of 20 to 30 thousand people per year. About 310 million people live in areas at high
risk of infection with leishmaniasis, and it is a disease classified by the WHO as one of the five
largest parasitic diseases in the world (ALVAR et al, 2012; WHO, 2022; OPAS, 2019).
Since the 1950s, the drugs of choice for treatment have been pentavalent antimonials
(Pentostam® and Glucantime®), administered parenterally. The second line of treatment for
leishmaniasis consists of amphotericin B (conventional or liposomal), pentamidine and
miltefosine, the latter being the only drug administered orally (VAN-GRIENSVEN, 2012;
CHÁVEZ-FUMAGALLI, 2015). Drug therapy must be chosen carefully, as the fight against
parasites considers the species of Leishmania involved, as well as the clinical form of the
disease, the characteristics of the lesions and the individual's immune system (STEBUT, 2015).
Due to the limitations of these drugs in terms of low safety and efficacy, high rates of
toxicity and cost, there is a need to develop new, more effective leishmanicidal agents, with a
high therapeutic index, easy administration, selective and able to promote activation of the
immune system. properly, as a form of defense against parasites (BASTOS, et al., 2016;
ZULFIQAR; SHELPER; AVERY, 2017).
The prospection of new therapeutic targets can impact the success of drug therapy for
leishmaniasis. Some targets have already been studied, such as new opportunities for the
eradication of the parasite: alteration in the parasite's metabolic pathways (glycolysis,
metabolism of fatty acid and sterol, folate, polyamines, nucleotides and antioxidants),
modulation of antimicrobial peptides expressed during infection, proteasome inhibition,
inhibition of the parasite's secretory proteins and enzymatic inhibition, especially of cysteine
protease, which plays a crucial role in the survival of the parasites, by interfering with the
virulence of the parasite, maintenance of the viability and morphology of the parasite, invasion
of the host's mononuclear phagocytic system and the modulation of the immune response
(SUNDAR; SINGH, 2018; SILVA et al., 2021).

92

In this context, the molecules derived from the quinone class are very promising in the
design of bioactive compounds, such as naphthoquinones. Naphthoquinones are a subgroup of
quinones, with antibacterial, antifungal and antiprotozoal properties well reported in the
literature (MENDONÇA et al., 2022; ORTIZ-PÉREZ et al., 2021). Lapachol and β-lapachol
are classical naphthoquinone derivatives extracted from trees belonging to the genus Tabebuia.
Popularly, indigenous people use these plants to treat infections of parasitic origin (SILVA et
al., 2021).
A series of 1,4-naphthoquinones derivatives, intended as inhibitors of trypanosomatid
cysteine proteases, showed interesting activity against cruzain and rhodepsin, which play a vital
role in these parasites (SILVA et al., 2021). This fact motivated the continuation of the studies
in the evaluation of the antiparasitic activity with this series of derivatives. Thus, the objective
of this study was to evaluate the cytotoxic activity of naphthoquinone derivatives against host
cells of Leishmania spp. parasites, aiming at a screening for the selection of viable molecules
with potential leishmanicidal activity.

2. Materials and methods

2.1 Obtaining naphthoquinone derivatives

The derivatives were synthesized again by Prof. Dr. Sílvia Helena Cardoso, according
to Silva et al. (2021). Three substances derived from naphthoquinones (Table 1) were listed for
the in vitro experiments at the Laboratory of Pharmacology and Immunity (LaFI) of the Federal
University of Alagoas (Campus A. C. Simões). The derivatives were weighed and diluted in
0.1% DMSO and the solutions sterilized on a filter (0.22 μm), obtaining stock solutions at a
concentration of 10 mg/mL. These solutions were stored and refrigerated until the use of
pharmacological experiments.

93

Table 1. Chemical structure of compounds synthesized and evaluated in the study

Chemical compost

Chemical structure

JN-16

JN-17

JN-22

2.2 Biological Assays

2.2.1 J774.A1 murine macrophage culture

Macrophages of the J774.A1 strain were preserved in culture bottles in 10 ml of RPMI
medium (Roswell Park Memorial Institute-1640) supplemented with 10% FBS (Fetal Bovine
Serum – Roche), L-glutamine, pyruvate and non-essential amino acids, kept in study at 37ºC
with 95% humidity and 5% CO2. At the time of use, the cells were centrifuged for 5 minutes
at 1500 RPM at 4°C and counted in a Neubauer chamber and subsequently adjusted in RPMI
medium supplemented with FBS at a concentration of 1 x 105 cells/mL, in which they were
200 μL of this suspension was poured into a 96-well plate (Nunc, Denmark).

2.2.3 Cytotoxicity assay

Macrophages of the J774.A1 strain were previously cultured in triplicates in 96-well
plates, at a concentration of 3 x 104 cells/well and incubated in an oven at 37 ºC with a humid
atmosphere containing 5% CO2 for 24 hours, so that there was adhesion. of cells at the bottom
of the wells. Then, the wells were washed to remove non-adherent macrophages and 200 μL of
synthetic compounds previously diluted in RPMI medium at concentrations of 30, 10, 3, 1, 0.3

94

and 0.1 mg/mL were added to each well. In the control wells, cells were cultured only with
culture medium and compounds diluent (DMSO, Sigma). Cell viability was determined by the
MTT reduction assay (MOSMANN, 1983). The viability of the cells treated with the
compounds was compared to the pattern of death obtained in the control cultures.

2.2.4 Viability assay of Leishmania spp.

The promastigotes forms of L. chagasi and L. amazonensis were centrifuged and
resuspended in Schneider medium supplemented with 10% FBS, 2 mM L-glutamine and 2%
human urine, to obtain a concentration of 1x105 parasites/ml. Then, 100μL aliquots of this
suspension were distributed in a 96-well plate. The wells received treatment with synthetic
substances at different concentrations (30, 10, 1, 3, 0.3 and 0.1 mg/mL) and amphotericin b
(100 to 0.001 μM), as well as the DMSO vehicle control (0.2%) prepared in supplemented
Schneider medium, to reach a final volume of 200μL per well. The plate was then incubated in
a BOD oven at 27°C for a period of 48 hours. The number of parasites was determined using a
Neubauer chamber under an optical microscope. The inhibition caused by each substance was
expressed as a percentage in relation to the cells cultivated only in the presence of the DMSO
vehicle.

2.2.5 Determination of the selectivity index (SI)

The selectivity index is a crucial parameter in the investigation of leishmanicidal
substances, as it has accepted how much its cytotoxic effect will be selective for the parasite,
without implying the death of the host cell. The selectivity index is calculated using the ratio
between the inhibitory concentration of 50% of the growth of macrophages and parasites (DE
MUYLDER et al, 2011).

2.2.5 Statistical analysis

Data tabulation was performed using GeaphPad Prisma® software (GraphPad Software,
San Diego, CA, USA Statistical), where significance levels between experimental groups and
positive or negative controls were evaluated, using ANOVA analysis of variance, followed by

95

the Dunnett post-test. Values were considered significant when *p < 0.05, **p <0.01 and ***p
<0.001 and expressed as mean ± standard error of the mean.

3. Results

3.1 Cytotoxicity against host cells

Before evaluating the leishmanicidal potential of naphthoquinone derivatives, the
cytotoxicity of the compounds against host cells of Leishmania spp. was investigated using the
MTT colorimetric assay. For this purpose, macrophages belonging to the J774.A1 lineage were
treated with the three derivatives at the respective concentrations, 30, 10, 3, 1, 0.3 and 0.1 μg/ml
for a period of 48 hours. From this, it was possible to trace the inhibitory concentration of 50%
and the maximum effect for each compound evaluated, as shown in Table 2.

Table 2. Cytotoxicity of synthetic naphthoquinone derivatives on J774.A1 macrophages (MTT
assay).

Derivate

IC50 a

Maximum effect (%) ±
S.E.M.b

Amphotericin B

0.61 μg/mL

66.56 ± 2.42

JN16

0.34 μg/mL

54.67 ± 3.14

JN17

0.11 μg/mL

67.59 ± 5.53

JN22

>30 μg/mL

ND

The results revealed the cytotoxic effect of the standard drug amphotericin B (IC 50 =
0.61 μg/mL and Maximum effect = 66.56 ± 2.42%), respectively. Furthermore, of the three
naphthoquinone derivatives tested here, only JN-16 and JN-17 induced cytotoxic effect in host
cells with IC50 = 0.34 μg/mL and 0.11 μg/mL and maximum effect = 54.67 ± 3.14 and 67.59 ±
5.53, respectively.
The naphthoquinone derivatives were then evaluated for leishmanicidal activity against

96

the parasites L. chagasi and L. amazonensis. The parasites were seeded and treated at different
concentrations (30, 10, 3, 1, 0.3 and 0.1 μg/ml) for a period of 48 hours. Three important aspects
were analyzed in the study of the leishmanicidal activity of the compounds: the inhibitory
concentration of 50%, the potency through the maximum effect and the selectivity index, a
crucial parameter in the investigation of leishmanicidal substances that resisted how selective
their cytotoxic effect will be for the parasite, without implying the death of the host cell.
As shown in Table 3, the three compounds tested showed antiparasitic activity against
the promastigotes forms of L. chagasi, with emphasis on the derivative JN22 which, in addition
to not being cytotoxic for macrophages, showed an IC50 = 1.64 μg/mL against L chagasi, with
maximum effect = 100 ± 0.00 ***, proving to be 18 times more selective for the parasite than
for the host cell.

Table 3. Effect of naphthoquinone derivatives on the viability of L. chagasi promastigotes.

Derivate

IC50 a

Maximum effect

Selectivity index (SI)c

(%) ± S.E.M.b
Amphotericin B

0.30 µg/mL

100 ± 0.00 ***

2.03

JN16

5.69 μg/mL

82.4 ± 4.00 ***

0.05

JN17

0.18 μg/mL

96.0 ± 2.88 ***

0.61

JN22

1.64 μg/mL

100 ± 0,00 ***

>18.29

All derivatives were able to inhibit promastigotes of L. amazonensis in a statistically
significant way, with emphasis also on derivative JN22 (IC50 = 5.07 μg/mL; maximum effect =
100 ± 0.00 ***). In addition, the derivative JN22 also demonstrated selectivity higher than 5.91
against L. amazonensis, being as selective or more than amphotericin B, as shown in table 4.
The standard drug amphotericin B inhibited, at the maximum tested concentration, 100.00 ±
0.00% of the growth of Leishmania parasites of both species, presenting IC50 of 0.30 µg/mL
and 0.12 µg/mL against L. chagasi and L. amazonensis, respectively.

97

Table 4. Effect of naphthoquinone derivatives on the viability of L. amazonensis promastigotes.

Derivate

IC50 a

Maximum effect

Selectivity index (SI)c

(%) ± S.E.M. b
Amphotericin B

0.12 µg/mL

100 ± 0.00 ***

5.08

JN16

6.25 μg/mL

100 ± 0.00 ***

0.05

JN17

1.25 μg/mL

100 ± 0.00 ***

0.08

JN22

5.07 μg/mL

100 ± 0.00 ***

> 5.91

4. Discussion

The absence of new drugs for the treatment of leishmaniasis brings a huge concern in
the eradication of this parasitosis. The development of new leishmanicidal drugs that are more
effective and less cytotoxic is crucial, as it is one of the main parts of the treatment.
Naphthoquinones are part of a chemical group that has been extensively studied in the field of
medicinal chemistry due to their antitumor, anti-inflammatory and antiparasitic properties well
described in the literature. As previously described, cytotoxicity is a limiting factor for the use
of naphthoquinone derivatives, therefore, it is important to evaluate the selectivity profile of
this cytotoxicity, to establish a risk versus benefit ratio of these derivatives (ELLENDORFF et
al., 2015). Here, three 1,4-naphthoquinone derivatives were evaluated in order to establish the
cytotoxic effect against macrophage cells.
The cell viability assay using MTT consists of a colorimetric technique capable of
measuring the mitochondrial activity of viable cells. Mitochondrial activity is quantified by
spectrophotometry (550 nm) through the reduction of MTT, catalyzed by the enzyme succinate
dehydrogenase of viable cells, resulting in the formation of formazan crystals. MTT has a
yellow color and when metabolized, it becomes purple due to the formation of crystals
(MOSMANN, 1983). According to Mosmann (1983), the test detects only living cells,

98

therefore, it can be applied to measure cytotoxicity, proliferation or cell activation. The
technique has several advantages due to its shorter processing time, being able to quantify many
samples accurately, being a sensitive and reproducible test, easy to perform, in addition to
replacing other methods, such as the test that uses radioisotopes.
Previous studies have shown that the classic naphthoquinone, lapachol, induces
cytotoxicity to murine macrophages (184.65 ± 6.58 μg/mL). Alterations in the structure of
lapachol may be interesting and an alternative way to decrease the cytotoxicity of this
compound, keeping its parasitic activity preserved or even higher. When associated with the
metal, lapachol decreases its cytotoxicity, due to the increased lipophilicity of complexed
lapachol (ROCHA et al., 2013). In rat skeletal myoblasts, lapachol also induced a cytotoxic
effect (IC50 = 26.57 μM) (ELLENORFF et al., 2015).
Our results showed that the derivates JN16 and JN17 presented cytotoxicity similar
when compared to amphotericin B, while JN22 was not cytotoxic to the host cell

. Derivatives

JN16 and JN17 are structurally correlated, containing nitrogenous substituents at position 2 and
due to this structural similarity, both showed cytotoxic effects on macrophages. However, there
is a 1-phenylethylamino group in the JN16 derivative, structurally differing from the JN17
derivative, which has a methoxy group in place of the aniline ring, which also confers
significant cytotoxicity. Although the JN22 derivative also has a nitrogen substituent, it differs
from the others due to the position of the substituent, in this case the nitrogen is in position 1,
conferring the absence of cytotoxicity to this molecule.
The toxicity of naphthoquinones can be quite variable depending on the radicals
available in the molecules of their derivatives (DE SENA PEREIRA et al., 2016). Kishore et
al. (2014) tested seven naphthoquinone compounds, of which two were less toxic (188.7 and
54 μM), while the other five compounds were more toxic (18.4 μM). The cytotoxicity of
naphthoquinones can be explained by the cellular nucleophilic reaction, due to the electrophilic
nature of this chemical class, or by the formation of semiquinones that auto-oxidize the quinone,
producing reactive oxygen species, which end up generating a highly oxidative environment.
KUMAGAI et al., 2012; EHRHARDT et al., 2013).
Naphthoquinones and their derivatives are promising in the study of new antiparasitic
drugs, as there are several studies in the literature showing the inhibitory capacity of these
compounds against parasites such as

Plasmodium falciparum,

Trypanosoma cruzi and

Leishmania spp. (PINTO et al., 2014). Due to these pharmacological activities, the popular use

99

of naphthoquinones is quite usual. The mechanism by which naphthoquinones exert such
activities seems to be related to their ability to inhibit electron transporters, uncouplers of
oxidative phosphorylation, intercalating agents in the double helix, acting as alkylating agents,
bioreducers of biomolecules and producers of reactive oxygen species (BABULA et al., 2009).
For example, a series of 27 2-N,N'-dialkylamino-1,4-naphthoquinone compounds were
active against L. chagasi parasites (DE ARAÚJO et al., 2017). Two naphthoquinones were able
to inhibit the growth of L. donovani in both promastigotes and amastigotes, with IC50 = 5.4 ±
2.4 and 7.04 ± 0.15 µM, respectively, with associated high production of nitric oxide
(LEZAMA-DÁVILA et al., 2012). One study evaluated the leishmanicidal use of a new
naphthoquinone derivative, Flau-A [2-(2,3,4-tri-O-acetyl-6-deoxy-β-L-galactopyranosyloxy)1,4-naphthoquinone], against forms promastigotes and amastigotes of L. amazonensis and L.
chagasi. The authors observed that the compound was active for both species through
mechanisms that involved loss of mitochondrial membrane potential, as well as increased
production of reactive oxygen species, cell shrinkage, and alteration of plasma membrane
integrity (MENDONÇA, et al., 2018).
The 1,4-naphthoquinone derivatives that were analyzed here were intended as
trypanosomatid cysteine protease inhibitors. Cysteine protease is an enzyme that plays a crucial
role in parasite survival, as it interferes with parasite virulence, maintenance of parasite viability
and morphology, invasion of the host's mononuclear phagocytic system, and modulation of the
immune response (SUNDAR; SINGH, 2018; SILVA et al., 2021). Other naphthoquinone
derivatives were synthesized and also indicated as potent cysteine protease inhibitors, inhibiting
rhosaine, an essential protease of a human pathogenic parasite, with subnanomolar affinity
(KLEIN et al., 2020).
The three derivatives tested here showed activity against the promastigotes forms of
both L. chagasi and L. amazonensis, with emphasis on the derivative JN22 which proved to be
the most potent of the evaluated compounds, with superior selectivity to the standard drug and
without showing cytotoxic effect to macrophages. These features support ongoing research into
the leishmanicidal activity of this series of 1,4-naphotquinone derivatives.

5. Conclusions

The results presented here from the cytotoxicity assay provide important information

100

for the screening of molecules with the potential to become leishmanicidal drugs. Treatment
with the 1,4-naphthoquinone derivatives tested here showed potent leishmanicidal activity
against L. chagasi and L. amazonensis parasites. With emphasis on the compound JN22, which
in addition to being active against both species, with selectivity equal to or greater than
amphotericin B and without cytotoxicity to the host cell. These data show the derivatives as
promising substances for the design of new prototypes of antileishmania drugs.

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103

6 CONCLUSÕES

● O estudo da literatura, por meio da prospecção tecnológica indicou os avanços obtidos
nos últimos 10 anos no campo de diagnóstico imunológico da leishmaniose cutânea,
evidenciando o Brasil como o país predominante no depósito de patentes. A produção
de kits de imunodiagnóstico utilizando novos peptídeos ou novas proteínas isoladas dos
parasitos foi o método mais comumente observado nas patentes, utilizando técnicas
sorológicas já conhecidas, como ELISA e citometria de fluxo. As patentes avaliadas
trazem dados preliminares e teve seu número de depósitos diminuído nos últimos três
anos, em função da pandemia causada pelo coronavírus. Isso fortalece ainda mais a
necessidade de desenvolver um método imunodiagnóstico inovador para a leishmaniose
cutânea.
● O estudo acerca do desenvolvimento de um novo método imunodiagnóstico usando
técnicas acustofluídicas demonstrou a capacidade de aprisionamento de antígenos de L.
amazonenses no dispositivo acustofluídico, de forma rápida, fácil e utilizando um baixo
volume de amostra. O padrão de imagem entre amostras negativas e positivas é muito
semelhante e revela uma limitação que a técnica possui em fazer esta diferenciação, já
que o dipositivo aglomerou os antígenos em todas as amostras.
● Com relação à avaliação farmacológica da série de derivado de 1,4-naftoquinona, os
resultados aqui demonstrados indicaram que o tratamento com os derivados mostrou
potente atividade leishmanicida contra os parasitos de L. chagasi e L. amazonensis. Com
destaque para o composto JN22, que além de ser ativo contra ambas as espécies, com
seletividade equivalente ou superior à anfotericina B, sem apresentar citotoxicidade para
a célula hospedeira.

104

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