Dissertação Eder.pdf
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS
FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS
ÉDER DA SILVA ROCHA SANTOS
Avaliação da atividade leishmanicida de extratos de microrganismos
isolados do bioma Caatinga
Maceió
2023
ÉDER DA SILVA ROCHA SANTOS
Avaliação da atividade leishmanicida de extratos de microrganismos isolados do bioma
Caatinga
Dissertação de Mestrado apresentado ao Programa de
Pós-graduação em Ciências Médicas da Universidade
Federal de Alagoas - UFAL, como parte das exigências
para a obtenção do título de Mestre em Ciências Médicas.
Maceió
2023
Catalogação na Fonte
Universidade Federal de Alagoas
Biblioteca Central
Divisão de Tratamento Técnico
Bibliotecário: Marcelino de Carvalho Freitas Neto – CRB-4 – 1767
S237a
Santos, Éder da Silva Rocha
Avaliação da atividade leishmanicida de extratos de microrganismos isolados
do bioma Caatinga / Éder da Silva Rocha Santos. – 2023.
88 f. : il.
Orientadora: Aline Cavalcanti de Queiroz.
Co-orientador: Alysson Wagner Fernandes Duarte.
Co-orientadora: Magna Suzana Alexandre Moreira.
Dissertação (Mestrado em Ciências Médicas) – Universidade Federal de
Alagoas. Faculdade de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Ciências
Médicas. Maceió, 2023.
Inclui produto educacional.
Bibliografia: f. 74-88.
1. Caatinga. 2. Extratos microbianos. 3. Atividade leishmanicida. I. Título.
CDU: 616.993.161
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, porque dEle, por Ele e para Ele são todas as coisas.
Agradeço a minha família, meu pai, irmãos, cunhada, sobrinho e especialmente minha mãe, a
quem eu dedico esse trabalho e porque ela é meu maior exemplo, sobretudo de perseverança.
Agradeço a minha orientadora, Profa. Dra. Aline Cavalcanti de Queiroz, pelo acolhimento, pela
paciência e por todos os ensinamentos passados, serei eternamente grato!
Agradeço aos meus coorientadores, Prof. Dr. Alysson Wagner Fernandes Duarte e Profa. Dra.
Magna Suzana Alexandre Moreira, sem suas contribuições não teria condições de finalizar este
trabalho.
Agradeço a todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da
UFAL, por todos os ensinamentos, em especial agradeço a Profa. Dra. Michelle Jacintha
Cavalcante de Oliveira, que foi a primeira a me acolher e indicar a minha orientadora.
Agradeço aos componentes das bancas de qualificação e defesa, Profa. Dra. Michelle Jacintha
Cavalcante de Oliveira, Dra. Amanda Evelyn da Silva e Profa. Dra. Flaviana Santos Wanderley,
por terem aceitado o convite e pelas contribuições para o melhoramento desta dissertação.
Agradeço aos meus companheiros amigos do Laboratório de Farmacologia e Imunidade (ICBS
– UFAL), Anderson, Flávio, Suellen, Letícia, Joyce, Hilda, Shakira, Karoline, Thiago, Diogo,
Ana Rachel, Cibelle, e especialmente, Amanda, Márcio, Lilyana, Fábio e Kaycke. E aos IC’s:
Mayná, Hamilka, Vinícius e Kamile. Vocês foram essenciais durante essa etapa da minha vida.
Agradeço aos companheiros do Laboratório de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia
(Campus Arapiraca): Kely, Nicolle, Emanuelly e Kaline, pelo acolhimento e auxílio.
Agradeço aos meus companheiros amigos da UNCISAL, por todo o apoio e compreensão,
Karina, Raphael, Alessandro, Denise, Paulo Henrique, Ewerton, Pedro e Wendell.
A todos, meu eterno agradecimento.
“Estou entre aqueles que acham que a ciência tem uma grande beleza”.
Marie Curie
RESUMO
As leishmanioses são um complexo de doenças parasitárias, negligenciadas, endêmicas em
diversos países e possuem um amplo espectro clínico. Afetam principalmente populações
menos favorecidas, causando graves problemas de saúde pública. O arsenal terapêutico é
limitado e apresenta uma série de fatores adversos, como elevada toxicidade, eficácia variável
e longos regimes de tratamento, o que torna imprescindível o desenvolvimento de novos
fármacos leishmanicidas. Para tanto, a bioprospecção de microrganismos de ambientes
extremos pode se configurar como uma excelente estratégia no desenvolvimento de novos
fármacos antiparasitários. Diante disso, o objetivo desse trabalho foi avaliar a atividade
leishmanicida de extratos microbianos de isolados do bioma Caatinga. Inicialmente, os extratos
de microrganismos da Caatinga foram produzidos a partir da extração de metabólitos
microbianos. Assim, foram preparados extratos das bactérias codificadas como 12UVLBC8,
2UVLLC4 (MetOH), 2UVLLC4 (ActOEt), 13UVLBC8, 2UVLBC5 e 13UVLBC3, e de fungos
filamentosos com os códigos 2LCL1, 4LCEM2 e 4UVLFC2. Os extratos pigmentados
bacterianos não apresentaram efeito citotóxico quando testados em macrófagos da linhagem
J774.A1 no ensaio de MTT. Com relação aos extratos pigmentados fúngicos, os três
apresentaram toxicidade, com CI50 abaixo de 50 µg/mL e efeito citotóxico máximo superior a
70%. As análises estatísticas foram realizadas no programa GraphPad Prism. Além disso, o
extrato bacteriano 13UVLBC3 apresentou atividade leishmanicida in vitro contra as formas
promastigotas de L. (L.) amazonensis e L. (L.) chagasi, com efeito máximo de 100% e CI50 8,80
µg/mL e 81,46% e CI50 12,07 µg/mL, respectivamente. Todos os extratos pigmentados fúngicos
apresentaram atividade leishmanicida, contra as formas promastigotas das duas espécies de
Leishmania testadas, foi observada atividade contra L. (L.) amazonensis para 2LCL1 (efeito
máximo de 100% e CI50 de 3,13 µg/mL), 4LCEM2 (efeito máximo de 100% e CI50 de 1,06
µg/mL e 4UVLFC2 (efeito máximo de 100% e CI50 de 6,09 µg/mL) e atividade leishmanicida
contra L. (L.) chagasi para 2LCL1 (efeito máximo de 100% e CI50 de 13,55 µg/mL), 4LCEM2
(efeito máximo de 100% e CI50 de 9,65 µg/mL) e 4UVLFC2 (efeito máximo de 100% e CI50
de 10,24 µg/mL). Também foram conduzidos testes de espectrofotometria de varredura nos
extratos que apresentaram atividade leishmanicida, todos eles apresentaram picos de
absorbâncias típicos de carotenoides. Os extratos pigmentados de microrganismo da Caatinga
mostraram que podem possuir compostos bioativos promissores quanto a atividade
leishmanicida, no entanto, outros testes como avaliar a atividade anti-amastigotas e a
caracterização química precisam ser realizados.
Palavras-chave: Caatinga. Extratos microbianos. Atividade leishmanicida.
ABSTRACT
Leishmaniases are a complex of neglected parasitic diseases, endemic in several countries and
have a wide clinical spectrum. The therapeutic arsenal is limited and presents a series of adverse
factors, such as high toxicity, variable efficacy, and long treatment regimens, which makes the
development of new leishmanicidal drugs essential. Therefore, the bioprospecting of
microorganisms from extreme environments can be configured as an excellent strategy in the
development of new antiparasitic drugs. Therefore, the objective of this work was to evaluate
the leishmanicidal activity of microbial extracts of isolates from the Caatinga biome. Initially,
extracts of microorganisms from the Caatinga were produced from the extraction of microbial
metabolites. Thus, extracts of bacteria encoded as 12UVLLC8, 2UVLLC4 (MetOH),
2UVLLC4 (ActOEt), 13UVLBC8, 2UVLBC5 and 13UVLBC3, and filamentous fungi with
codes 2LCL1, 4LCEM2 and 4UVLFC2 were prepared. The pigmented bacterial extracts did
not show a cytotoxic effect when tested on macrophages of the J774.A1 lineage in the MTT
assay. With regard to pigmented fungal extracts, all three showed toxicity, with an IC50 below
50 µg/mL and a maximum cytotoxic effect greater than 70%. Statistical analyzes were
performed using the GraphPad Prism program. In addition, the bacterial extract 13UVLBC3
showed in vitro leishmanicidal activity against the promastigotes forms of L. (L.) amazonensis
and L. (L.) chagasi, with a maximum effect of 100% and IC50 8.80 µg/mL and 81.46% and IC50
12.07 µg/ml, respectively. All pigmented fungal extracts showed leishmanicidal activity against
the promastigotes of the two Leishmania species tested, activity was observed against L. (L.)
amazonensis for 2LCL1 (maximum effect of 100% and IC50 of 3.13 µg/mL), 4LCEM2
(maximal effect of 100% and IC50 of 1.06 µg/mL and 4UVLFC2 (maximal effect of 100% and
IC50 of 6.09 µg/mL) and leishmanicidal activity against L. (L.) chagasi for 2LCL1 (maximal
effect of 100% and IC50 of 13.55 µg/mL), 4LCEM2 (maximum effect of 100% and IC50 of 9.65
µg/mL) and 4UVLFC2 (maximum effect of 100% and IC50 of 10.24 µg/mL). Scanning
spectrophotometry tests were also conducted on the extracts that showed leishmanicidal
activity, all of which showed absorbance peaks typical of carotenoids. The pigmented extracts
of microorganisms from the Caatinga showed that they may have promising bioactive
compounds in terms of leishmanicidal activity, however, other tests such as evaluating the antiamastigote activity and chemical characterization need to be performed.
Keywords: Caatinga. Microbial extracts. Leishmanicidal activity.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Lutzomyia longipalpis ......................................................................................... 17
Figura 2. Formas evolutivas do gênero Leishmania ........................................................... 18
Figura 3. Ciclo de vida do gênero Leishmania .................................................................... 19
Figura 4. Resposta imune contra leishmaniose ................................................................... 21
Figura 5. Evolução clínica da leishmaniose visceral ........................................................... 24
Figura 6. Classificação clínica da leishmaniose cutânea .................................................... 25
Figura 7. Classificação clínica da leishmaniose mucosa .................................................... 26
Figura 8. Casos de notificação de LTA nas Américas (2001 – 2020) .................................. 28
Figura 9. Casos de LTA por Unidade da Federação (UF) de infecção ................................. 28
Figura 10. Casos de notificação de LV nas Américas (2001 - 2020) ................................. 29
Figura 11. Casos de LV por UF de infecção no Brasil .....................................................
30
Figura 12. Fármacos de primeira e segunda linha utilizados no tratamento das
leishmanioses ...................................................................................................................... 33
Figura 13. Mapa correspondente ao bioma Caatinga ......................................................... 35
Figura 14. Rocha colonizada por liquens na Caatinga ......................................................... 37
Figura 15. Coleta de liquens no município de Santa do Ipanema/AL .................................. 40
Figura 16. Aspecto do cultivo bacteriano em caldo nutriente após incubação por 7 dias, a
25ºC e 120 rpm .................................................................................................................... 42
Figura 17. Pigmentos oriundos da biomassa bacteriana em soluções extrativas (A), após
a secagem em dessecador de vidro (B) e solubilizado em DMSO (C)...............................
43
LISTA DE TABELAS
Tabela 1– Identificação de liquens de isolados bacterianos ............................................... 41
Tabela 2 – Identificação de liquens de isolados fúngicos e identificação taxonômica ....... 41
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
APCs
Células Apresentadoras de Antígenos
CR
Receptor do Complemento
DCs
Células Dendríticas
DMSO
Dimetilsulfóxido
DNA
Ácido Desoxirribonucleico
gp63
Glicoproteína 63
IFN-β
Interferon-Beta
IFN-γ
Interferon-gama
IL
Interleucina
iNOS
Óxido Nítrico Sintase Indizível
LC
Leishmaniose Cutânea
LM
Leishmaniose Mucocutânea
LPG
Lipofosfoglicanos
LTA
Leishmaniose Tegumentar Americana
LV
Leishmaniose Visceral
MTT
3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina
NET
Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos
NK
Célula Natural Killer
NO
Óxido Nítrico
OMS
Organização Mundial de Saúde
OPAS
Organização Pan-Americana de Saúde
PI3K/AKT
Via do fosfatidilinositol-3-quinase / Proteína Quinase B
RNS
Espécies Reativas de Nitrogênio
ROS
Espécies Reativas de Oxigênio
RPMI
Roswell Park Memorial Institute Medium
SFB
Soro Fetal Bovino
SFM
Sistema Fagocítico Mononuclear
TGF-β
Fator de Crescimento Transformador-Beta
TNF
Fator de Necrose Tumoral
TNF-α
Fator de Crescimento Tumoral-Alfa
MeOH
Metanol
ActOEt
Acetato de Etila
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ...............................................................................................................
14
2 OBJETIVOS ....................................................................................................................
16
2.1 Objetivo Geral ............................................................................................................... 16
2.2 Objetivos Específicos ...................................................................................................
16
3 REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................................ 17
3.1 Características Gerais das Leishmanioses ....................................................................
17
3.1.1 Ciclo de Vida das Leishmanioses ..............................................................................
17
3.1.2 Imunopatogenia das Leishmanioses ..........................................................................
19
3.2 Formas Clínicas das Leishmanioses .............................................................................
23
3.2.1 Leishmaniose Visceral ............................................................................................... 23
3.2.2 Leishmaniose Tegumentar Americana ......................................................................
25
3.2.3 Epidemiologia das Leishmanioses ............................................................................. 27
3.2.4 Tratamento das Leishmanioses .................................................................................. 30
3.3 Biodiversidade e Bioprospecção de microrganismos isolados da Caatinga e seu
Potencial Biotecnológico ....................................................................................................
33
3.4 Liquens como micro-habitat de microrganismos da Caatinga ...................................... 35
3.5 Pigmentos extracelulares produzidos por microrganismos e suas aplicações na
indústria farmacêutica ......................................................................................................... 37
4 METODOLOGIA ............................................................................................................ 39
4.1 Obtenção dos produtos naturais oriundos de microrganismos isolados da Caatinga ...
39
4.1.2 Microrganismos Isolados da Caatinga ....................................................................... 39
4.1.3 Cultivo, reativação e produção da biomassa microbiana ........................................... 41
4.1.4 Extração de pigmentos intracelulares bacterianos .....................................................
42
4.1.5 Obtenção dos extratos de fungos filamentosos .......................................................... 44
4.2 Ensaios Farmacológicos ...............................................................................................
44
4.2.1 Manutenção da linhagem de macrófagos ................................................................... 44
4.2.2 Determinação da viabilidade celular .......................................................................... 45
4.2.3 Ensaio da viabilidade em promastigotas..................................................................... 45
4.2.4 Espectrofotometria de varredura................................................................................
46
4.2.5 Análise estatística ......................................................................................................
46
5 PRODUTOS ....................................................................................................................
47
5.1 Artigo 1: Potencial leishmanicida de extratos pigmentados de microrganismos do
bioma Caatinga ..................................................................................................................
47
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS .........................................................................................
73
7 LIMITAÇÕES E PERSPECTIVAS ...............................................................................
74
REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 75
14
1 INTRODUÇÃO
As Leishmanioses são antropozoonoses provocadas pelos protozoários do gênero
Leishmania, e afetam pessoas e animais domésticos e selvagens em todo o mundo. As principais
formas da doença são: leishmaniose visceral (LV), leishmaniose cutânea (LC) e leishmaniose
mucocutânea (LM) (AKHOUNDI et al., 2016; RIFFEL; DE OLIVEIRA VAZ, 2018; WHO,
2017).
A Leishmania é um protozoário pertencente à família Trypanosomatidae, parasito
intracelular obrigatório das células do sistema fagocítico mononuclear, com duas formas
principais: a promastigota, encontrada no tubo digestivo do inseto vetor, e a amastigota,
observada nos tecidos dos hospedeiros vertebrados (NEVES, 2016; BRASIL, 2017).
A doença tem sido associada a regiões tropicais e subtropicais e é transmitida
principalmente aos humanos pela picada de flebotomíneos fêmeas do Velho Mundo e por
Lutzomyia spp. no Novo Mundo (WHO, 2016; MITRA, et al. 2017). Devido à associação das
leishmanioses a condições de desnutrição, comprometimento imunológico, condições de
moradia ruins, migração e aos países pobres e em desenvolvimento da África, da América
Latina e da Ásia, são consideradas doenças negligenciadas (WHO, 2017). Está também
associada às mudanças ambientais decorrentes do desmatamento, da construção de barragens,
de esquemas de irrigação e da urbanização (WHO, 2017).
No Brasil, as leishmanioses possuem diversos agentes etiológicos, reservatórios e
vetores, os quais, por sua vez, apresentam características particulares de transmissão,
dificultando o controle da disseminação da doença no território brasileiro (BRASIL, 2017).
Trata-se, portanto, de um grave problema de saúde pública, pois causa uma série de doenças,
desde infecções auto curativas até doenças crônicas desfigurantes (SCOTT et al, 2016).
Esse grupo heterogêneo de doenças ocorre atualmente em mais de 100 países ao redor
do mundo e aproximadamente 350 milhões de pessoas estão em risco de infecção. Além disso,
uma estimativa de 20.000 -- 50.000 mortes ocorrem anualmente, a OMS estima que ocorram
de 700 mil a 1 milhão de novos casos por ano em todo o globo (WHO, 2017; OPAS, 2019).
Até este momento não há vacina para as leishmanioses; além disso, o arsenal terapêutico
disponível para o tratamento é limitado, devido a uma série de fatores, como, eficácia variável,
resistência adquirida pelo parasito, toxicidade, longos cursos de tratamento e efeitos colaterais
graves; sendo assim, torna-se condição imprescindível a pesquisa e desenvolvimento de novos
15
fármacos leishmanicidas eficazes (ARONSON et al., 2016; CHARLTON et al., 2018; DNDI,
2019).
Para a saúde pública, a importância de um medicamento novo está no valor terapêutico
e no benefício que produz para o paciente e para a sociedade em termos de melhoria da
qualidade e anos de vida salvos. O valor terapêutico deve ser analisado em dimensão ampla que
ultrapassa a inovação química, fundamentado em uma visão ampliada de benefício clínico
(WARD et. al., 2014).
Diante da busca por novas terapias leishmanicidas, o bioma Caatinga, que é o principal
ecossistema da Região Nordeste e ocupa cerca de 10% do território nacional, apresenta
características peculiares devido ao seu clima quente e seco, típico do semiárido, e possui uma
riqueza biológica de valor inestimável. A Caatinga conta com um imenso potencial para a
conservação de serviços ambientais, uso sustentável e bioprospecção que, se bem explorado,
poderá ser decisivo para o desenvolvimento da região e do país (BRASIL, 2022).
A Caatinga é um bioma ainda pouco explorado, nesse sentido, uma estratégia para se
buscar compostos ainda desconhecidos é isolar microrganismos a partir destes ambientes
(MENDES, 2010). Assim, microrganismos isolados da Caatinga, possuem potencial
biotecnológico para o desenvolvimento de novos candidatos a fármacos leishmanicidas,
gerando grandes benefícios para a sociedade e contribuindo com o desenvolvimento da
inovação tecnológica (COSTA et al., 2014; AGEITEC, 2016).
Ante o exposto, o presente estudo visou investigar a atividade leishmanicida de extratos
de microrganismos isolados da Caatinga fornecidos pelo Laboratório de Microbiologia,
Imunologia e Parasitologia (LABMIP) do Complexo de Enfermagem e Medicina da
Universidade Federal de Alagoas – Campus Arapiraca, tendo em vista o potencial
biotecnológico e farmacológico desses produtos.
16
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
▪ Investigar a atividade de candidatos a fármacos leishmanicidas à base de extratos de
microrganismos isolados do bioma Caatinga, que constituam opções terapêuticas mais
seguras e eficazes para o tratamento da leishmaniose.
2.2 Objetivos específicos
▪ Cultivar microrganismos isolados de líquens do bioma Caatinga;
▪ Produzir extratos pigmentados a partir da biomassa dos microrganismos cultivados;
▪ Determinar a citotoxicidade dos produtos naturais para a célula hospedeira (macrófagos
J774.A1);
▪ Verificar a ação dos extratos sobre formas promastigotas de L. (L) amazonensis e L. (L)
chagasi;
▪ Determinar a seletividade entre a citotoxicidade do extrato para o macrófago e sua atividade
leishmanicida;
▪ Investigar o perfil do espectro de infravermelho dos extratos mais ativos.
17
3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 Características gerais da Leishmania
3.1.1 Ciclo de Vida da Leishmania
As leishmanioses constituem importante problema de saúde pública, devido ao seu
elevado número de casos registrados anualmente, ampla distribuição geográfica e a
complexidade para o seu controle, que é inerente aos ciclos de transmissão que envolvem
diversas espécies de vetores, agentes etiológicos e reservatórios (BRASIL, 2015). A doença
tem caráter antropozoonótico, sendo causada por protozoários pertencentes a ordem
Kinetoplastida, da família Trypanosomatidae, gênero Leishmania, subgêneros Leishmania e
Viannia, e transmitidas por pequenos dípteros da subfamília Phlebotominae, conhecidos
popularmente como mosquito palha, birigui, tatuquira, asa branca, caravela, entre outros
(Figura 1) (GALVIS-OVALLOS, 2020).
Figura 1. Lutzomyia longipalpis
Fonte: Adaptado de VALENÇA, 2015.
Os agentes etiológicos das leishmanioses são protozoários tripanosomatídeos,
caracterizados por serem parasitos intracelulares obrigatórios das células do sistema fagocítico
mononuclear (SFM), com uma forma promastigota (Figura 2-A), encontrada no tubo digestivo
do inseto vetor e outra amastigota (Figura 2-B) nos tecidos dos vertebrados (WHEELER;
GLUENZ; GULL, 2011; SUNTER; GULL, 2017).
18
Figura 2. Formas evolutivas da Leishmania. (A) Promastigota; (B) Amastigota.
(A)
(B)
Fonte: Adaptado de ALEXANDRE, 2020; MALFITANO, 2021.
Os vetores responsáveis pela transmissão da leishmaniose em humanos são dípteros
(insetos) nematóceros de diferentes espécies dos gêneros Lutzomyia (Novo Mundo) e
Phlebotomus (Velho Mundo) que pertencem à família Psychodidae, subfamília Phlebotominae
(SADLOVA et al., 2013; AKHOUNDI et al., 2016).
Durante o repasto sanguíneo, em reservatórios infectados, as fêmeas dos flebotomíneos
adquirem as formas amastigotas do protozoário, que rapidamente se transformam em formas
promastigotas no tubo digestivo dos vetores. Estas invadem as porções anteriores do estômago
e do proventrículo do mosquito, dividem-se ativamente e se desenvolvem em formas
promastigotas metacíclicas (formas finas e curtas medindo 6-10mm), que são as formas
infectantes do parasito e que interagem com as células do SFM. As formas promastigotas que
foram inoculadas através da picada, após um período de quatro a oito horas, são interiorizadas
por células fagocíticas do hospedeiro, diferenciando-se novamente em formas amastigotas no
fagolisossomo, se proliferam por divisão binária e passam a se multiplicar no interior das
células, podendo invadir outros macrófagos bem como outras células fagocíticas (células
dendríticas) ou não fagocíticas (fibroblastos). Após romperem os macrófagos, as amastigotas
podem ser novamente ingeridas pelo vetor, completando o ciclo (Figura 3) (PIMENTA et al.,
2018; CDC, 2020; BOCKSTAL, et al, 2020; VALERO e URIARTE, 2020).
19
Figura 3. Ciclo de vida do gênero Leishmania.
Fonte: Adaptado de AVERY, 2017.
3.1.2 Imunopatogenia da leishmaniose
A partir da inoculação das formas promastigotas na pele, inicia-se uma complexa
interação entre o parasito e a resposta imunológica do hospedeiro, o que determinará a
expressão e a evolução clínica será o tipo e o grau de intensidade dessa resposta imunológica
(SCOTT; NOVAIS, 2016). A presença das formas promastigotas desencadeia, no local da
inoculação, uma resposta inflamatória aguda inespecífica da qual participam células e fatores
séricos –células natural killer (NK), polimorfonucleares (neutrófilos, macrófagos e eosinófilos)
e sistema complemento. Assim, a maioria de promastigotas inoculadas, que ainda estão no
ambiente extracelular, são rapidamente destruídas; no entanto, o parasito inicia imediatamente
sua batalha pela sobrevivência contra as defesas do hospedeiro por meio de sua interação com
os componentes inatos do sistema imunológico (SCOTT; NOVAIS, 2016; TIBÚRCIO et al.,
2019).
As células fagocíticas primárias no local da picada são os neutrófilos e os macrófagos.
Os parasitos são captados pelos neutrófilos, que são, por sua vez, fagocitados pelos macrófagos
20
(REGLI et al., 2017). Os neutrófilos, que são as células leucocitárias mais abundantes no
sangue, constituem a defesa celular inicial contra o parasito e modulam as respostas imunes
subsequentes por meio de interações cruzadas com outras células através da secreção de
moduladores imunes (RIBEIRO-GOMES; SACKS, 2012; BARHOUMI et al., 2019).
Os neutrófilos são dotados de mecanismos poderosos para enfrentar micróbios
invasivos, incluindo fagocitose e degranulação, liberando moléculas com propriedades
antimicrobianas e ajudando no combate às infecções (KOLACZKOWSKA, 2013). Todavia,
algumas espécies de Leishmania desenvolveram mecanismos para resistir aos neutrófilos, como
interferir no processo de fusão dos grânulos com o fagossomo contendo os parasitos,
transformando os neutrófilos em hospedeiros temporários, favorecendo a progressão da
infecção. No entanto, Guimarães-Costa et al (2009), demonstraram que a Leishmania induz a
liberação de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos (NET) por neutrófilos humanos e que o
parasito é suscetível às histonas associadas a essas fibras.
Tanto a imunidade inata quanto a adaptativa desempenham papéis críticos na defesa
contra a Leishmania (DOS-SANTOS, 2016). Mas, para sobreviver ao mecanismo de defesa ou
imunidade inata, o parasito utiliza vias complexas, incluindo fagocitose por células
inflamatórias e ativação do sistema complemento. Macrófagos e neutrófilos são considerados
as células primárias que reagem à infecção por Leishmania, mas várias outras células imunes,
como monócitos, células dendríticas (DCs), células natural killer (NK) e células T CD4+ e
CD8+ , além de moléculas efetoras, como citocinas como interferon (IFN)-γ e interleucina (IL)12 e óxido nítrico (NO) produzidos pela NO sintase induzível (iNOS), também desempenham
papéis distintos na resposta do hospedeiro (FALEIRO et al., 2014; ROMANO et al., 2017;
BEHNEN, et al., 2014). A célula NK também é extremamente importante no controle da
infecção, isso deve-se tanto à sua ação citotóxica quanto ao fato de ser fonte primária de
interferon-gama (IFN-γ), o que determina um potencial para desenvolver resposta imune celular
adequada, induzindo a resistência já na primeira semana de infecção (NOVAIS, 2016).
O sistema complemento auxilia no combate a infecções reconhecendo patógenos
extracelulares. Essas proteínas se ativam durante cascatas de reações proteolíticas que levam à
lise celular (DUNKELBERGER; SONG, 2010; MURPHY, 2014; RICKLIN et al., 2010). Na
infecção por Leishmania, a cascata do complemento é ativada diretamente após a penetração
do promastigota na derme e reação com o soro, o que, por sua vez, leva à morte eficiente de
mais de 90% dos parasitos inoculados (DOMINGUEZ et al., 2002; DOMINGUEZ et al., 2003;
VON STEBUT, 2007; MAURER et al., 2009). Contudo, durante a infecção por Leishmania, o
sistema complemento realiza a opsonização de parasitos por seus fragmentos (iC3b e C3b),
21
assim, uma vez que a Leishmania pode usar C3b depositado para facilitar a entrada do parasito
em macrófagos e neutrófilos através do receptor do complemento (CR)2 (NYLEN; GAUTAM,
2010), o que contribui para progressão da infecção, pois a fagocitose do parasito através dos
receptores CR1 e CR3, parecem ser ineficientes em desencadear a explosão oxidativa
(ATAYDE et al., 2016; FRANCO; BEVERLEY; ZAMBONI, 2012; LAUTHIER;
KORENAGA, 2018).
A resposta imune à Leishmania depende principalmente de uma resposta imune do tipo
Th1 que é caracterizada pela produção inicial de interleucina-12(IL-12) pelas células
apresentadoras de antígenos (APCs), que são importantes para a determinação do desfecho
clínico da doença. A IL-12 ativa as células Th1 secretoras de IFN-γ. Este efeito resulta na
ativação dos mecanismos microbicidas do macrófago, particularmente a geração de NO e
espécies reativas de oxigênio (ROS) (WHO, 2020). Essas citocinas T helper-1 (Th1) são
relatadas como neutralizadas por fatores imunossupressores, como IL-10 (SCOTT; NOVAIS,
2016; JAWED; DUTTA; MAJUMDAR, 2019). Figura 4.
Figura 4. Resposta imune contra as leishmanioses.
Fonte: Adaptado de ELMAHALLAWY, 2021.
22
Os macrófagos são as principais células hospedeiras da Leishmania. Nessas células os
parasitos conseguem não somente sobreviver, mas também multiplicar-se. Assim, os
macrófagos são essenciais para que a Leishmania spp. estabeleça uma infecção bem-sucedida
(FALEIRO et al., 2014; ROMANO et al., 2017). Representam também as principais células
efetoras que fagocitam o parasito e eliminam a infecção, se ativadas adequadamente. Seu efeito
fagocitário geralmente é iniciado após sua ativação por DCs e a deposição de superfície do
complemento (UENO et al., 2009). Vale ressaltar que existem dois fenótipos de macrófagos:
M1 que é subtipo pró-inflamatório com propriedades microbicidas e mediada pelos produtos
das células Th1 e NK, e M2 que está associado à reparação tecidual e resolução da inflamação
e é mediada por citocinas Th2. (ELMAHALLAWY et al., 2021).
A via clássica, que impulsiona a ativação de macrófagos M1, envolve principalmente
IFN-γ, que estimula os macrófagos a produzirem espécies ROS e espécies reativas de nitrogênio
(RNS). Um exemplo de formação de ROS é a reação catalisada pela enzima sintetase de óxido
nítrico induzida (iNOS) através da L-arginina, que resulta na geração de NO. Portanto, a iNOS
desempenha um papel importante na morte do parasito (LIEW et al., 1990; ELMAHALLAWY
et al., 2021). No entanto, o parasito desenvolve alguns mecanismos de proteção, como o fato
do glicolipídio lipofosfoglicanos (LPG) proteger a metaloprotease de Leishmania e a
glicoproteína gp63 interferir nas vias de sinalização dos macrófagos superando o efeito
microbicida do hospedeiro (OLIVIER et al., 2012; ROSSI; FASEL, 2018; ROSAZZA et al.,
2020). Outras citocinas inflamatórias, como IL-1, fator de necrose tumoral (TNF), IFN-α e IFNβ também estão envolvidas na ativação de macrófagos M1 e na regulação positiva da expressão
de iNOS, levando à produção de NO (BRONTE; ZANOVELLO, 2005).
Por outro lado, a ativação de macrófagos M2 que ocorre por citocinas do tipo Th2, como
IL-4 e IL-13 (GORDON, 2003), pode levar à biossíntese de poliamina induzida por IL-4, que
favorece a sobrevivência do parasito em macrófagos via regulação positiva da arginase
(KROPF et al., 2005; PESSENDA; SILVA, 2020). A arginase codificada pela Leishmania
aumenta a progressão da doença aumentando as atividades de arginase da célula hospedeira,
promovendo a proliferação do parasito dentro dos macrófagos infectados através da produção
de poliaminas essenciais para o desenvolvimento do parasito. A infecção de macrófagos por
Leishmania também aumenta a produção de citocinas imunorreguladoras, como IL-10 e TGFβ, que desativam as funções microbicidas dos macrófagos (VON DER WEID et al., 1996;
KANE, MOSSER, 2000; PESSENDA; SILVA, 2020). A IL-10 também inibe a explosão
respiratória e a produção de citocinas inflamatórias, particularmente TNF-α, por macrófagos,
portanto, a produção de IL-10 afeta negativamente a atividade parasiticida das células
23
infectadas. Em conjunto, essa evidência indica que os parasitos de Leishmania conduzem a via
de ativação do macrófago M2 em uma determinada direção que favorece a sobrevivência e
proliferação do parasito (GORDON, 2003; ELMAHALLAWY et al., 2021).
As células da resposta imune adaptativa, representadas por células B e células T, são
muito importantes para determinar o curso da infecção por Leishmania e as manifestações
clínicas da doença. As células Th1 são geralmente efetoras contra bactérias intracelulares e
protozoários, e destroem parasitos intracelulares, como Leishmania spp., pela ativação de
macrófagos parasitados. As células Th1 desencadeadas então ativam macrófagos parasitados
para matar amastigotas intracelulares. Em contraste, as células Th2 secretam citocinas não
inflamatórias, como IL-4, que estão associadas à produção de anticorpos e cicatrização de
feridas; portanto, essas células são consideradas os efetores da imunidade do hospedeiro contra
parasitos
extracelulares
(NYLEN;
GAUTAM,
2010;
SHARMA;
SINGH,
2009;
LUCKHEERAM, 2012; ELMAHALLAWY et al., 2021).
3.2 Formas clínicas da leishmaniose
3.2.1 Leishmaniose Visceral
A leishmaniose visceral (LV) é uma doença infecciosa sistêmica, de evolução crônica,
com características clínicas que variam desde manifestações discretas (oligossintomáticas),
moderadas ou de evolução grave, podendo levar o indivíduo à morte (BRASIL, 2014).
Caracteriza-se por febre irregular de intensidade média e de longa duração, esplenomegalia,
hepatomegalia, acompanhada dos sinais biológicos de anemia, leucopenia, trombocitopenia,
hipergamaglobulinemia e hipoalbuminemia (KUMAR; PANDEY; SAMANT, 2020).
No Brasil, a principal espécie causadora da doença é o protozoário Leishmania
(Leishmania) infantum chagasi. Esta espécie, além da Leishmania (L.) donovani, possui um
forte tropismo para a visceralização da infecção, levando ao comprometimento de diferentes
órgãos, principalmente baço, fígado, medula óssea e linfonodos, onde se multiplicam em células
do SFM, gerando o quadro da LV (CONCEIÇÃO-SILVA, 2014).
Em relação ao diagnóstico clínico da LV, a hipótese diagnóstica deve ser presumida
quando o paciente apresenta febre e esplenomegalia associada ou não à hepatomegalia. É
importante salientar que a evolução clínica é dividida em períodos: período inicial, período de
estado e período final (BRASIL, 2021).
24
O período inicial ou fase aguda da doença, caracteriza-se, na maioria dos casos, por
febre com duração de até 4 semanas, palidez cutâneo-mucosa e hepatoesplenomegalia (Figura
5-A). No período de estado, o paciente apresenta febre irregular, geralmente associada a
emagrecimento progressivo, palidez cutâneo-mucosa e aumento da hepatoesplenomegalia.
Apresenta um quadro clínico arrastado geralmente com mais de dois meses de evolução, na
maioria das vezes associado a comprometimento do estado geral (Figura 5-B). Por fim, no
período final, com o comprometimento do estado geral de forma progressiva, o paciente
apresenta febre contínua, desnutrição (cabelos quebradiços, cílios alongados e pele seca),
edema dos membros inferiores que pode evoluir para anasarca. Outras manifestações
importantes incluem hemorragias (epistaxe, gengivorragia e petéquias), icterícia e ascite.
Nestes pacientes, o óbito geralmente é determinado por infecções bacterianas e/ou
sangramentos (Figura 5-C) (BRASIL, 2021).
Figura 5. Evolução clínica da leishmaniose visceral. (A) Período inicial; (B) Período de estado; (C) Período final.
(A)
(B)
(C)
Fonte: Adaptado de VASCONCELOS, 2018.
Na área urbana, o cão (Canis familiaris) é o principal reservatório da infecção. A
enzootia canina tem precedido a ocorrência de casos humanos e a infecção em cães tem sido
mais prevalente do que no homem. No ambiente silvestre, os reservatórios são as raposas
(Dusicyon vetulus e Cerdocyon thous) e os marsupiais (Didelphis albiventris). No Brasil, as
raposas foram encontradas infectadas nas regiões Norte, Nordeste e Sudeste. Os marsupiais
didelfídeos foram encontrados infectados no Brasil e na Colômbia, além de vetores (Lutzomyia
longipalpis), envolvem-se no ciclo de transmissão dessa doença, atribuindo-lhe a característica
de uma antropozoonose (BRASIL, 2021).
25
No estado de Alagoas, estudos recentes sobre a taxa de prevalência de LV entre os anos
de 2010 e 2019 mostram que a maior parte dos casos foram encontrados na capital, no município
de Maceió, no entanto, há relatos de casos em cidades de outras regiões do estado, como Santana
do Ipanema, São José da Tapera, Maragogi, Traipu, Major Isidoro, entre outras (SOUZA
BISPO, et al., 2022).
3.2.2 Leishmaniose Tegumentar Americana
A leishmaniose tegumentar, que engloba a leishmaniose cutânea (LC) e a leishmaniose
mucocutânea (LM), é uma doença infecciosa, não contagiosa, de caráter zoonótico, afetando
outros animais que não o ser humano, o qual pode ser envolvido secundariamente (FERREIRA
et al., 2015). É considerada uma enfermidade polimórfica e espectral da pele e das mucosas,
manifestando diferentes formas clínicas (MONKI, 2019; SOUZA JÚNIOR et al., 2020),
causada por diferentes espécies de protozoários do gênero Leishmania (BRASIL, 2017).
As lesões cutâneas causadas pela LC e LM possuem características distintas, de acordo
com a sua apresentação clínica, podem ser classificadas como: a) Forma cutânea localizada
(Figura 6-A), que representa o acometimento primário da pele, é caracterizada por lesões
ulcerosas, indolores, únicas ou múltiplas, restritas ao local de infecção; b) Forma cutânea
disseminada (Figura 6-B), caracteriza-se pelo aparecimento de múltiplas lesões papulares e de
aparência acneiforme que acometem vários segmentos corporais, envolvendo com frequência
a face e o tronco; c) Forma recidiva cútis (Figura 6-C), caracteriza-se por ativação da lesão nas
bordas, após cicatrização da lesão, mantendo-se o fundo com aspecto cicatricial; d) Forma
cutânea difusa (Figura 6-D), constitui-se como uma forma clínica rara e grave da L. (L)
amazonensis, inicia-se de maneira insidiosa, com lesão única e má resposta ao tratamento;
evolui de forma lenta com formação de placas e múltiplas nodulações não ulceradas recobrindo
grandes extensões cutâneas (BRASIL, 2017).
26
Figura 6. Classificação clínica da leishmaniose cutânea. (A) Forma Cutânea Localizada. (B) Forma cutânea
disseminada. (C) Forma recidiva cútis. (D) Forma cutânea difusa.
(A)
(B)
1
(C)
(D)
Fonte: Adaptado de VASCONCELOS, 2018.
A LM é uma lesão secundária à LC, e expressa-se por lesões destrutivas localizadas nas
mucosas das vias aéreas superiores. Geralmente, casos de pacientes com LM são resultados da
evolução crônica de LC curada sem tratamento ou com tratamento inadequado (SOUZA
JÚNIOR et al., 2020). É comum que pacientes com LM apresentem cicatriz indicativa de LC
anterior, lesões cutâneas e mucocutânea concomitantemente ou, em casos ditos fugaz, não
apresentam cicatriz sugestiva de LC (BRASIL, 2017).
De acordo com a apresentação clínica, a LM pode classificar-se como: a) Forma mucosa
tardia (Figura 7-A), está associada às lesões cutâneas múltiplas ou de longa duração, às curas
espontâneas ou aos tratamentos insuficientes da LC; b) Forma mucosa sem lesão cutânea prévia
(Figura 7-B), associadas às infecções subclínicas ou lesões cutâneas pequenas, não ulceradas,
de evolução rápida e que teriam passado despercebidas sem deixar cicatrizes perceptíveis; c)
Forma mucosa concomitante (Figura 7-C), quando a lesão mucosa ocorre à distância, porém
ao mesmo tempo em que a lesão cutânea ativa; d) Forma mucosa contígua (Figura 7-D), ocorre
por propagação direta de lesão cutânea localizada próxima a orifícios naturais, para a mucosa
das vias aerodigestivas; e) Forma mucosa primária (Figura 7-E), ocorre eventualmente pela
picada do vetor na mucosa ou submucosa de lábios e genitais (BRASIL, 2017).
27
Figura 7. Classificação clínica da leishmaniose mucosa. (A) Forma mucosa tardia. (B) Forma mucosa sem lesão
cutânea prévia. (C) Forma mucosa concomitante. (D) Forma mucosa contígua. (E) Forma mucosa primária
(A)
(C)
(B)
(D)
(E)
Fonte: Adaptado de VASCONCELOS, 2018.
No Brasil, já foram identificadas sete espécies de Leishmania, sendo seis do subgênero
Viannia e uma do subgênero Leishmania. As três principais espécies são: L. (V) braziliensis,
L.(V) guyanensis e L. (L.) amazonensis e, mais recentemente, as espécies L. (V.) lainsoni, L. (V)
naiffi, L. (V) lindenberg e L. (V) shawi foram identificadas em estados das regiões Norte e
Nordeste (BRASIL, 2021).
A LTA é considerada uma das principais endemias de saúde pública no país, exatamente
pela ocorrência de formas clínicas graves e a dificuldade encontrada tanto para o diagnóstico,
quanto para o tratamento da doença (SOUZA JÚNIOR et al., 2020). Em Alagoas, vários
municípios em todas as regiões do estado apresentaram casos de LTA entre 2010 e 2019, sendo
a capital Maceió a que apresentou a maior taxa de prevalência, seguido de municípios como
União dos Palmares, Novo Lino e Colônia Leopoldina (SOUZA BISPO, et al., 2022).
3.2.3 Epidemiologia das Leishmanioses no Brasil
As leishmanioses são doenças tropicais consideradas negligenciadas de acordo com a
Organização Mundial de Saúde (OMS, 2019), acometem, principalmente, pessoas em situação
28
de vulnerabilidade social. No Brasil, elas são endêmicas e apresentam casos em todos os estados
(OLIVEIRA, et al., 2021).
As leishmanioses apresentam circunstâncias determinantes na esfera ambiental, social
e cultural, que contribuem com o avanço da doença. Entre esses determinantes, a condição
socioeconômica, desnutrição, migração, condições ambientais e mudanças climáticas, têm sido
considerados como os principais fatores de risco associados à ocorrência das leishmanioses
(OMS, 2019).
No Brasil, a LV era, primariamente, uma zoonose caracterizada como doença de caráter
eminentemente rural, no entanto, vem se expandindo para áreas urbanas de médio e grande
porte e se tornou crescente problema de saúde pública no país, sendo uma endemia em franca
expansão geográfica. Assim também a LTA tem aumentado as notificações devido aos mesmos
fatores (BRASIL, 2021).
Em 2020, de acordo com a Organização Pan-Americana de Saúde (OPAS), o Brasil foi
o país onde houve o maior número de notificações de casos de LC e LM, totalizando 16.432
casos (Figura 8).
Figura 8. Casos de notificações de LTA nas Américas (2001 – 2020).
Fonte: OPAS, 2020.
De acordo com Galvis-Ovallos (2020), em relação aos fatores de riscos associados à
ocorrência de casos de LTA, destacam-se a diversidade de agentes etiológicos, de vetores e de
hospedeiros. As formas tegumentares podem ocorrer de acordo com aspectos bioecológicos
diversos, desde florestas primárias, associadas a atividades extrativistas, bem como em
29
ambientes rurais, e ambientes urbanos, principalmente a proximidade de mata remanescente, o
que favorece o desenvolvimento de vetores e hospedeiros (BRASIL, 2017). Na figura 9,
observa-se a distribuição de casos de LTA no Brasil, por Unidade da Federação (UF).
Figura 9. Casos de LTA por Unidade da Federação (UF) de infecção.
Fonte: SVS/MS, 2020.
A LV é endêmica em pelo menos 13 países das Américas, segundo os registros de
notificações da OPAS (2020). Em 2020 foi registrado o menor número de casos de LV do
período, devido à redução de 25% (670) de casos no Brasil. Não se sabe se essa redução se deve
às consequências que a pandemia COVID-19 teve nas ações de vigilância e assistência, ou se é
devido à tendência cíclica da doença, uma vez que para a LV observou-se um aumento no
número de casos, conforme a figura 10.
30
Figura 10. Casos de notificações de LV nas Américas (2001 – 2020).
Fonte: OPAS, 2020.
A incidência de LV, considerando a população das zonas de transmissão da Região, foi
de três casos por 100.000 habitantes, o que mostra que, apesar da diminuição dos casos em
número e distribuição geográfica, a incidência aumentou. De acordo com a OPAS (2020), o
maior número e densidade de casos continuam sendo notificados pelos mesmos municípios no
Brasil: Fortaleza (Estado do Ceará), São Luís (Maranhão), Belo Horizonte (Minas Gerais),
Teresina (Piauí), Paraupebas (Pará), Campo Grande (Mato Grosso do Sul), Araguaína e Marabá
(Tocantins). As maiores taxas de incidência também foram apresentadas no Brasil: Sapucaia
(Pará), Mariápolis (São Paulo), Maetinga (Bahia), Uiramutã (Roraima), Darcinópolis e Lajeado
(Tocantins) e Buritinópolis (Goiás). Na figura 11, observa-se uma ampla dispersão dos casos
de LV e, em algumas áreas, uma intensa concentração.
31
Figura 11. Casos de LV por UF de infecção no Brasil, em 2020.
Fonte: SVS/MS, 2020.
3.2.4 Tratamento das leishmanioses
No Brasil, para todas as formas de leishmaniose, o tratamento de primeira linha são os
antimoniais pentavalente Sb(V). Atualmente os antimoniais disponíveis são o antimoniato de
N-metil-glucamina (Glucantime) e o estibogluconato de sódio (Pentostan); o primeiro é a única
formulação de antimonial disponibilizada pelo Ministério da Saúde no Brasil em ampolas de 5
ml, contendo 405mg de Sb(V) (1mL = 81mg de Sb(V)), no entanto, não parece existir
diferenças quanto a eficácia terapêutica destas formulações. Seu mecanismo de ação atua nas
formas amastigotas do parasito, inibindo sua atividade glicolítica e a via oxidativa de ácidos
graxos (BRASIL, 2019).
Outros fármacos são utilizados como sendo de segunda escolha para os tratamentos das
leishmanioses: a anfotericina B, a pentamidina, a miltefosina, a paramomicina e a sitamaquina
são alguns deles (Figura 12) (OLIVEIRA et al., 2011; WHO, 2015).
32
Figura 12. Fármacos de primeira e segunda linha utilizados no tratamento da leishmaniose. (A) Anfotericina B.
(B) Antimoniato de meglumina. (C) Estibogluconato de sódio. (D) Miltefosina. (E) Paromomicina. (F)
Pentamidina.
Fonte: Adaptado de YAMAMOTO, 2019; SILVA, 2016.
A anfotericina B é o fármaco de segunda escolha, empregada quando não se obtém
resposta ao tratamento com antimonial pentavalente ou na impossibilidade de seu uso. É
importante esclarecer que a medicação deve ser feita sob orientação e acompanhamento
médico, com o paciente hospitalizado, em serviço de referência devido à sua toxicidade. A
apresentação lipossomal da anfotericina B, com menos efeitos colaterais, está disponível para
o tratamento de casos selecionados de LV grave (BRASIL, 2019; CDC, 2020; MOSIMANN et
al., 2018; RODRIGO et al., 2018).
A anfotericina B tem alta correlação com o ergosterol presente na membrana dos fungos.
Ao ligar-se ao ergosterol, o fármaco possibilita a formação de poros que alteram a
permeabilidade da membrana por conduzir o escape descontrolado de íons, resultando na morte
da célula fúngica. No entanto, a anfotericina B possui baixa afinidade pelo colesterol presente
nas células de mamíferos, isso faz com que sua ação seja seletiva às células com ergosterol.
Parasitos da Leishmania também apresentam ergosterol como principal esterol de membrana, e
por isso são sensíveis à anfotericina B. Desse modo, seu mecanismo de ação é semelhante nos
parasitos (SANGSHETTI et al., 2015; BERMAN, 2015).
33
A pentamidina é usada como medicamento alternativo nos casos que não respondem ou
nos quais o paciente apresenta contraindicação aos antimoniais pentavalentes e à Anfotericina
B convencional e lipossomal. No entanto, sua eficácia é bastante variável e pode causar efeitos
colaterais graves (BRUNTON; HILAL-DANDAN; KNOLLMANN, 2018; KATZUNG;
TREVOR, 2017). A pentamidina pode entrar nos parasitos por meio de transportadores de alta
afinidade dependentes de prótons, e ligar-se ao DNA mitocondrial, influenciando nos processos
de replicação e transcrição (SOARES- BEZERRA; LEON; GENESTRA, 2004). Além disso,
pode inibir transportadores de poliaminas, como LmPOT1, causando uma diminuição na
captação de substratos importantes para rotas biossintéticas nos parasitos (DIAZ et al., 2014).
A miltefosina foi inicialmente desenvolvida como agente antineoplásico para tratar o
câncer de mama e outros tumores sólidos (BENNETT; DOLIN; BLASER, 2015; REIMÃO;
PITA PEDRO; COELHO, 2020). No entanto, possui efeitos adversos como toxicidade
gastrointestinal (SUNDAR; CHAKRAVARTY, 2015). Acredita-se que esse fármaco apresenta
mais de um sítio molecular de ação. De maneira geral, sua atividade antileishmania envolve: a
perturbação do metabolismo lipídico (diminuição na fosfatidilcolina e aumento de
fosfotidiletanolamina); morte celular semelhante a apoptose (inibição da via PI3K/AKT);
disfunção mitocondrial (inibição do citocromo c oxidase); além de efeitos imunomoduladores
(promove resposta Th1) (DORLO et al. 2012).
A paramomicina, também conhecida como aminosidina, é um antibiótico
aminoglicosídeo anteriormente usado para infecções intestinais e que mostrou atividade
leishmanicida na década de 60 (MONZOTE, 2009). Age principalmente sobre o ribossomo
citoplasmático da Leishmania, inibindo a síntese proteica e consequentemente causando efeitos
deletérios no parasito (SHALEV-BENAMI et al., 2017). O fármaco deve ser administrado por
via intramuscular. Alguns efeitos secundários foram relatados como cólicas abdominais e
náuseas, além de reações adversas mais significativas como hepatotoxicidade, ototoxicidade
reversível e mais raramente, nefrotoxicidade (SUNDAR, JHA e THAKUR, 2007; JAMESON,
2020).
A sitamaquina é um fármaco desenvolvido para tratamento oral da LV, porém, não é
ativa por via tópica para o tratamento de LTA. Embora este fármaco tenha demonstrado uma
taxa de cura de 50% na Índia, estudos posteriores revelaram efeitos secundários, como vômitos,
dispepsia, cianose, síndrome nefrótica e glomerulonefrite. Em outro estudo, no Quênia,
verificou-se eficácia idêntica, no entanto, os efeitos secundários observados foram dor
abdominal, dor de cabeça e disfunção renal. Seu mecanismo de ação envolve a inibição do
complexo II da cadeia respiratória (succinato-Q redutase), o qual desencadeia o estresse
34
oxidativo pela produção de ROS e aumento do Ca2+ intracelular, gerando uma morte semelhante
a apoptose dos parasitos (CARVALHO et al., 2011; CHAKRAVARTY, 2015; JHA et al.,
2017).
Além da toxicidade que possuem os medicamentos antileishmania, outros graves
problemas que dificultam o tratamento da doença recaem no desenvolvimento de resistência
pelo parasito, o que representa grande obstáculo para o sucesso da terapia (CONCEIÇÃO SILVA, 2014). Portanto, torna-se urgentemente necessária a busca por compostos ativos, que
possam dar origem a novos medicamentos que tenham alvos bioquímicos e rotas metabólicas
essenciais para a sobrevivência do parasito (SINGH et al., 2012).
3.3 Biodiversidade e bioprospecção de microrganismos isolados da Caatinga e seu Potencial
Biotecnológico.
A Caatinga é o único bioma exclusivamente brasileiro. Sua extensão compreende os
estados de Alagoas, Bahia, Ceará, Maranhão, Pernambuco, Paraíba, Rio Grande do Norte,
Piauí, Sergipe e o norte de Minas Gerais (Figura 13). Compreende uma área de 844.453 mil
km², que corresponde a cerca de 11% do território nacional. Representa uma das maiores
florestas sazonais do mundo com seu clima semiárido e apresenta ecossistemas únicos para
microrganismos adaptados às altas temperaturas, excesso de radiação UV, estresse hídrico e
escassez de nutrientes (EMBRAPA, 2012; MELO et al., 2014; IBGE, 2019).
Figura 13. Mapa correspondente ao Bioma Caatinga.
Fonte: Adaptado de SILVA, 2015.
35
O nome Caatinga significa “mata ou floresta branca” no tupi, nome dado pelos primeiros
habitantes desta região, os indígenas. Na estação seca, a maior parte das plantas perdem as
folhas, a paisagem se torna clara e os troncos esbranquiçados, por isso o seu nome, no entanto,
durante o período chuvoso, a paisagem apresenta diferentes tonalidades de verde (EMBRAPA,
2012; IBAMA; 2012; IBGE, 2019; CONAFER, 2022).
Este bioma possui um patrimônio biológico imensurável, em nenhum outro lugar do
mundo se encontra esta diversidade biológica, justamente por ser exclusivamente brasileira, o
que faz com que esta região esteja entre um dos mais importantes cenários para a bioprospecção
do planeta, tornando-se extremamente relevante a sua preservação (EMBRAPA, 2012;
MOURA et al., 2021).
Segundo o Ministério do Meio Ambiente, a Caatinga abriga uma variedade de espécies
pouco conhecidas, quase mil espécies de plantas ocupam o seu solo, todas elas formadas pelos
3 estratos vegetais: as espécies arbóreas, as arbustivas e as herbáceas, com destaque para as
bromélias e os cactos que constituem as principais famílias de vegetais da região (BRASIL,
2018). Estas plantas possuem como característica a alta resistência aos períodos de seca, tal
característica confere às plantas adaptações para sua sobrevivência em períodos de longa
estiagem e temperaturas altas (KAVAMURA, 2012; LISBOA et al., 2020).
Estas adequações das plantas podem incluir controle estomático, diferenciação da
cutícula, armazenamento de água e associação com microrganismos, aos quais também se
encontram bem adaptados ao clima do semiárido (SIQUEIRA FILHO, 2012; CABRAL et al.,
2013). Estudos indicam que, principalmente em relação aos seus potenciais compostos
bioativos, diversas espécies vegetais vêm se mostrando como fontes promissoras para o
desenvolvimento de novos fármacos, especialmente antimicrobianos e antiparasitários
(FERNANDES e QUEIROZ, 2018). Isso acontece porque parte destes compostos bioativos são
provenientes de metabólitos secundários dos vegetais, resultado da interação das plantas com o
seu ambiente, incluindo microrganismos (NETO e LOPES, 2007; ROCHA et al., 2019).
A Caatinga possui também uma grande diversidade de microrganismos, sobretudo de
solo, que é um ambiente complexo, caracterizado por processos químicos, físicos e biológicos,
influenciado por fatores ambientais. Este ecossistema oferece grande suporte para a manutenção
da microfauna, tendo a diversidade microbiológica como sua principal característica
(MICHEREFF et al., 2005; CAVALCANTE et al., 2017; GARDA et al., 2018).
A rizosfera, que é uma região de solo bastante influenciada pelas raízes de solo, é uma
região de abundante diversidade microbiana, como essa superfície é enriquecida por substâncias
provenientes do metabolismo das plantas, possui máxima atividade de bactérias, fungos,
36
actinobactérias, que vivem um processo de constante simbiose com as plantas, onde ambos se
beneficiam (RASCHE et al., 2006; MELO e AZEVEDO, 2008; BERG e SMALLA, 2009;
EMBRAPA, 2012; OLIVEIRA et al., 2013)
A biodiversidade da Caatinga ampara diversas atividades econômicas voltadas para fins
agrícolas e industriais, especialmente nos ramos farmacêutico, de cosméticos, químico e de
alimentos (BRASIL, 2020). Enzimas e propriedade bioativas produzidas por microrganismos e
plantas exclusivas deste bioma são considerados promissores para o desenvolvimentos de novos
fármacos, pois possuem grande variabilidade nas suas composições químicas, têm o potencial
de possuir propriedades fisiológicas e bioquímicas únicas, que podem agir como agentes
antimicrobianos ou antifúngicos, redutores do colesterol, imunossupressores, antiparasitários,
herbicidas, entre outros (MELO et al., 2014; SILVA et al., 2015; SANTOS et al., 2018;
FERNANDES; QUEIROZ, 2018). A possibilidade de bioprospecção destes metabólitos
secundários oriundos do bioma Caatinga são de grande necessidade para o tratamento das
doenças infecciosas e parasitárias, que apresentam relatos constantes de resistência aos
medicamentos utilizados na rotina, como as leishmanioses, o que representa um grande
problema econômico e de saúde pública (BRITO, 2015; OLIVEIRA, 2016; HOFER, 2019).
3.4 Liquens como micro-habitat de microrganismos da Caatinga
Liquens podem ser considerados como miniecossistemas que encerram a junção de dois
organismos diferentes em uma associação estável e autossustentável que se constitui
basicamente de um fungo, o componente micobionte, e um ou mais componentes
fotossintetizantes (fotobiontes), que podem ser algas verdes e, ou cianobactérias (NASH 2008;
JESUS et al, 2011).
Nesta associação, o micobionte produz diversos metabólitos secundários, denominados
ácidos liquênicos, enquanto o fotobionte, por sua vez, produz dióxido de carbono através da
fotossíntese e fornece compostos orgânicos para o fungo e para seu próprio consumo. As algas
ou cianobactérias são beneficiadas na associação pelo abrigo de luz excessiva e pela
possibilidade de se estabelecer em ambientes secos (FLEIG et al., 2008; LIMA, 2013).
Os liquens geralmente apresentam crescimento lento e frequentemente habitam regiões
com alta radiação, temperatura extrema e clima seco (SANCHO; PINTADO, 2004). São
capazes de colonizar diferentes substratos (SANTIAGO, 2015) e possuem ampla distribuição
incluindo casca de árvore (liquens corticosos), solo (liquens terrícolas), rochas (liquens
saxícolas) (Figura 14) e madeira em decomposição (liquens lignicolos) (BOCH et al., 2013).
37
Figura 14. Rocha colonizada por liquens na Caatinga.
Fonte: DUARTE, 2019.
Bactérias associadas a liquens estão presentes essencialmente em biocrostas, que são
camadas densas que se desenvolvem na superfície do solo, sendo formadas por partículas
fragmentadas pela erosão e pelo enovelamento de vários grupos de microrganismos (RAANAN
et al., 2016). Diversos componentes são comumente relacionados a estas camadas, dentre os
filos caracterizam-se a Actinobacteria, Acidobacteria, Bacteroidetes e Proteobacteria (em
maioria, Alphaproteobacteria) (DA ROCHA et al. 2019; DELGADO-BAQUERIZO et al.,
2016).
Os fungos liquenizados são formados por uma associação simbiótica de fungos com
clorofíceas unicelulares e /ou cianobactérias e em alguns casos formado pelos três organismos
(HAWKSWORTH, 2001; SANTIAGO, 2015). Líquens, tem ampla distribuição incluindo
casca de árvore (liquens corticosos), solo (liquens terrícolas), pedras (liquens saxícolas) e
madeira em decomposição (liquens lignicolos) (BOCH et al., 2013) Apresentam um
crescimento lento (SANCHO & PINTADO, 2004) e frequentemente habitam regiões com alta
radiação, temperatura extrema e clima seco (SANTIAGO, 2015).
Algumas funções desenvolvidas por fungos de ambientes extremos podem gerar
aplicações biotecnológicas importantes, tais como produzir enzimas e metabólitos secundários
com grande potencial farmacológico, principalmente na produção de imunossupressores e
antibióticos (CHRISTENSEN, 1989; SINGH et al., 2006; SANTIAGO et al., 2011;
GONÇALVES et al., 2012, FURBINO et al., 2014; GODINHO et al., 2015). Além disso, os
fungos adaptados às condições extremas são frequentemente investigados pela capacidade de
38
produção de fotoprotetores (micosporinas e pigmentos), antioxidantes e enzimas ativas a baixas
temperaturas (GOMES et al., 2000; LIBKIND et al., 2005; VAZ et al., 2011, ZHAN et al.,
2011, GESSLER et al., 2014).
O bioma Caatinga, predominantemente semiárido, de relevo heterogêneo, caracterizado
por apresentar longos períodos de seca e curtos períodos chuvosos, radiação solar intensa e
estresse hídrico, com peculiaridades de diversidade funcional que favorece a adaptação de
organismos extremófilos e raros, apresenta uma maior abundância de bactérias fixadoras de
nitrogênio (MACHADO DE LIMA et al., 2021), no entanto, acredita-se que nesse extenso
território nordestino, estejam presentes uma diversidade inexplorada de microrganismos, ricas
em enzimas e substâncias bioativas, com inestimável potencial biotecnológico, capazes de
produzir fármacos antimicrobianos e antiparasitários (WEBER et al., 2016).
3.5 Pigmentos extracelulares produzidos por microrganismos e suas aplicações na indústria
farmacêutica.
Os pigmentos naturais são metabólitos oriundos de organismos vivos como plantas,
bactérias e fungos. Estes pigmentos de origem microbiana representam uma promissora
alternativa em relação a outros aditivos extraídos de vegetais uma vez que não apresentam
problema de sazonalidade (SOUZA, 2018), ou seja, não há necessidade de períodos específicos
para a extração.
Além disso, estes pigmentos estão relacionados a diversidade bioquímica destes
organismos, pois devido as suas interações metabólicas e ambientais constantes, podem originar
metabólitos secundários de importância biotecnológica. No entanto, não somente a estrutura
química apresenta variabilidade, estes pigmentos também apresentam uma gama de cores que
podem ser produzidos, das quais podemos destacar indigo, melaninas, flavinas, carotenoides,
fenazinas, quinonas, violaceína e prodigiosinas (KRAMER et al., 2022; SANTOS-EBINUMA,
2013).
Dentre os microrganismos produtores de pigmentos de interesse biotecnológico,
podemos citar a Serratia marcescens, que é uma bactéria gram-negativa pertencente à família
Enterobacteriaceae, responsável pela produção de prodigiosina e compostos carotenoides. A
prodigiosina, por exemplo, é um pigmento vermelho, que apresenta excelente atividade
biológica com ação antifúngica, antibacteriana, antitumoral e antimalárico. Sua produção
depende de vários fatores como sais inorgânicos, fonte carbono, nitrogênio, temperatura
39
adequada, numa faixa de 12 a 36ºC e pH pouco influente (MORAES, 2009; CANTALICE,
2014; SOUZA, 2018).
Por sua vez, os carotenoides são pigmentos naturais responsáveis pela cor vermelha,
laranja ou amarela de muitos vegetais, flores e plantas em geral. São sintetizados por plantas,
algas, fungos tipo leveduras e procariotos (bactérias e arqueas). A atividade biológica dos
carotenoides encontra-se associada à sua estrutura e sua produção biotecnológica apresenta
grande relevância devido à possibilidade de utilização de substratos de baixo custo. Além disso,
os carotenoides possuem atividades biológicas importantes, destacando-se a inibição de
doenças onde os radicais livres apresentam papel fundamental, como arteriosclerose, catarata,
degeneração macular, esclerose múltipla, câncer, doenças degenerativas e cardiovasculares
(VALDUGA et al., 2009; GARCIA-PICHEL, F.& GAO, Q, 2011; MALDONADE, 2007;
BHOSALE, 2004).
Os carotenoides também se destacam por suas propriedades antimicrobianas, antivirais,
antitumorais, antiprotozoárias, antioxidantes, anticâncer e muito mais atividades (VENIL,
2020). Ademais, os pigmentos bacterianos são considerados seguros e podem ser utilizados
como corantes naturais que beneficiarão a saúde humana e salvarão o ecossistema (MALIK et
al., 2012).
40
4 METODOLOGIA
4.1 Obtenção dos produtos naturais oriundos de microrganismos isolados da Caatinga.
Os microrganismos coletados na Caatinga alagoana foram cedidos pelo Prof. Dr.
Alysson Wagner Fernandes Duarte (Campus Arapiraca/UFAL), coordenador do projeto
“Antártica e Caatinga: Diversidade Microbiana e Bioprospecção de Enzimas e Pigmentos”.
Após o crescimento microbiano, os microrganismos foram submetidos à extração utilizando
solventes como acetato de etila e metanol, conforme metodologia descrita por GODINHO et
al. (2013).
4.1.1 Microrganismos isolados da Caatinga
Para este estudo, as bactérias resistentes a radiação Ultravioleta curta (UV-C) e os
fungos filamentosos utilizados foram disponibilizados pelo Laboratório de Microbiologia,
Imunologia e Parasitologia (LABMIP), vinculado à Universidade Federal de Alagoas, campus
Arapiraca. A coleta dos líquens ocorreu no dia 16 de novembro de 2019 e foi realizada na
Reserva da Tocaia, situada em uma área de conservação, a Reserva Particular do Patrimônio
Natural (RPPN), que se localiza entre as coordenadas 9º 22.944’ de latitude Sul e 37º 15.315’
de longitude oeste e altitude média de 250 metros (MASCARENHAS, 2005), encontra-se sem
exploração antrópica há mais de 80 anos e por isto atualmente apresenta-se bastante preservada,
localizada no município de Santana do Ipanema, Estado de Alagoas (Figura 15).
Figura 15. Coleta de liquens no município de Santana do Ipanema/AL .
(A)
Fonte: DUARTE, 2019.
(B)
(C)
41
As espécies de líquens coletadas e isoladas foram devidamente identificadas, conforme
a tabela 1. Os isolados foram colocados em criotubos com glicerol (20%) e submetidos a ultra
freezer -80ºC. No total, foram avaliados 5 isolados bacterianos, sendo dois de uma mesma
espécie e 3 isolados fúngicos. Com relação aos isolados bacterianos, os líquens testados foram
os coletados da Reserva da Tocaia (LC3, LC4, LC5 e LC8) pertencentes às espécies
Xanthoparmelia plittii (Gyeln.) Hale, Peltula clavata (Kremp.) Wetmore, Dirinaria applanata
(Fée) D. D. Awasthi e Peltula euploca (Ach.) Poelt, respectivamente. Dois fungos filamentosos
foram identificados como sendo da espécie Xanthoparmelia plittii (Gyeln.) Hale (LC2), o
liquen 4LCEM2 foi identificado como Fusarium sp., porém, não foi possível realizar a
identificação taxonômica do liquen 4UVLFC2. O liquen 2LCL1 foi identificado como
Penicillium sp., no entanto, não foi possível identificar a espécie deste liquen, conforme mostra
a tabela 2. Todos os isolados apresentaram fotossensibilidade, portanto, foram manipulados em
cabine de segurança biológica em condições mínimas de luminosidade.
Tabela 1. Identificação dos liquens de isolados bacterianos.
LIQUENS DE ISOLADOS BACTERIANOS
LC3
Xanthoparmelia plittii (Gyeln.) Hale
LC4
Peltula clavata (Kremp.) Wetmore
LC5
Dirinaria applanata (Fée) D.D. Awasthi
LC8
Peltula euploca (Ach.) Poelt
Fonte: O autor, 2022.
Tabela 2. Identificação de liquens de isolados fúngicos e identificação taxonômica.
LIQUENS DE ISOLADOS FÚNGICOS FILAMENTOSOS
LC1
Não identificado
Penicillium sp.
LC2
Xanthoparmelia plittii (Gyeln.) Hale
-
LC2
Xanthoparmelia plittii (Gyeln.) Hale
Fusarium sp.
Fonte: O autor, 2022.
4.1.2 Cultivo, reativação e produção de biomassa microbiana
Para a reativação dos isolados bacterianos, foi utilizado o meio de cultura Ágar Nutriente
(AN), com as seguintes especificações: 3g/1 L de Extrato de levedura, 1g/1L de Extrato de
carne, 5 g/1 L de Peptona, 5g/1 L de Cloreto de Sódio, 5g/1 L de Glicose e 20g/1 L de Ágar,
42
todos os nutrientes foram colocados em Erlenmeyer com a quantidade de água destilada
correspondente a desejada para cada placa, em seguida os Erlenmeyers foram vedados e levados
para a autoclave por 20 minutos a 121ºC, a 1 atm. Após a esterilização, o Erlenmeyer foi levado
para a cabine de segurança biológica. Verteu-se o meio em placas de Petri, ligou-se a UV-C até
que solidificasse, depois foram vedadas com parafilme e submetidas a incubadora a 25 ºC por
7 dias.
Logo após o período de incubação, os isolados bacterianos (codificados como
12UVLBC8, 2UVLLC4, 13UVLBC8, 2UVLBC5 e 13UVLBC3) foram cultivados em placas
de Petri contendo AN. O cultivo de isolados bacterianos foi baseado no método descrito por
Silva et al. (2019) com algumas modificações. A técnica utilizada foi a de estria de esgotamento,
logo após mergulhar a alça no microtubo contendo a amostra do isolado. As placas foram
vedadas com parafilme e incubadas em estufa por 7 dias, a 25ºC. Depois do crescimento
bacteriano, 3 a 6 colônias com a mesma morfologia foram inoculadas em 6 mL de solução
salina (0,95%), agitados em vórtex em velocidade máxima para formar uma suspensão
padronizada em um espectrofotômetro UV-visível de 0.9 e 1.0 (107 cel/mL). Em seguida, 3 mL
da alíquota padronizada foi transferido para Erlenmeyer contendo 150 mL de caldo nutriente e
submetido a agitação em incubadora Shaker a 120 rpm, durante 7 dias, a 25°C (Figura 16).
Após esse período, as amostras foram transferidas para tubos falcon e submetidos à
centrifugação a 3.500 rpm por 10 minutos. A biomassa bacteriana formada foi submetida a
lavagem com solução salina estéril. Por fim, as biomassas foram congeladas em freezer até sua
posterior extração.
43
Figura 16. Aspecto do cultivo bacteriano em caldo nutriente após incubação por 7 dias a 25ºC e 120 rpm.
Fonte: O autor, 2021.
4.1.3 Extração de pigmentos intracelulares bacterianos
Inicialmente, foram adicionados 30 mL de acetato de etila à biomassa bacteriana, no
entanto, observou-se que este solvente não produziu o efeito esperado na extração, logo, o
solvente foi substituído pelo metanol, considerando o mesmo volume, contudo, as soluções
extraídas foram devidamente separadas em falcons distintos. Em seguida, as amostras foram
agitadas com auxílio de um vórtex em velocidade máxima e submetidas a banho ultrassônico
de 30 minutos a 1 hora para otimizar a lise celular. As amostras centrifugadas durante 10
minutos, a 4.500 rpm repetidas vezes, até a máxima despigmentação da biomassa. Os
sobrenadantes com os pigmentos extraídos da biomassa bacteriana foram transferidos para
falcons estéreis e devidamente identificados. Foi adicionado Sulfato de Sódio (Na2SO4) em
cada falcon com os pigmentos extraídos, para a evaporação dos resíduos de água, logo após, as
soluções obtidas foram transferidas para balões volumétricos devidamente identificados, onde
passou pelo rotaevaporador para evaporar o solvente e concentrar o pigmento (GODINHO et
al., 2013). Os conteúdos obtidos após essa etapa foram secados em um dessecador de vidro sob
vácuo protegido da luz em capela de exaustão de gases (Figuras 17 e 18). Em seguida
ressuspendidos em dimetilsufóxido (DMSO) (Figura 19).
44
Figura 17. Pigmentos oriundos da biomassa bacteriana em soluções extrativas (A), após a secagem em dessecador
de vidro (B) e solubilizado em DMSO (C).
Fonte: O autor, 2023.
4.1.4 Obtenção dos extratos de fungos filamentosos
Extratos acetato de etila de fungos filamentosos foram selecionados para serem
avaliados no presente estudo quanto a sua atividade leishmanicida, uma vez que demonstraram
atividade antifúngica em estudos preliminares (dados não publicados), conduzidos por nosso
grupo de pesquisa. Para tanto, os extratos foram produzidos e cedidos pela mestranda Vannêssa
Rodrigues Teles Maia e pelo Prof. Dr. Alysson Wagner Fernandes Duarte. Após o cultivo dos
fungos filamentosos 2LCL1, 4LCEM2 e 4UVLFC2, foi realizada a extração utilizando acetato
de etila por 7 dias, com posterior secagem do extrato utilizando rotaevaporador e em seguida
ressuspendidos em dimetilsufóxido (DMSO).
45
4.2 Ensaios farmacológicos
4.2.1 Manutenção da linhagem macrófagos
Macrófagos da linhagem J774.A1 foram mantidos em garrafas de cultura em 5 mL de
meio RPMI (Roswell Park Memorial Institute-1640) suplementado com L-glutamina, piruvato,
aminoácidos não essenciais, 10% de soro fetal bovino (Roche), e mantidos em estufa a 37ºC
com 95% de umidade e 5% CO2. No momento do uso, as células foram contadas, ajustadas em
meio RPMI suplementado, na concentração de 1 x 105 células/mL e 200 μL dessa suspensão
foi distribuída em placa de 96 poços (Nunc, Denmark) ou 1 x 105 células /poço de placa de 24
poços com lamínulas.
4.2.2 Determinação da viabilidade celular
Macrófagos da linhagem J774.A1 foram cultivados em triplicatas em placas de 96
poços, na concentração de 5 x 104 células/poço e incubadas em estufa a 37 ºC com atmosfera
úmida contendo 7% de CO2 para adesão dos macrófagos ao plástico. Em seguida, os poços
foram lavados para remoção das células não aderentes e posteriormente preenchidos em
triplicata com 200 μL dos extratos testados diluídos em meio RPMI nas concentrações de 100,
30, 10, 1, 3 e 0,3 mg/mL e reincubados por 48h. Os poços controles com células foram
cultivados somente com meio de cultura e 10% de SFB (Roche) ou células cultivadas na
presença do diluente das substâncias (DMSO, Sigma). A viabilidade celular foi determinada
pelo ensaio de redução de MTT (MOSMANN et al.,1993), realizando a leitura das absorbâncias
em espectrofotômetro a 550 nm. A viabilidade celular dos macrófagos tratados com os extratos
foi comparada ao padrão de morte obtido nas culturas controle. Para calcular o Índice de
Seletividade (IS), foi utilizado a razão entre CC50 e CI50, conforme descrito por Ribeiro et. al.,
(2014), através do seguinte cálculo: IS=CC50/CI50.
4.2.3 Ensaio de viabilidade de promastigotas
Promastigotas de L (L). amazonensis e L (L). chagasi foram cultivadas numa
concentração de 1x105 parasitos/poço e volume de 100 μL/poço em placa de 96 poços com
meio Schneider suplementado com 10% de SFB, 2 mM de L-glutamina e 2% de urina humana.
Foram adicionadas em triplicatas diferentes concentrações (0,3, 1, 3, 10, 30 e 100 μg/mL) dos
46
nove extratos pigmentados e anfotericina B desoxicolato (Sigma-Aldrich) (fármaco padrão) aos
poços contendo as formas promastigotas até a obtenção do volume final de 200 μL. A placa foi
incubada em estufa BOD a 27ºC por 48 horas. Após esse período, os parasitos de L (L).
amazonensis e L (L). chagasi foram homogeneizados e o número de parasitos foi determinado
utilizando câmara de Neubauer e microscopia óptica em aumento de 400x (Nikon Eclipse Ci)
(TIUMAN et al., 2005).
4.2.4 Espectrofotometria de Varredura
Os pigmentos foram submetidos à varredura e quantificados em Espectrofotômetro
UV-Vis – 200 a 1000 - Série 2000, no intervalo de comprimentos de onda de 200nm a 1000nm.
Os resultados foram dados em unidade de absorbância (AU), para avaliar as características do
espectro correspondente aos constituintes que compõem o extrato. Foi utilizado 20 µL de
(DMSO, sigma), como controle, e 20 µL de cada amostra a uma temperatura de 26ºC.
4.2.5 Análise estatística
As análises estatísticas dos dados obtidos no ensaio in vitro foram realizadas por meio
de análise de variância (ANOVA) e testes post-hoc de Tukey, utilizando o GraphPad Prism 5
(GraphPad Software, San Diego, CA, USA Statistical). Os dados foram considerados
significativos quando *p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001 e ****p <0,0001 em relação ao
diluente dos extratos DMSO 0,1% e DMSO 0,2%.
47
5
PRODUTOS
1. Potencial leishmanicida de extratos pigmentados de microrganismos do bioma
Caatinga, submetido aos anais da Academia Brasileira de Ciências, que apresenta
QUALIS (2017-2020) A2 para a área de Medicina I.
5.1 PRODUTO 1
Leishmanial potential of pigmented extracts of microorganisms from the Caatinga
biome
Éder da Silva Rocha Santos1,4, Maria Nicolle Pereira da Silva5, Vannêssa Rodrigues Teles
Maia1, João Kaycke Sarmento da Silva2,4, Márcio Thomaz dos Santos Varjão2,4, Fábio Souza
Moura3,4, Emanuelly Beatriz Tenório Sampaio5, Amanda Evelyn da Silva4, Alysson Wagner
Fernandes Duarte1,5, Magna Suzana Alexandre Moreira2,3,4, Aline Cavalcanti de Queiroz1,3,4,5.
Affiliations:
Postgraduate Program in Medical Sciences, Faculty of Medicine – FAMED, Federal
University of Alagoas, Avenida Lourival Melo Mota, S/N, Campus A. C. Simões, 57072-900,
Cidade Universitária, Maceió, AL, Brazil.
1
2
Postgraduate Program in Health Sciences, Institute of Biological and Health Sciences - ICBS,
Federal University of Alagoas, Avenida Lourival Melo Mota, S/N, Campus A. C. Simões,
57072-900, Cidade Universitária, Maceió, AL, Brazil.
3
Postgraduate Program in Pharmaceutical Sciences, Institute of Pharmaceutical Sciences - ICF,
Federal University of Alagoas, Avenida Lourival Melo Mota, S/N, Campus A. C. Simões,
57072-900, Cidade Universitária, Maceió, AL, Brazil.
Pharmacology and Immunity Laboratory, Institute of Biological and Health Sciences – ICBS,
Federal University of Alagoas, Avenida Lourival Melo Mota, S/N, Campus A. C. Simões,
57072-900, Cidade Universitária, Maceió, AL, Brazil.
4
5
Microbiology, Immunology and Parasitology Laboratory, Medical Sciences and Nursing
Complex – CCME, Federal University of Alagoas, Av. Manoel Severino Barbosa, S/N, 57309005, Bom Sucesso, Arapiraca, AL, Brazil.
*Corresponding author: Aline Cavalcanti de Queiroz
E-mail address: aline.queiroz@arapiraca.ufal.br
Address: Microbiology, Immunology and Parasitology Laboratory, Medical and Nursing
Sciences Center, Federal University of Alagoas - Campus Arapiraca, Av. Manoel Severino
Barbosa - Bom Sucesso, Arapiraca - AL, 57309-005, Brazil.
48
EDER S. R. SANTOS: http://orcid.org/0009-0005-0333-407
MARIA N. P. SILVA: http://orcid.org/0000-0003-3573-9369
VANNÊSSA R. T. MAIA: http://orcid.org/0009-0009-7521-5253
JOÃO K. S. SILVA: http://orcid.org/ 0000-0002-5962-785
MÁRCIO T. S. VARJÃO: http://orcid.org/ 0000-0002-9916-1490
FÁBIO S. MOURA: http://orcid.org/0000-0002-7705-0159
EMANUELLY B. T. SAMPAIO: http://orcid.org/0000-0002-2174-5197
AMANDA EVELYN DA SILVA: http://orcid.org/ 0000-0002-5652-532X
ALYSSON W. F. DUARTE: http://orcid.org/ 0000-0001-9626-7524
MAGNA S. A. MOREIRA: http://orcid.org/0000-0002-9979-1994
ALINE C. QUEIROZ*: http://orcid.org/0000-0002-6362-272
ABSTRACT: As leishmaniasis is a neglected disease, with limited therapy and high toxicity,
there is a need to develop new forms of treatment for this disease. In this context,
microorganisms from the Caatinga, a typical Brazilian biome, represent an interesting source
of useful metabolites in the development of new drugs, as they are still little explored. Thus, in
this work we produce and pharmacologically evaluate extracts of microorganisms isolated from
the Caatinga. The extracts of intracellular pigments of lichen microorganisms from the Caatinga
biome were produced in specific culture media, the bacterial isolates were cultivated in Nutrient
Agar and the isolates of filamentous fungi in Sabouraud Dextrose Agar. Subsequently, it was
observed that most of the extracts tested were not cytotoxic for macrophages of the J774.A1
lineage, except for fungal extracts 4UVLFC2 and 4LCEM2, which showed cytotoxicity with
IC50 of 1.61 and 22.11 µg/mL, respectively. In addition, the bacterial extract 13UVLBC3 and
the fungal extracts 2LCL1, 4UVLFC2, and 4LCEM2 showed leishmanicidal activity against
the promastigotes of Leishmania chagasi and Leishmania amazonensis, with a maximum effect
greater than 80%. Thus, the data obtained so far show the great leishmanicidal potential of
extracts of microorganisms from the Caatinga, supporting the continuity of studies.
KEYWORDS: Caatinga, Leishmanial activity, Microbial extracts.
INTRODUCTION
Leishmaniasis is caused by protozoan parasites of the order Kinetoplastida, family
Trypanosomatidae, genus Leishmania and transmitted through the bite of insects of different
species of sandflies. They can produce alterations in the skin, mucous membranes, and
cartilage, characterizing the integumentary form of the disease. The parasites are obligatorily
intracellular, and mainly infect the macrophages of the skin and organs of the endothelial
reticulum such as the liver, spleen, bone marrow and lymph nodes, in their visceral form
(Oliveira et al. 2013, Carneiro, 2013).
In Brazil, leishmaniasis constitutes a serious public health problem, due to the high
number of cases registered annually, the wide geographic distribution and the complexity of its
control, which is inherent to the transmission cycles that involve several species of vectors,
etiological agents, and reservoirs (Brasil 2015). They are considered tropical diseases that
49
mainly affect people in situations of social vulnerability and are considered neglected diseases
according to the World Health Organization (Who 2019).
As these are neglected diseases, the clinical manifestations of cutaneous and visceral
lesions tend to worsen. Failure to treat it can increase the lethality rate due to impairment of
vital organs and possible secondary infections. In addition, current treatments are performed
with obsolete drugs and contribute to the infeasibility or abandonment by the patient, favouring
the progression of the disease (CDC 2020, Roatt et al. 2020, DNDI 2019).
The expansion of leishmaniasis is related to several factors, such as therapeutic failure
and high incidence of adverse effects with first-line drugs, high toxicity of second-line drugs,
emergence of parasite-resistant strains, almost exclusively parenteral treatment, with daily
injections, low adherence of patients to the treatment scheme and insufficient amount to treat
patients in endemic areas (Oliveira et al. 2011, DNDI 2019).
In this context, natural products, such as microorganisms from extreme environments,
can be potential sources of a wide variety of substances with biological activity, including
leishmanicidal ones. The bioprospecting of these products is a promising tool for the
advancement of biotechnology and the modernization of pharmacotherapy for infectious
diseases (Giudice 2016, Danilovich et al. 2018).
Thus, the microorganisms of the Caatinga biome can be sources of still unknown
compounds, in addition to living in poorly explored environments, making their isolation and
study of the pharmacological properties of their extracts and isolates an important strategy for
the discovery of substances. with different biotechnological and medically useful applications
(Mendes 2010; Liu et al. 2013).
Therefore, the present study was carried out with the objective of producing pigmented
extracts of the biomass of bacteria and fungi isolated from lichens of the Caatinga biome, as
50
well as evaluating their leishmanicidal properties against the promastigotes forms of L. (L.)
chagasi and L. (L.) amazonensis.
MATERIALS AND METHODS
Obtaining bacteria and filamentous fungi from the Caatinga
For this study, the bacteria resistant to UV-C and the filamentous fungi used were
provided by the Laboratory of Microbiology, Immunology and Parasitology (LABMIP), linked
to the Federal University of Alagoas, Arapiraca campus. The collection of lichens took place
on November 16, 2019 and was carried out in the Tocaia Reserve, located in a conservation
area, the Private Natural Heritage Reserve (RPPN), which is located between the coordinates
9º 22.944' South latitude and 37º 15.315' west longitude and average altitude of 250 meters
(Mascarenhas 2005), has been without anthropic exploitation for over 80 years and for this
reason is currently quite preserved, located in the municipality of Santana do Ipanema, State of
Alagoas.
The collected and isolated species of lichens were duly identified, as shown in Table
I. The isolates were placed in cryotubes with glycerol (20%) and submitted to an ultra-freezer
at -80ºC. In total, 5 bacterial isolates were evaluated, two of the same species and 3 fungal
isolates. Regarding bacterial isolates, the lichens used to obtain these isolates were collected
from the Tocaia Reserve (LC3, LC4, LC5 and LC8) belonging to the species Xanthoparmelia
plittii (Gyeln.) Hale, Peltula clavata (Kremp.) Wetmore, Dirinaria applanata (Fée) D. D.
Awasthi and Peltula euploca (Ach.) Poelt, respectively. Two filamentous fungi were of the
species Xanthoparmelia plittii (Gyeln.) Hale (LC2): the fungus 4LCEM2 was identified as
Fusarium sp., however, it was not possible to carry out the taxonomic identification of the
fungus 4UVLFC2. From lichen LC1, the isolated fungus 2LCL1 was identified as Penicillium
sp., however, it was not possible to identify the species of this lichen, as shown in Table II. All
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isolates showed photosensitivity; therefore, they were manipulated in a biological safety cabinet
under conditions minimum brightness.
Table I. Lichen identification of bacterial isolates.
BACTERIAL ISOLATE LICHENS
LC3
Xanthoparmelia plittii (Gyeln.) Hale
LC4
Peltula clavata (Kremp.) Wetmore
LC5
Dirinaria applanata (Fée) D.D. Awasthi
LC8
Peltula euploca (Ach.) Poelt
Source: The author 2023.
Table II. Lichen identification of fungal isolates and taxonomic identification.
LC1
FILAMENTOUS FUNGAL ISOLATE LICHENS
Não identificado
Penicillium sp.
LC2
Xanthoparmelia plittii (Gyeln.) Hale
-
LC2
Xanthoparmelia plittii (Gyeln.) Hale
Fusarium sp.
Source: The author 2023.
Biomass production of bacterial isolates
For the reactivation of bacterial isolates, Nutrient Agar (NA) culture medium was used.
After sterilization, the bacteria were incubated at 25°C for 7 days. Right after the incubation
period, the isolates 12UVLBC8, 2UVLLC4, 13UVLBC8, 2UVLBC5 and 13UVLBC3 were
cultivated in Petri dishes containing AN. The cultivation of bacterial isolates was based on the
method described by Silva et al (2019) with some modifications. The technique used was the
exhaustion streak. The plates were sealed with parafilm and incubated in an oven for 7 days at
25°C. After bacterial growth, 3 to 6 colonies with the same morphology were inoculated into 6
mL of saline solution (0.95%), vortexed at maximum speed to form a standardized suspension
in a UV-visible spectrophotometer of 0.9 and 1.0 (107 cell/mL). Then, 3 mL of the standardized
aliquot was transferred to an Erlenmeyer flask containing 150 mL of nutrient broth and stirred
in a Shaker incubator at 120 rpm for 7 days at 25°C. After this period, the samples were
transferred to falcon tubes and subjected to centrifugation at 3,500 rpm for 10 minutes. The
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formed bacterial biomass was washed with sterile saline solution. Finally, the biomasses were
frozen in a freezer until their subsequent extraction.
Extraction of bacterial intracellular pigments
Initially, 30 mL of ethyl acetate (ActOEt) were added to the bacterial biomass,
however, it was observed that this solvent did not produce the expected effect in the extraction,
so the solvent was replaced by methanol (MetOH), considering the same volume, however, the
extracted solutions were separated into distinct falcons. Then, the samples were stirred using a
vortex at maximum speed and subjected to an ultrasonic bath for 30 minutes to 1 hour to
optimize cell lysis. The samples were centrifuged for 10 minutes at 4,500 rpm repeatedly, until
the maximum depigmentation of the biomass. Supernatants with pigments extracted from
bacterial biomass were transferred to sterile falcons and duly identified. Sodium Sulphate
(Na2SO4) was added to each falcon with the extracted pigments, for the evaporation of water
residues. Soon after, the obtained solutions were rotary evaporated to evaporate the solvent and
concentrate the pigment. The contents obtained after this step were dried in a glass desiccator
under vacuum protected from light in a gas exhaust hood. The extracts were dried in a desiccator
coupled to a vacuum pump and, after weighing the difference in weight of the flasks before and
after drying, they were resuspended in dimethylsuffoxide (DMSO) at a final concentration of
100mg/mL and filtered through 0.22 µm filter membranes. µM. Next, the samples were stored
in an eppendorf tube and kept in a freezer (-20°C).
Cultivation of filamentous fungi
The 2LCL1, 4LCEM2 and 4UVLFC2 isolates were reactivated in Sabouraud Dextrose
Agar culture medium. After solidification of the culture medium, each Petri dish received a disc
of the fungus. Petri dishes were incubated at 30°C for 7 days for purity analysis.
53
Biomass production of fungal isolates
The Czapek Agar culture medium was made with 2% glucose as a supplement,
according to Oliveira (2013), with a small modification. After sterilizing the material and the
culture medium, a 20 mL glass pipette was used, with the aim of standardizing the volume in
the Petri dishes (90x15mm). Subsequently, the isolates that had been reactivated were
transferred to Petri dishes with the already solidified culture medium. In each plate, three discs
of the fungus were added, each with 6 mm in diameter, corresponding to the size of the
perforator used, spaced in such a way that they drew a triangle. The Petri dishes were incubated
in a bacteriological oven at a temperature of 30°C for 14 days.
Extraction of fungal secondary metabolites
After 14 days of growth of filamentous fungi and production of pigments, the plates
of biomass production were used for the extraction of metabolites, where each fungus was
removed from the plate and transferred to an Erlenmeyer with extraction solvent. For that, the
fungal mycelia with Agar were divided using a sterilized spatula and transferred to an
Erlenmeyer and soaked with 100 mL of ethyl acetate PA, followed by sealing with parafilm
and protected with aluminum foil to avoid photodegradation, then they were stored in
refrigeration for seven days for subsequent extraction of the ethyl acetate fraction.
Filtration, concentration, drying and resuspension of fungal extracts
After 7 days of extraction of the secondary metabolites in ethyl acetate, the samples
were submitted to filtration with the aid of Whatman filter paper, right after that the Erlenmeyer
flasks with the metabolites were properly sealed with parafilm and involved with aluminum
foil. Next, the samples were subjected to concentration in a rotary evaporator coupled to a
vacuum pump. Then, the already concentrated pigments were transferred to small, sterilized
bottles and placed in a freezer (-20ºC). The extracts were dried in a desiccator coupled to a
vacuum pump and after weighing the difference in weight of the flasks before and after drying,
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they were resuspended in dimethylsuffoxide (DMSO) at a final concentration of 50mg/mL and
filtered through 0.22 µm filter membranes. µM. Next, the samples were stored in an eppendorf
tube and kept in a freezer (-20°C).
Macrophage Cytotoxicity Assay
Macrophages of the J774.A1 strain were cultured in 96-well plates at a concentration
of 5x104 cells/well and incubated in an oven at 37 ºC with a humid atmosphere containing 5%
CO2. Then, the wells were washed to remove non-adherent cells and subsequently treated in
triplicate with 200 μL of extracts of 12UVLBC8, 2UVLLC4, 13UVLBC8, 2UVLBC5,
13UVLBC3, diluted in RPMI medium at concentrations of 100, 30, 10, 3, 1 and 0.3 µg/mL,
after incubation for 48 hours, the control wells were cells cultivated only with supplemented
culture medium or cells cultivated in the presence of the substances diluent (DMSO, Sigma).
Cell viability was determined by a colorimetric Methyltetrazolium (MTT) reduction assay
(Mosmann, 1983), reading the absorbances in a spectrophotometer at 550 nm. The cell viability
of the macrophages treated with the substances was compared with the death pattern obtained
in the control cultures. To calculate the Selectivity Index (SI), the ratio between CC50 and IC50
was used, as described by Ribeiro et. al (2014), through the following calculation:
IS=CC50/CI50.
Promastigotes viability assay
Promastigotes of L (L.) amazonensis and L (L.) chagasi were cultivated at a
concentration of 1x105 parasites/well and volume of 100 μL/well in a 96-well plate with
Schneider medium supplemented with 10% FBS, 2 mM L-glutamine and 2% human urine.
Different concentrations (0.3, 1, 3, 10, 30 and 100 μg/mL) of the nine pigmented extracts and
amphotericin B deoxycholate (Sigma-Aldrich) (standard drug) were added in triplicates to the
wells containing the promastigotes forms until obtaining of the final volume of 200 µL. The
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plate was incubated in a BOD oven at 27ºC for 48 hours. After this period, the parasites of L
(L.) amazonensis and L (L.) chagasi were homogenized and the number of parasites was
determined using a Neubauer chamber and optical microscopy at 400x magnification (Nikon
Eclipse Ci) (Tiuman et al. 2005).
Scanning Spectrophotometry
The pigments were scanned and quantified in a UV-Vis Spectrophotometer – 200 to
1000 - Series 2000, in the range of wavelengths from 200nm to 1000nm. The results were given
in absorbance units (AU), to evaluate the characteristics of the spectrum corresponding to the
constituents that make up the extract. 20 µL of (DMSO, sigma) was used as a control, and 20
µL of each sample at a temperature of 26ºC.
Statistical analysis
Statistical analysis of data obtained in vitro was performed using analysis of variance
(ANOVA) and Tukey's post-hoc tests, using GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, San
Diego, CA, USA statistics). Data were considered significant when *p<0.05, **p<0.01,
***p<0.001 and ****p < 0.0001 in relation to the diluent of the 0.1% and 0.2% DMSO extracts.
RESULTS AND DISCUSSION
The isolation of bacteria and fungi from the Caatinga, through cultivation techniques,
allowed the production of biomass and pigmented extracts with their secondary metabolites.
The identification of pigmented bacterial and fungal microorganisms is presented in Table III.
The use of two solvents, ethyl acetate (ActOEt) and methanol (MetOH), allowed the complete
extraction of pigments present in the bacteria's biomass. For the extraction of pigments in the
biomass of filamentous fungi, only ethyl acetate (ActOEt) was used as solvent. After drying,
the extracts showed the same colorimetric aspects of pigments extracted from bacterial and
fungal biomass.
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The extracts of bacteria isolated from lichens from Serra da Tocaia (13UVLBC3,
2UVLCC4, 12UVLBC5, 12UVLBC8 and 13UVLBC8) showed golden yellow, orange, red,
pink, and orange pigments, respectively. Fungal lichen extracts (2LCL1, 4LCEM2 and
4UVLFC2) showed light brown, dark yellow and dark brown pigments, respectively.
Tabela III. Bacteria and fungi isolated from lichens from the Caatinga biome.
Lichen
(Code)
Code of
Bacterial
Microorganisms
Species
Origin
Colony
color
Reserve
Tocaia
Golden
yellow
Reserve
Tocaia
Orange
Reserve
Tocaia
Red
Reserve
Tocaia
Pink
LC5
2UVLBC5
LC8
12UVLBC8
Xanthoparmelia
plittii (Gyeln.)
Hale
Peltula clavata
(Kremp.)
Wetmore
Dirinaria
applanata (Fée)
D. D. Awasthi
Peltula euploca
(Ach.) Poelt
13UVLBC8
Peltula euploca
(Ach.) Poelt
Reserve
Tocaia
Orange
LC8
Lichen
(Code)
Code of Fungal
Microorganisms
Species
Origin
LC1
2LCL1
Not identified
Reserve
Tocaia
Colony
color
Light
brown
LC2
4LCEM2
Reserve
Tocaia
Dark
yellow
LC2
4UVLFC2
Reserve
Tocaia
Dark
brown
LC3
LC4
13UVLBC3
2UVLLC4
Xanthoparmelia
plittii (Gyeln.)
Hale
Xanthoparmelia
plittii (Gyeln.)
Hale
Source: The author, 2023.
Organic solvents are known for their performance in the extraction of secondary
metabolites from various microorganisms, including bacteria isolated from extreme
environments and pigments. Methanol has been commonly used for this purpose. Accordingly,
from members belonging to the genera Flavobacterium, Chryseobacterium, Zobellia,
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Planococcus, Arthrobacter, Salinibacterium and Cryobacterium, isolated from different
substrates in the Fildes Peninsula in Ilha do Rei, Antártica, Vila et al. (2019) identified several
carotenoids, the from biomass lyophilization and methanol extraction.
UV-C resistant bacteria isolated from Antarctica had their biomass subjected to
lyophilization and were susceptible to extraction with the same solvent (Órdenes-Aenishanslins
et al. 2016). In addition, methanol was also used for the extraction, from Kocuria palustres
isolated from the Caatinga, of sarcinaxanthin, a carotenoid considered rare due to its carbon
skeleton, with remarkable antioxidant (76.53 ± 0.09%) and photoprotective (SPF = 9.36 ± 0.52)
of this isolate (Silva et al. 2021).
In recent tests (unpublished data), the antifungal action against Candida albicans was
observed in three pigment extracts of the isolates: 2LCL1, 4LCEM2 and 4UVLFC2, presenting
an inhibition halo: 7mm, 14mm and 10mm, respectively, demonstrating its antifungal action
for a future application in pharmaceuticals. These extracts were also selected to be evaluated
for their leishmanicidal activity in the present study, since fungi and Leishmania have ergosterol
in their plasmatic membrane.
Regarding antifungal activity, some studies have reported the antimicrobial activity of
fungal lichen substances, especially the greater sensitivity of Gram-positive bacteria, using
chloroform extracts and acetone extracts (Srivastava et al. 2013, Ramos et al. 2014, Sariözlü et
al. 2016, Kemegne et al. 2017, Moura et al. 2017). Antimicrobial activity tests with lichenized
fungal extracts performed with strains of Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae and
Mycobacterium phlei showed greater sensitivity, with inhibition halos ranging from 8 to 12 mm
(Vieira et al. 2019). Still regarding the antifungal activity, some studies have reported the
sensitivity of Trichophyton tonsurans, Microsporum gypseum and Epidermophyton floccosum
to lichen extracts from different species (Vieira et al. 2019).
58
Enzymes of the ergosterol biosynthetic pathway are important targets of several
classes of antifungals, since ergosterol is present in the membrane of these protozoa. Polyenes
such as amphotericin B act at the level of ergosterol by strongly binding to this molecule. This
effect damages the cell's plasma membrane, resulting in leakage of intracellular ions. Azoles
such as fluconazole, itraconazole or voriconazole inhibit a cytochrome P450 (Erg11p)
responsible for the 14α demethylation of lanosterol and, thus, block the biosynthesis of
ergosterol, resulting in changes in the fluidity and permeability of the fungal cytoplasmic
membrane (Kubiça 2016, Berto et al. 2018).
After producing the extracts, the cytotoxicity of the microbial extracts 12UVLBC8,
2UVLLC4 (MetOH), 13UVLBC8, 2UVLBC5, 13UVLBC3 and 2UVLLC4 (ActOEt) and
fungal extracts 2LCL1, 4LCEM2 and 4UVLFC2 were evaluated. In the present study, the MTT
assay was used to evaluate the effect of bacterial and fungal extracts on the viability of J774.A1
strain macrophages after 48h of treatment (Table IV). The control group was established as
cells cultured only in the presence of the vehicle used to dilute the extracts (0.1% DMSO for
bacterial pigmented extracts and 0.2% DMSO for fungal pigmented extracts).
Table IV. Effect of bacterial extracts and filamentous fungi of Caatinga lichens (100, 30, 10,
3, 1, and 0.3 µg/mL) and Amphotericin B (100 to 0.001 µM) on the viability of J774.A1
macrophages in the MTT assay.
Treatment
12UVLBC8 (MetOH)
2UVLLC4 (MetOH)
13UVLBC8 (MetOH)
2UVLBC5 (MetOH)
13UVLBC3 (ActOEt)
2UVLLC4 (ActOEt)
2LCL1 (ActOEt)
4UVLFC2 (ActOEt)
4LCEM2 (ActOEt)
Amphotericin B
a
IC50 µg/mL (CI 95%) a
>100
>100
>100
>100
>100
>100
44.24 (34.96 – 53.52)
45.24 (39.47 – 51.01)
38.08 (25.15 – 51.00)
3.11 (2.15 – 4.57)
Maximum Effect ± S.E.M.b
NC
NC
NC
NC
NC
NC
86.58 ± 0.15****
77.56 ± 1.14****
71.53 ± 3.50****
85.70 ± 0.14****
A 50% inhibitory concentration (95% confidence interval) of J774.A1, calculated using concentration-response
curves. bmean ± standard error of the mean of the maximum effect on the viability of J774.A1, in triplicate of a
representative experiment. Maximum effect values were significant when ****p <0.0001 compared to 0.1%
DMSO group 0.1% DMSO (bacterial extracts), 0.2% DMSO (fungal extracts). NC: non-cytotoxic effect
determined up to the maximum concentration tested, when compared to the group. ND: Not determined.
59
The MTT test (3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl tetrazoline bromide
determines the metabolic activity of cells through indirect quantification, through
spectrophotometry, promoted by mitochondrial enzymes. Thus, cultures that present
macrophages with viable mitochondria can reduce MTT to formazan crystals (Mosmann 1983).
The results obtained in cultures treated with extracts were compared with the results obtained
in cultures treated with DMSO 0.1% for bacterial extracts and with 0.2% DMSO for fungal
extracts.
According to the results obtained, cytotoxicity was not observed in bacterial extracts,
both in methanolic and ethyl acetate extracts, the six tested extracts showed IC50 greater than
100µg/ml, and did not show cytotoxic activity, when compared to the DMSO 0,1% group.
About pigmented fungal extracts, all three showed toxicities, with an IC50 below 50 µg/mL and
a maximum cytotoxic effect greater than 70%.
Amphotericin B deoxycholate (Sigma-Aldrich), a polyene antibiotic widely
administered as a second-line treatment for leishmaniasis, was chosen as the standard drug in
this trial and showed a maximum cytotoxicity of 85.70 ± 0.14% and an IC50 of 3.11 µg/ml.
The bacterial extracts were then tested for biological activity against the
promastigote’s forms of L. (L.) chagasi and L. (L.) amazonensis species, during 48 hours of
treatment, as shown in Table V.
60
Table V. Effect of bacterial and fungal extracts of Caatinga lichens (100, 30, 10, 3, 1 and 0.3
µg/mL) and Amphotericin B (100 to 0.001 µM) on the viability of Leishmania spp.
Treatment
12UVLBC8 (MetOH)
2UVLLC4 (MetOH)
13UVLBC8 (MetOH)
2UVLBC5 (MetOH)
13UVLBC3 (ActOEt)
2UVLLC4 (ActOEt)
2LCL1 (ActOEt)
4UVLFC2 (ActOEt)
4LCEM2 (ActOEt)
Amphotericin B
Promastigote of L. chagasi
CI50 (CI 95%)a
Maximum Effect ±
S.E.Mb
>100
NA
>100
NA
>100
NA
>100
NA
12.07 (4.69 –
81.46 ± 1.69****
35.46)
>100
28.57 ± 8.24**
13.55 (5.84 –
100 ± 0.00****
36.92)
10.24 (6.64 –
100 ± 0.00****
15.65)
9.65 (5.93 –
100 ± 0.00****
15.63)
0.02 (0.01 –
0.04)
100 ± 0.00****
Promastigote of L. amazonensis
CI50 (CI 95%)a
Maximum Effect
± S.E.Mb
>100
NA
>100
38.12 ± 1.34****
>100
NA
>100
NA
8.80 (5.96 100 ± 0.00****
12.92)
>100
26.23 ± 2.83
3.13 (2.18 –
100 ± 0.00****
4.46)
6.09 (3.00 –
100 ± 0.00****
12.44)
1.06 (0.37 –
100 ± 0.00****
2.55)
0.12 (0.08 –
0.18)
100 ± 0.00****
a
50% inhibitory concentration (µg/mL) of Leishmania promastigotes, calculated using concentration-response
curves. bmean ± standard error of the mean (%) of the maximum effect on Leishmania promastigote viability, in
triplicate of a representative experiment. Maximal effect values were significant when *p <0.05, **p <0.01, ***p
<0.001 and ****p < 0.0001, compared to DMSO 0.1% (bacterial extracts) and DMSO 0.2% group (fungal
extracts). NA: the extract is not active, when compared to the DMSO group.
Altogether, nine pigmented extracts obtained from bacteria and filamentous fungi
isolated from lichens from the Caatinga biome were tested to evaluate their anti-promastigote
activity. Of these, 13UVLBC3 stood out among the pigmented bacterial extracts, as it showed
activity for the promastigotes forms of both species tested L. (L.) chagasi, maximum effect of
81.46% and IC50 12.07 µg/mL; L. (L.) amazonensis maximum effect of 100% and IC50 8.80
µg/mL. Regarding activity on L. (L.) amazonensis, both 13UVLBC3 and the standard drug
amphotericin B, showed a maximum effect of 100%, with IC50 less than 10 µg/mL. However,
in L. (L.) chagasi, the activity of said extract was slightly lower than amphotericin B. The
extract was also less potent than amphotericin B against the Leishmania species tested. showed
no activity at any of the tested concentrations.
On the other hand, all fungal pigmented extracts were able to kill the promastigotes
forms of the two tested species: the 2LCL1 extracts had a maximum effect of 100% and an IC50
of 13.55 µg/mL against L. (L.) chagasi and a maximum effect of 100% and IC50 of 3.13 µg/ml)
61
against L. (L.) amazonensis, 4UVLFC2 100% maximum effect and IC50 of 10.24 µg/ml against
L. (L.) chagasi and 100% maximum effect and IC50 of 6.09 µg/mL against L. (L.) amazonensis
and 4LCEM2 100% maximum effect and IC50 of 9.65 µg/mL against L. (L.) chagasi and 100%
maximum effect and IC50 of 1.06 µg/ml against L. (L.) amazonensis. The standard drug
amphotericin B inhibited, up to the maximum concentration tested, 100% of the viability of
both Leishmania species tested, being more potent than the fungal extracts. However, it is
noteworthy that the fungal extracts showed a pharmacological effect like this standard drug.
Gamboa-Angulo et al. (2012) tested fungal extracts of the genus Fusarium sp. against
two strains (GS and PC) of Leishmania mexicana promastigotes, from fungal samples obtained
from the culture collection of the Biotechnology Unit and Scientific Research Center of
Yucatan, Mexico. Fusarium sp. TA50 and Fusarium sp. TA54, inhibited the target strains
against both, however, the isolate Fusarium sp. TA54 demonstrated remarkable inhibition with
an IC50 of 14.23 μg/mL and IC100 of 50 μg/mL against the GS strain of L. mexicana and IC50 =
22.16 μg/mL and IC100 of 50 μg/mL against the PC strain of L. mexican
Son et al. (2008) demonstrated that Fusarium moniliforme, which depending on the
conditions and the specificity of the strain, can produce a wide spectrum of bioactive
metabolites (Brückner et al., 1989), produces bikaverin, which is an effective quinine in the
control of Leishmania brasiliensis.
In another study, Campos et al. (2015) demonstrated that isolates of Fusarium spp.,
collected from stems and bark of Caesalpinia echinata, showed leishmanicidal activity (IC50 =
1.86 μM) against promastigotes of Leishmania braziliensis (Nascimento et al. 2012), attributed
to beauvericin, which is a mycotoxin produced by many fungi, including Fusarium spp. (Wang
& Xu 2012).
In the present study, the fungal extract 4LCEM2 was identified as belonging to the
genus Fusarium sp., as shown in Table II. This extract showed leishmanicidal activity against
62
the promastigote’s forms of L (L.) chagasi and L (L.) amazonensis, shown in Table V. The
result found was the best among all extracts, showing greater sensitivity against the strains
tested, making it a promising drug candidate.
In recent studies, Ogaki et al. (2020) identified several species of fungi of the genus
Penicillium sp., the genus to which the 2LCL1 extract belongs, capable of producing bioactive
metabolites from samples collected from different substrates on the Antarctic continent, among
them, Penicillium allii-sativi, Penicillium chrysogenum and Penicillium solitum, originating
from marine sediments of different depths, which showed leishmanicidal activity against L.
amazonensis. The 4UVLFC2 extract was the only one that did not have its taxonomic
identification defined.
Considering the cytotoxic effect for macrophages and promastigotes of the two species
of Leishmania tested on treatment with bacterial and fungal extracts, the calculation of the
selectivity index (SI) of the extracts was performed (Table VI). This index measures the ratio
between the cytotoxicity of the extract for the macrophage and its leishmanicidal activity.
Table VI. Selectivity Index (SI) of bacterial extracts (12UVLBC8, 2UVLLC4 (MetOH),
13UVLBC8, 2UVLBC5, 13UVLBC3 and 2UVLLC4 (EtOAc)) and fungal extracts (2LCL1,
4LCEM2 and 4UVLFC2).
Treatment
12UVLBC8 (MetOH)
2UVLLC4 (MetOH)
13UVLBC8 (MetOH)
2UVLBC5 (MetOH)
13UVLBC3 (ActOEt)
2UVLLC4 (ActOEt)
2LCL1 (ActOEt)
4UVLFC2 (ActOEt)
4LCEM2 (ActOEt)
Amphotericin B
IS L. (L.) chagasi
ND
ND
ND
ND
>8.29
ND
3.26
4.42
3.95
155.5
IS L. (L.) amazonensis
ND
ND
ND
ND
>11.35
ND
14.13
7.42
35.62
25.92
SI: Selectivity Index = CC50 (macrophages) / IC50 (Leishmania spp.). (-): Substance without activity above 50% or
with CC50 less than IC50. ND = Not determined.
SI calculation showed that 13UVLBC3, 2LCL1 and 4LCEM2 extracts were more
selective for promastigotes L. (L.) amazonensis when compared to macrophages, as they
63
presented SI greater than 10. Moreover, amphotericin B was more selective for both L. (L.)
chagasi and L. (L.) amazonensis. In this sense, the mentioned extracts present a more favorable
profile for the development of new leishmanicidal prototypes. Furthermore, compounds
isolated from these extracts, if tested separately in the future, may have a pharmacological
activity profile superior to that of the extracts.
The active extracts were submitted to the scanning spectrophotometry technique, to
verify their absorbance peaks, as can be seen in Figure 1.
Figure 1 – UV-Vis* scanning spectrophotometry of bacterial and fungal extracts from the
Caatinga that were active against promastigotes of L. (L.) chagasi and L. (L.) amazonensis.
1a
1b
1c
1d
*Absorption spectra obtained for the pigmented bacterial extract (13UVLBC3) and for the
pigmented fungal extracts (2LCL1, 4UVLFC2 and 4LCEM2), in the wavelength range from
200nm to 1000nm, containing 20 µL of extract.
Regarding the results obtained, the bacterial extract 13UVLBC3 (ActOEt), which
presented a yellow-gold color, had an absorbance peak that varied between 400 and 500 nm,
which may be indicative of the presence of carotenoids in its composition. Solieve et al. (2011)
64
reported that as a characteristic of the bioactive compounds of bacteria, yellow pigments have
antiviral, antitumor, antiprotozoal, antioxidant, antibacterial activity, among other activities.
According to Venil et al. (2020), the prospection of bacterial pigments in the health
area has stimulated attention to the search for alternative natural dyes, including for
pharmaceutical use, mainly because they are ecological and non-toxic (Chiba et al. 2006).
Although the production of pigments depends on the microorganism itself and the extraction
conditions (Usman et al. 2017), bacterial pigments are considered safe and can benefit human
health, as they have several activities such as antioxidant, anticarcinogenic, anti-inflammatory,
antiobesity, antibiotic and antiparasitic (Malik et al. 2012, Fernandez-Orozco et al. 2011, Kim
et al. 2011).
Bacteria produce different shades of color depending on the taxonomic group they
belong to, such as red, red-yellow, yellow, green, blue and purple. The bacterial pigment can
be identified with the aid of the Munsell color system (Venil 2020). Among the bacterial
pigments, astaxanthin, canthaxanthin, carotenoids, melanins, garnet, indigoidin, flavins and
quinones stand out. of food and beautification (Fernandez-Orozco et al. 2011, Kim et al. 2011,
Sathasivam and Ki 2018). In addition, carotenoids comprise a family of natural compounds,
among which bacteria are present, and normally have two to three absorption bands located in
the blue-violet region of the spectrum. Carotenes have absorption peaks (nm) ranging from 420
to 495, while xanthophylls have nm from 425 to 524 (Govindje 1969), depending on the type
of carotenoid and dilution.
In relation to the three fungal extracts, they also showed absorbance peaks typical of
carotenoids (450nm). According to Lopes (2011), filamentous fungi have secondary
metabolites of great pharmacological interest. Several filamentous fungi with biotechnological
applications are found in the Caatinga, some genera have been cataloged as Acremonium sp.,
Aspergillus sp., Chrysosporium sp., Cladosporium sp., Fusarium sp., Monilia sitophila,
65
Penicilium sp., Scedosporium sp., Scopulariopsis sp. and Sepedonium sp., among others
(Santos 2012).
The results obtained in this study prove the importance of bioprospecting in this
uniquely Brazilian biome. Although it is still little studied, it is known that the Caatinga is rich
in biodiversity, with high therapeutic potential, and has microorganisms that produce natural
bioactive compounds, especially fungi. Studies suggest that fungi have been the major
producers of active secondary metabolites and are used as antibiotics, antiparasitics, antitumors,
antifungals, among other compounds, including compounds produced by endophytic
microorganisms, such as alkaloids and terpenes, which protect plants from arthropod attacks
(Busby et al. 2016, Macheleidt et al. 2016; Abraham et al. 2016; Shymanovich et al. 2019,
Zhang et al. 2019).
The data obtained so far have shown the need to continue the study of the
leishmanicidal activity of these active microbial extracts, with the performance of more indepth tests to understand the mechanism of leishmanicidal action, as well as the effects of these
natural extracts on macrophages infected with Leishmania spp. regarding the production of
nitric oxide, in addition to carrying out tests to evaluate the anti-amastigote activity and
chemically characterizing the extracts to identify and pharmacologically test their bioactive
metabolites.
CONCLUSION
Of the six bacterial extracts and three fungal extracts evaluated against promastigotes
of L. (L.) chagasi and L. (L.) amazonensis, the ethyl acetate extract of the bacteria 13UVLBC3
was the only bioactive bacterial extract, not showing cytotoxicity to the host cell
(macrophages). Regarding fungal extracts, all of them showed leishmanicidal activity, with
emphasis on the ethyl acetate extract of the fungus 4LCEM2, which showed the best
pharmacological profile, with a leishmanicidal effect of 100% and IC50 lower than 10ug/mL,
66
against the two tested species. The scanning spectrophotometry analysis of the active extracts
showed that they had absorbance peaks that suggest the presence of carotenoids in their
composition. The fungus that showed the best leishmanicidal activity belongs to the genus
Fusarium sp. From this identification, and through the results of the antifungal action
(unpublished data) against Candida albicans, a hypothesis to be considered is the possibility
that pigmented fungal extracts have ergosterol inhibitors among their secondary metabolites.
Thus, it becomes essential to consider the biotechnological potential of the Caatinga.
The microorganisms that are found only in this biome may have the potential to produce
secondary bioactive metabolites that can be used in medicine, in the production of new drugs,
especially capable of controlling diseases considered neglected, such as leishmaniasis.
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72
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Destaca-se que foi possível extrair metabólitos pigmentados de microrganismos
isolados da Caatinga. Além disto, os extratos pigmentados de bactérias 12UVLBC8,
2UVLLC4, 13UVLBC8, 2UVLBC5, 13UVLBC3 não induziram efeito deletério para
macrófagos da linhagem J774.A1, mostrando-se menos citotóxico que o fármaco-padrão
anfotericina B. Já os extratos fúngicos 2LCL1, 4LCEM2 e 4UVLFC2 apresentaram atividade
citotóxica para os macrófagos quando comparados ao DMSO 0,2%.
A avaliação da atividade leishmanicida foi conduzida contra as formas promastigotas
das duas espécies de parasitos, Leishmania amazonensis e Leishmania chagasi. O extrato
bacteriano de acetato de etila 13UVLBC3 apresentou atividade contra ambas as espécies
testadas, no entanto, foi menos potente que a anfotericina B. Com relação aos extratos fúngicos,
os três apresentaram atividade leishmanicida, apresentando efeito farmacológico similar ao
fármaco padrão, porém, o extrato 4LCEM2, pertencente ao gênero Fusarium sp., foi o que
apresentou maior sensibilidade contra as cepas testadas, tornando-o um candidato a fármaco
promissor.
Os resultados obtidos evidenciaram a extrema necessidade de explorar o potencial
biotecnológico da Caatinga. Os compostos bioativos encontrados em microrganismos deste
bioma podem ser fundamentais para o desenvolvimento de novos fármacos contra doenças
negligenciadas como as leishmanioses, logo, a partir deste trabalho, vê-se a possibilidade de
produzir um fármaco com microrganismos isolados de um bioma exclusivamente brasileiro,
que seja menos tóxico e mais eficiente.
73
7 LIMITAÇÕES E PERSPECTIVAS
❖ Informações limitadas sobre extratos de microrganismos da Caatinga com atividade
antiparasitária.
❖ Como perspectiva, estes extratos precisam ser testados contra as formas amastigotas das
duas espécies de Leishmania testadas. É necessário também, realizar a caracterização
química deles para
farmacologicamente.
identificar os
seus
metabólitos
bioativos e testá-los
74
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